Studija o neuroendokrino-imunoj funkciji Cistanche Deserticola i njenih proizvoda za kuhanje rižinog vina u modelu štakora izazvanog glukokortikoidima-Ⅱ

3.2.4. Imunohistohemija

Neuronsku apoptozu kontrolišu mnogi apoptotički i antiapoptotički geni, uglavnom gen Bax koji promoviše apoptozu i antiapoptotički geni iz porodice gena Bcl-2. Bcl-2 je lokaliziran u reaktivnim organelama koje proizvode kisik kao što su mitohondrije, endoplazmatski retikulum i nuklearne membrane. Bcl-2 ima mali uticaj na slobodne radikale kiseonika, ali možesprečavaju oksidativna oštećenja ćelija. Bax se prenosi iz citoplazme do mitohondrijalne membrane, mijenja strukturu mitohondrijalne membrane i potiče oslobađanje citokroma c i indukciju apoptoze.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Došlo je do ekspresije u citoplazmi nadbubrežne žlijezde Bax i Bcl{0}} proteina. Bojenje je pokazalo sve žute čestice. U poređenju sa BC grupom, prosječna optička gustina Bax proteina u MC grupi se značajno povećala (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the average optical density in the CD-LD and WCD-LD groups decreased significantly (P < 0.01) (Figure 5(a)).

Slika 5(b) pokazuje da je u poređenju sa onom iz BC grupe, prosječna optička gustina Bcl-2 proteina u MC grupi značajno smanjena (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and CD-HD groups increased significantly (P < 0.01), while those of the WCD-MD and CD-MD groups increased (P < 0.05).

Protein kaspaza-3 lokalizovan je uglavnom u citoplazmi u svom izvornom obliku u normalnim tkivima i ima nisku ekspresiju. Pozitivni signali su blijedožuti ili smeđkastožuti. U poređenju sa BC grupom, ekspresija kaspaze-3 u MC grupi je značajno povećana (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the expression of caspase-3 in the WCD-HD and WCD-MD groups increased (P < 0.05) (Figure 5(c)).

U normalnim tkivima, ekspresija Fas gena je smanjena, a pozitivan signal za in situ hibridizaciju bio je smeđkasto žuti. Kao što je prikazano na slici 5(d), u poređenju sa BC grupom, prosječna optička gustina Fas proteina u MC grupi se povećala (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and WCD-LD groups improved (P < 0.05) (Figure 5(d)).

FasL protein se nalazi uglavnom u ćelijskoj membrani ili citoplazmi, a njegovi pozitivni signali su smeđi. U poređenju sa BC grupom, prosječna optička gustina FasL gena u MC grupi se značajno povećala (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density of the FasL gene in the WCD-HD, WCD-MD, CDHD, and CD-MD groups increased significantly (P < 0.01) (Figure 5(e)).

Rezultati su pokazali da CD i WCD moguinduciraju apoptozu u inflamatornim stanicamai smanjuju oštećenje nadbubrežne žlijezde promicanjem ekspresije FasL proteina i vezivanja za Fas protein, aktiviranjem proteina kaspaze{0}} i pokretanjem kaskade kaspaze. Učinak WCD-HD grupe bio je najbolji.

3.3. Određivanje imunološke funkcije

3.3.1. Indeks imunoloških organa

U poređenju sa onima iz BC grupe, koeficijent timusa i indeks slezene u MC grupi su značajno smanjeni (P< 0.01). Compared to the MC group, the WCD-MD group had the greatest difference (P < 0.05). The thymus coefficient was almost back to the normal level. For the spleen index, the WCDMD, WCD-LD, and CD-MD groups showed significant differences compared with that of the MC group (P < 0.01) (see Figure 6). Therefore, WCD and CD treatment could protect the immune organs, and the effects of WCD were better.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3.2. Detekcija podskupina T limfocita u perifernoj krvi

Procenat CD4+ ćelija u gornjem lijevom kvadrantu i CD8+ ćelija u desnom donjem kvadrantu u BC i svakoj grupi lijekova bio je veći od onog u MC grupi. U poređenju sa BC grupom, omjer CD4+ThCD8+ značajno se smanjio u MC grupi (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the ratio of CD4+ThCD8+ increased significantly in the PC group, the WCD group, and the CD-HD group (P < 0.01) (Figure 7).

