Studija o terapeutskim efektima i mehanizmima ekstrakta Cistanche Deserticola na sarkopeniju izazvanu deksametazonom kod miševa

sažetak:Ova studija je istraživalaterapeutski efekat ekstrakta Cistanche deserticola (CdE)o sarkopeniji izazvanoj deksametazonom (Dex) kod miševa i mogućem mehanizmu djelovanja. Prvo, farmakodinamičke komponente i važni ciljevi Cistanchea proučavani su mrežnom farmakologijom, a putevi su obogaćeni da se predvidi mehanizam djelovanja CdE. U eksperimentima na životinjama, miševi od 50 KM su nasumično podijeljeni u 5 grupa (kontrolna grupa, grupa Dex modela, grupa sa visokom dozom CdE, grupa sa srednjom dozom CdE i grupa sa niskom dozom CdE). Osim kontrolne grupe, druge grupe su ubrizgane supkutano kako bi se izazvala sarkopenija nakon 42 dana, a tri grupe koje su tretirale su dobile različite doze CdE oralno u isto vrijeme. Tokom eksperimenta redovno su testirani težina životinje, kapacitet vježbanja i sastav tijela. Nakon što su životinje žrtvovane, izračunat je mišićni koeficijent stražnjih udova, te su izvršeni histološki i srodni testovi ekspresije gena. Rezultati mrežne farmakologije pokazuju da CdE može liječiti sarkopeniju regulacijom signalnih puteva povezanih sa IGF-1. Rezultati eksperimenata na životinjama pokazuju da CdE značajno poništava smanjenje sadržaja nemasnog mesa i mišićnog koeficijenta uzrokovano Dex-om, poboljšava kapacitet vježbanja, smanjuje sadržaj masti, poboljšava histološki status mišića, povećava IGF-1, MyoD i MyoG i smanjuje ekspresiju Atrogin-1 i MuRF-1. CdE ima terapeutski efekat na atrofiju mišića izazvanu Dexom i može poboljšati histološku morfologiju mišića, a njegov mehanizam djelovanja može biti aktivacija IGF-1 signalnog puta.

Ključne riječi: Ekstrakt cistanche deserticola; deksametazon; sarkopenija; mrežna farmakologija; IGF-1 put

 

 

korist od ehinakozida

 

1. Materijali i metode

1.1 Reagensi

U ovoj studiji korišteni su sljedeći reagensi:

Injekcija deksametazon natrijum fosfata(Serija br.. 040191147) – Shanxi Ruicheng Kelong Veterinary Medicine Co., Ltd.

Normalan fiziološki rastvor(Serija br. L220092407) – Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.

Anhidrovani etanol, ksilen, paraformaldehid, iglutaraldehid– Kineska nacionalna farmaceutska grupa

Hlorovodonična kiselina(CAS: 7647-01-0) – Chengdu Kelon Chemicals Co., Ltd.

Rastvor za bojenje hematoksilinom– Wuhan Servicebio Biological Technology Co., Ltd.

Rastvor boje eozina– Hefei Bomei Biological Technology Co., Ltd.

812 komplet za ugradnju epoksidne smole, uranil acetat– Kompanija SPI

Molpure® komplet za ekstrakciju RNA, PrimeScript RT Kit, TB Green™ Premix Ex Taq™ II– YEASEN Biotechnology and Takara Biomedical Technology Co., Ltd.

3 aktivna sastojka cistanchea

 

1.2 Instrumenti

Glavna korišćena oprema:

NK-10 analogni push-pull mjerač– Wenzhou Weidu Instrument Co., Ltd.

QMR06-060H analizator tjelesne kompozicije– Niumag Corporation

BA 210 digitalni trinokularni mikroskop– Motic Group

JEM-1400 FLASH transmisioni elektronski mikroskop– JEOL, Japan

QuantStudio™ 3 PCR sistem u realnom vremenu– ThermoFisher Scientific

 

1.3 Mrežna farmakološka analiza

Istražiti aktivne spojeve i potencijalne mehanizmeCistanche tubulosau lečenjusarkopenija, a mrežna farmakologijakorišćen je pristup:

Aktivna jedinjenjaofCistanche tubulosasu pregledani pomoćuFarmakološka baza podataka sistema tradicionalne kineske medicine (TCMSP), sa pragovima od:

Oralna bioraspoloživost (OB) veća ili jednaka 30%

Sličnost na drogu (DL) Veća ili jednaka 0,18

Dodatni spoj iciljne informacijeje preuzeto sa:

PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)

SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)

Geni za sarkopeniju povezani sa bolešćusu dobijeni od:

DisGeNET(http://www.disgenet.org)

GeneCards(https://www.genecards.org)

Analiza protein-protein interakcije (PPI).izvršeno je putemSTRING baza podataka(https://string-db.org).

