Studija efekata kalcitriola protiv starenja na ljudske prirodne ćelije ubice in vitro

SAŽETAK

Smatra se da vitamin D ima regulatorni efekat na imuni sistem. Neka klinička istraživanja su pokazala da potražnja zavitamin D se povećava sa godinama. Kalcitriol je biološki aktivan oblikvitamin D. Međutim, njegov učinak na ljudske prirodne stanice ubice (NK) ostaje nejasan. Stoga smo u ovoj studiji istraživali kalcitriol protiv starenja i imunomodulatorni učinak na NK ćelije koristeći niz imunoloških metoda kako bismo istražili njegovu važnu ulogu u urođenom imunitetu. Otkrili smo da je kalcitriol preokrenuo ekspresiju biomarkera povezanih sa starenjem u NK ćelijama i inhibirao njihovu ekspanziju održavajući ove ćelije u G1 fazi, bez apoptoze i iscrpljenosti. Kalcitriol je potisnuo oslobađanje citokina povezanih s upalom, kao što su interleukin-5 (IL-5), interleukin-13 (IL-13), interferon-gama (IFN-), i faktor nekroze tumora-alfa (TNF-). Degranulacija NK ćelija je smanjena kalcitriolom kada su ove ćelije zajedno kultivisane sa K562 tumorskim ćelijama. Također smo otkrili da kalcitriol pojačava regulaciju sirtuin 1- protein/kinaze R-slične endoplazmatske kinaze (SIRT1/pERK) i ekspresiju SIRT1-deltaExon8 (SIRT1-∆Exon8) povezane sa starenjem aktiviranjem receptora za vitamin D (VDR). Štaviše, kalcitriol bi mogao biti potencijalni negativni regulator NK ćelijaapoptozaimitohondrijalna inaktivacijakoji je uzrokovanoksidativni stres. Dakle, kalcitriol pokazujeefekti protiv starenjana ljudskim NK ćelijama in vitro aktiviranjem SIRT1-PERK ose iotporan na oksidativno starenje.

Kliknite ovdje da dobijete Cistanche dodatke protiv starenja

1. Uvod

Mnoge studije su otkrile da starenje ima direktan utjecaj na nekoliko bolesti, kao što su zarazne bolesti, kardiovaskularne bolesti, neurodegenerativne bolesti, autoimuni poremećaji i rak. Starenje organizma je praćeno imunosenscencijom. Zajedničke karakteristike starenja uglavnom uključuju starenje upale s kroničnom niskom upalom [1], nestabilnost genoma, neravnotežu ekspresije proteina, mitohondrijalnu inaktivaciju, ćelijsko starenje i promjene u međućelijskoj komunikaciji [2]. Kao glavna komponenta urođenog imuniteta, NK ćelije igraju važnu ulogu u antiinfekcijskim i antitumorskim efektima, kao i u regulaciji imunološkog sistema [3]. NK ćelije mogu eliminisati ciljne ćelije direktno ili putem ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitijela (ADCC), umjesto da ispoljavaju bilo kakve odgovore specifične za antigen ili antitijela [4]. NK ćelije su također povezane s reakcijama preosjetljivosti i autoimunim bolestima [5]. Kada imuni sistem stari, dolazi do ekspresije receptora površinske aktivacije kao što je prirodni ubica grupe 2 D (NKG2D) [6], receptor sličan imunoglobulinu (KIR), klaster površinskih markera diferencijacije 57 (CD57) [7] , klaster diferencijacije 16 (CD16) [8] je povećan. Ovaj molekul bi mogao aktivirati funkciju ubijanja NK stanica, što može dovesti do ćelijske neravnoteže i upale kod starijih osoba. U međuvremenu, inhibitorni molekuli NK ćelija, kao što su prirodni ubica grupe 2, član A (NKG2A), prirodni ubica grupe 2, član C (NKG2C), i prirodni receptori citotoksičnosti (NCR) [6] su se smanjili. Ostali markeri NK ćelija povezani sa starenjem su imunoglobulin T ćelija i protein 3 koji sadrži domen mucina (TIM3) i povećana programirana ćelijska smrt-1 (PD-1). Povećana regulacija PD-1 i TIM3 tokom imunosenscencije može inhibirati funkcije NK ćelija i dovesti do iscrpljivanja NK ćelija [9].

Drugi faktor koji dovodi do imunosenscencije je imunološka upala [10]. Prijavljeno je da visoki nivoi upalnih citokina koje oslobađaju NK ćelije uzrokuju oštećenje DNK, oksidativni stres i ćelijsko starenje. Štaviše, ćelijska neravnoteža NK ćelija i status upale mogu dovesti do autoimune bolesti [11]. Nivoi interleukina-1 (IL-1), interleukina-4 (IL-4), interleukina-6 (IL-6), interleukina -10 (IL-10), i faktor nekroze tumora-alfa (TNF-) su viši kod starijih osoba [12]. Iako se broj ukupnih imunoloških stanica smanjio sa starenjem, populacija NK stanica se značajno povećala, što može biti uzrokovano infiltracijom upalnih stanica [13].