3.3.3. Određivanje nivoa IL-10, IL-6, IL-2, TNF-Α i IFN-C u serumu

Slika 8 pokazuje da je u poređenju sa BC grupom nivo IL-6, TNF- i IFN-c značajno povećan (P< 0.01). The level of IL-10 and IL-2 decreased in the MC group. Compared to that of the MC group, the level of IL-6, TNF-α, and IFN-c decreased and IL-10 and IL-2 increased in serum in each of the drug groups. The effect of WCD was better than the effect of CD, especially in the WCD-MD group, in which the effect was close to that of the PC group.

3.3.4. Rezultati eksperimenta posmatranja mikroskopom limfnog tkiva

Slika 9 pokazuje da je u BC grupi bio prisutan veliki broj limfocita. Limfociti i retikulociti su labavo raspoređeni u centru sa raštrkanim okruglim ili ovalnim timocitima. Nije bilo nekroze, infiltracije upalnih ćelija, niti abnormalnih promjena.

Grupa MC pokazala je veliku količinu limfoidnog nekroznog tkiva, sa poremećenim rasporedom limfocita i retikulocita u centru. Nestali su okrugli ili ovalni timociti, evidentna je masivna degeneracija ili nekroza stanica, a došlo je do infiltracije upalnih stanica s abnormalnim patološkim promjenama.

U CD grupama morfološke karakteristike limfocita su se vratile na normalu, a raspored centralnih limfocita i retikulocita je bio skoro normalan. Okrugli ili ovalni timociti su se oporavili, ali je ostao mali broj degenerativnih ili nekrotičnih limfocita i infiltrirajućih upalnih stanica.

U WCD grupama i PC grupi bolje su popravljene morfološke karakteristike limfocita. Limfociti i retikulociti u centru su bili dobro poređani, okrugli ili ovalni timociti su bili skoro normalni, ali je ostao mali broj infiltrirajućih i degenerativnih limfocita.

3.4. Ekspresija gena CaM proteina

RQ vrijednost (CaM mRNA -aktin mRNA) je smatrana za ispitivanje ekspresije CaM mRNA. RQ BC grupe bio je 1. Ekspresija CaM mRNA u hipotalamusu u MC grupi značajno se povećala (P< 0.01), while the value decreased in the WCD-HD, WCD-MD, WCDLD, and CD-HD groups (P < 0.05) (Figure 10). The expression of CaM mRNA in the hypophysis in the MC group was lower than that in the BC group (P < 0.01). The expression in the WCD-HD, WCD-MD, WCD-LD, CD-HD, and CD-LD groups increased (P < 0.05), and the effect in the WCD groups was better than the effect in the CD groups.

4. Diskusija

Kineska farmakopeja [2] bilježi da se CD i WCD mogu koristiti u klinici kao glavni tipovi komada za dekoktiranje. Nakon što se popari s rižinim vinom,efekti protiv starenja i toniziranja bubrega-jangsu poboljšani. Putem UPLC-QqQ-MS detektovali smo kvantitativne promjene u bazi hemijskog materijala tokom procesa parenja pirinčanog vina. Iridoidni glikozidi su bili nestabilni, a sadržaj ovih glikozida se smanjio, pa čak i postao neotkriven. Promjenio se i sadržaj feniletanol glikozida, što bi moglo izazvati promjene u farmakodinamici i kliničkom efektu.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Klasični model deficijencije bubrega-janga repliciran je supkutanom injekcijom kortikosterona [19]. Predoziranje kortikosteronom moglo bi inhibirati tajnu CRH u hipotalamusu. U međuvremenu, tajna ACTH je takođe bila inhibirana. Smanjen je nivo hormona kore nadbubrežne žlijezde, a time i funkcija HPA ose. Hipofunkcija HPA ose je uobičajena karakteristika nedostatka bubrega-jang [20]. Tada pacovi pokazuju fenomen "iscrpljenja" i simptomi su u skladu sa simptomima nedostatka bubrega-janga u klinici.