A mreža interakcija spoj–cilja–genje izgrađen pomoćuCytoscape 3.2.1.

Funkcionalno obogaćivanjeje sprovedeno korišćenjem:

DAVID(https://david.ncifcrf.gov) zaOntologija gena (GO)

KEGG(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html) za analizu putanje

Rezultati su vizualizirani putemBioinformatički online alat(https://www.bioinformatics.com.cn/)

cistanche tubulosa

1.4 PripremaCistanche tubulosaEkstrakt (CdE)

TheCistanche tubulosaekstrakt je pripremljen na sledeći način:

Kriške sirovog bilja (serija br. Y221217) su kupljene odSichuan TCM Decoction Pieces Co., Ltd., a autentičnost je potvrdio prof. Yang Wenyu sa Univerziteta Xihua.

1 kg sušenogCistanche tubulosaje usitnjen i propušten kroz a40-mesh sito.

A Odnos materijala i tečnosti 1:20je korišten sa50% rastvor etanola i vode.

Smjesa je bilanamakati 30 min, praćenoultrazvučna ekstrakcijaat55 stepeni, 250 W, za40 min.

Ekstrakti su bilicentrifugiran, filtriran i koncentriran pod sniženim pritiskomna 60 stepeni do guste paste (gustine 1,2) pomoću rotacionog isparivača.

Koncentrovani ekstrakt je biosušeno zamrzavanjem pod vakuumom, donoseći finaleefikasnost ekstrakcije od 40%.

 

1.5 Dizajn eksperimenta na životinjama

Ukupno50 SPF-grade mužjaci KM miševa, star 6 sedmica i težak(22 ± 2) g, korišteni su u ovoj studiji (licenca za životinje br.SCXK [Chuan] 2023-030). Svi postupci na životinjama su slijediliPravilnik o upravljanju laboratorijskim životinjamaizdalo Ministarstvo nauke i tehnologije Narodne Republike Kine i biliodobren od strane Komiteta za etiku životinja Univerziteta Xihua(Br. odobrenja: XH-2023-02-01).

Uslovi stanovanja:Temperatura (26 ± 1 stepen), vlažnost (50 ± 10%), 12 h ciklus svjetlo/mrak, slobodan pristup hrani i vodi.

Nakon 7 dana aklimatizacije, miševi su bilinasumično raspoređeni u 5 grupana osnovu telesne težine.

Svakodnevno se bilježila tjelesna težina, a praćena su i opšta zdravstvena stanja poput ponašanja, stanja krzna i unosa hrane.

Grupe tretmana i dozesu detaljno opisani uTabela 1.

Ondana 40–42, testovi motoričke funkcije(snaga hvata i plivanje).

Ondan 43, nakon 12 h gladovanja, zabilježena je tjelesna težina i sastav tijela. Miševi su zatim anestezirani etrom i žrtvovani. Bilateralni skeletni mišići stražnjih ekstremiteta brzo su secirani i izvagani.

Thelijevog gastrocnemiusaje izrezan uzdužno i pričvršćen3% glutaraldehidai4% paraformaldehida, odnosno.

Thedesni gastrocnemiusje zamrznut na -80 stepeni zaqPCR analiza.

SEO ključne riječi:životinjski model sarkopenije, KM miševi, eksperiment atrofije mišića, procjena mišićne funkcije, etičko istraživanje na životinjama

dobrobiti akteozida

1.6 Mjerenje sastava tijela i mišićnog indeksa

Tjelesna težinaje sniman svakodnevno tokom eksperimenta.

Prije žrtvovanja,sastav tijela(masa i masna masa).dvaput, i theprosječna vrijednostje snimljen.

nakon žrtvovanja,skeletni mišić zadnjeg ekstremitetabila izvagana.

Theindeks mišićne maseizračunato je pomoćuCuadros formula [11]:

Mišićni indeks (%)=Mišićna masa / tjelesna težina × 100
(jednačina 1)

SEO ključne riječi:nemasna tjelesna masa kod miševa, izračunavanje mišićnog indeksa, analizator tjelesne kompozicije, biomarkeri sarkopenije

 

1.7 Testovi funkcije motora

Za procjenumišićna funkcija, između 40. i 42. dana su obavljeni sljedeći testovi:

Test plivanja:

Svaki miš je bioizvagao, i aopterećenje (5% tjelesne težine u olovnoj foliji)je fiksiran za distalnu trećinu repa.

Miševi su stavljeni u aposuda sa vodom od 25 stepeni, na dubini većoj ili jednakoj 30 cm.

Vrijeme za kupanjeje zabilježeno od ulaska sve dok miš više nije mogao plutati i počeo tonuti.

Svaki miš je testiran jednom dnevno za3 uzastopna dana, i theprosjekje uzeto kao konačni rezultat.

Test čvrstoće prianjanja:

Izvodi se pomoću aručni mjerni mjerač.

Svaki miš je testiranpet puta, sa a150 sekundi odmoraizmeđu testova.

Thekoeficijent čvrstoće prianjanjaizračunato je za normalizaciju tjelesne težine:

Koeficijent čvrstoće prianjanja=Sila hvatanja / tjelesna težina (N/kg)
(jednačina 2)

SEO ključne riječi:test izdržljivosti plivanja, snaga hvatanja kod glodara, metrika performansi mišića, model miša sa sarkopenijom

 

1.8 Histološka analiza

Za procjenumorfološke promjene u mišićnom tkivunakon tretmana saCistanche tubulosaekstrakt (CdE):

Bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E).izvedeno je na tkivu fiksiranom u4% paraformaldehida.

Sekcije su posmatrane pod asvetlosni mikroskop, ipovršina poprečnog presjeka mišićnih vlakanaanaliziran je korištenjemImageJsoftver.

Zaultrastrukturna analiza, mišići fiksirani3% glutaraldehidasu naknadno fiksirani1% osmijum tetroksid, dehidrirano u acetonu i ugrađeno uEp812 smola.

Polutanke sekcijesu umrljane satoluidin plavoza pozicioniranje.

Ultratanke sekcijesu umrljane sauranil acetat i olovni citrat, i posmatrano sa aJEM-1400FLASH transmisioni elektronski mikroskop.

Širina mišićnog vlaknaje izmjeren pomoću ImageJ.

SEO ključne riječi:histologija skeletnih mišića, HE protokol bojenja, elektronska mikroskopija u istraživanju mišića, analiza morfologije mišićnih vlakana

lista beneficija cistanche

1.9 Analiza genske ekspresije

Da istražitemolekularni mehanizmiCdE u sarkopeniji:

Smrznuto mišićno tkivobili su mehanički poremećeni pod tečnim azotom.

Ukupna RNK je ekstrahirana pomoćuTRIpure Reagentprema uputama proizvođača.

cDNA je sintetizovana sa akomplet za reverznu transkripciju, iqPCRje izvedena pomoću aThermo Scientific PikoRealsistem.

GAPDHje korišten kao interni referentni gen.

Prajmer sekvence zageni vezani za mišićesu navedeni uTabela 2.

SEO ključne riječi:qPCR za gene atrofije mišića, referentni gen GAPDH, ekstrakcija RNK iz mišića, ekspresija gena u sarkopeniji

 

1.10 Statistička analiza

Eksperimentalni podaci analizirani su korištenjemjednosmjerna ANOVA, praćenoDunnettov test višestrukog poređenja.

A P-vrijednost < 0,05smatralo se statistički značajnom.

Sve statističke analize izvršene su korištenjemSPSS 23.0.

Histomorfometrijski podacianalizirani su korištenjemImageJsoftver.

SEO ključne riječi:statistička analiza u farmakološkim studijama, SPSS u biomedicinskim istraživanjima, ANOVA u studijama na životinjama, ImageJ analiza mišića