U grupi MC, nivo CRH, ACTH, T i CORT u serumu pacova značajno je smanjen (P< 0.01). After being treated by CD and WCD, the content of CRH, ACTH, T, CORT, and cortisol all increased to some degree, and the effect of WCD-MD was the best, almost equal to that in the PC group. These results indicated that the relative hormone balance in the HPA axis had been destroyed in the MC group, CD and WCD could improve the functional recovery of abnormal adrenal axis hormone levels, but the effect of WCD was better.

Moduliranje proporcije članova porodice Bcl-2 jedan je od ključnih mehanizama pomoću kojih FasThFasL posreduje u putu receptora smrti, a porodica Bcl-2 reguliše mitohondrijski put [21]. Faktor koji inhibira apoptozu Bcl-2 i faktori koji induciraju apoptozu, kao što je Bax, svi pripadaju porodici Bcl-2 [22]. Apoptoza ćelije može biti određena relativnim odnosom faktora koji inhibiraju apoptozu i faktora koji induciraju apoptozu [23]. Mitohondrije imaju funkciju centralnih kontrolnih tačaka za mnoge oblike apoptoze [24]. Ova studija je pokazala da CD-MD i WCD mogu zaključiti ekspresiju Bax i povećati Bcl-2 napoboljšati nedostatak bubrega-janga. Fas je glavni receptor smrti koji indukuje apoptozu ligacijom sa Fas ligandom (FasL) [25]. Ekspresija Fas i FasL u MC grupi je porasla, dok je ova ekspresija značajno porasla u grupi WCD-MD (P< 0.01) compared with the MC group. Both FasThFasL and BaxThBcl-2 systems transduce apoptotic signals to the caspase family [26]. Caspase-3 is one of the pivotal proteinases that initiate cell apoptosis. The activation of caspase-3 indicates that apoptosis enters an irreversible stage [27]. The expression of caspase-3 in the MC group increased and increased significantly in the WCD-HD and WCD-MD groups (P < 0.05).

Nedostatak imunološke funkcije jedna je od važnih manifestacija nedostatka bubrega-janga [28]. U ovoj studiji smo otkrili da se indeks slezine i timusa grupe WCD-MD značajno oporavio (P< 0.01, P < 0.05). The immune response of the immune system is regulated mainly by the Th subgroups [29]. IL-2 is the growth factor for T cells, secreted by T cells and macrophages, participates in inflammatory regulation, regulates immunity, and increases infection resistance [30]. The level of IL-2 in the MC group decreased (P < 0.01), and after treatment with CD and WCD, the level of IL-2 recovered. IL-6 and TNF-α are proinflammatory cytokines. Increased levels of IL-6 and TNF-α cytokines cause cytokine imbalances and exacerbate inflammation. The levels of IL-6 and TNF-α increased in the MC group, while after treatment, the levels of IL-6 and TNF-α decreased. T cells are divided into CD4 cells and CD8 cells, and the CD4+ThCD8+ ratio can be used as an important index of immune regulation [31]. CD4+ThCD8+ in the MC group decreased (P < 0.01), while in the WCD and CDHD groups increased (P < 0.01).

HPA os je najvažniji regulatorni sistem jer reguliše lučenje glukokortikoida i endokrini sistem za održavanje sekretorne funkcije kore nadbubrežne žlezde [32]. Prekomjerna ekspresija CaM mRNA u tkivu hipotalamusa bila je povezana sa nedostatkom janga bubrega. CD i WCD mogu blokirati kalcijumske kanale, inhibirati ekspresiju CaM mRNA u hipotalamusu i smanjiti priliv kalcija, smanjujući tako aktivnost Ca2+·CaM kompleksa.

Formiranje nedostatka bubrega-janga je proces razvoja hronične bolesti. Bubreg više nije čisto anatomski pojam, već je opšti termin za neuroendokrini imunitet i genitourinarni sistem. Neuroendokrino-imuna (NEI) mreža je važan integrisani regulatorni sistem [33]. CD i WCD mogu regulisati funkciju HPAT ose i poboljšati oporavak od nedostatka bubrega-janga. Ovaj rezultat pruža eksperimentalnu osnovu za kliničku prevenciju i liječenje nedostatka bubrega-janga.