Vitamin D postoji u dva aktivna oblika u ljudskom tijelu kao vitamin D2 (ergokalciferol) i vitamin D3 (kalcitriol). Primarna funkcija vitamina D je podsticanje apsorpcije kalcijuma i fosfora. Vitamin D također reguliše imunološke funkcije [14]. Iako su se mnogi izvještaji fokusirali na njegove antiinfekcijske i antitumorske funkcije [15], kalcitriol također pokazuje protuupalno djelovanje [16]. Receptor vitamina D (VDR) eksprimiran je na različitim imunim ćelijama [17]. Smanjenje proizvodnje upalnih citokina doprinosi smanjenju upalnih reakcija. Poznato je da kalcitriol potiskuje proizvodnju TNF-a, interleukina-1 (IL-1), interleukina-2 (IL-2), interferona-gama (IFN-) i drugi inflamatorni citokini u B i T ćelijama. Također može osloboditi protuupalne citokine kao što su IL-4 i IL-10 [18] i regulirati autofagiju protiv inflamatorne ćelijske infiltracije [19].

Antioksidativna svojstva kalcitriola prijavljena su kod depresije, bolesti masne jetre [20], kardiovaskularnih bolesti i drugih bolesti povezanih s upalom. Slobodni radikali i reaktivne vrste kiseonika (ROS) se takođe akumuliraju u ćelijama i tkivima tokom starenja. Objavljeni podaci su pokazali da oksidativni stres utječe na različite signalne puteve u stanicama [21], uključujući puteve SIRT1, protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK) i nuklearnog faktora-κB (NF-κB). SIRT1 gen se smatra genom za dugovječnost i supresija ovog gena dovodi do poremećaja vezanih za ekspresiju proteina, ćelijski ciklus i metabolizam [22]. SIRT1-ΔExon8 je nova izoforma SIRT1, koja je postojala kod sisara alternativnim spajanjem. SIRT1-ΔExon8 se takođe smatra koregulatornim faktorom SIRT1 pune dužine [23].

Do sada se vrlo malo studija fokusiralo na efekte starenja i oksidativnog starenja na NK stanice. Efekti kalcitriola na SIRT1-ΔExon8 također nisu prijavljeni. Stoga je ova studija imala za cilj istraživanje efekata kalcitriola na starenje i oksidativno starenje NK ćelija, budući da ove ćelije zauzimaju centralnu poziciju u ljudskom urođenom imunološkom sistemu.

2. Materijali i metode

2.1 Ćelijska kultura i reagensi

Uzeta su tri uzorka ljudske periferne krvi od donatora koji nisu imali nikakvu aktivnu autoimunu bolest, akutnu ili kroničnu inflamatornu bolest, rak ili druge bolesti povezane s imunitetom. Starost davalaca kretala se od 48 do 65 godina. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane su upotrebom Lymphoprep Ficoll-a. NK ćelije su proširene i održavane pomoću NK Cell Culture Kit (MoreCell, Shenzhen, Kina) na 37 stepeni/5 posto CO2.

2.2 Protočna citometrijska analiza

Nakon tretmana kalcitriolom u trajanju od 72 sata, NK ćelije su obojene antihumanim FITC-CD3, PerCp-CD56, APC-CD16, PE-NKG2A, PE-TIM3, PE-PD1 i PE-KIR (BioLegend, Kalifornija, SAD). Svi FACS testovi su izvedeni pomoću DxFLEX protočnog citometra (Beckman, Kalifornija, SAD).

2.3 Mjerenje ćelijske ekspanzije, ispitivanje otpuštanja citokina i ćelijskog ciklusa

Proširenje ćelija je određeno korišćenjem kompleta za brojanje ćelija-8 [24] (CCK8; Beyotime, Šangaj, Kina). NK ćelije su tretirane kalcitriolom tokom 48 h, a supernatant je sakupljen za test oslobađanja citokina. Nivoi citokina su ispitivani pomoću LEGEND Plex Human Inflammation Panel (BioLegend, Kalifornija, SAD). Prvo, zrnca za hvatanje citokina su inkubirana sa standardima ili uzorcima, a zatim su dalje inkubirana sa biotiniliranim antitijelima za detekciju. Biotinilirani rastvor za detekciju antitela za vezivanje, streptavidin (SA)-PE, je naknadno dodan da bi se obezbedio fluorescentni signal [25]. Ovi signali su zatim analizirani pomoću FACS testa.

Ćelijski ciklus je meren korišćenjem kompleta za detekciju ćelijskog ciklusa (Beyotime, Šangaj, Kina). NK ćelije su tretirane kalcitriolom 72 h. Ove ćelije su fiksirane u 70 posto ledeno hladnog etanola i zatim obojene ribonukleazom A (RNase A) i propidijum jodidom (PI) (Beyotime, Šangaj, Kina) [26].

2.4 Test ubijanja NK ćelija

Ljudske eritroleukemijske ćelije, ćelije K562 (ATCC, Virginia, SAD), inkubirane su sa 10 uM 3,3 -dioktadecil-oksakarbocijanina (DIOBeyotime, Šangaj, Kina) 15 minuta, a zatim dodane NK ćelijama tretiranim kalcitriolom pri različitim odnosima (E/T'=1:1, 5:1 i 10:1) tokom 4 h, respektivno (27).

2.5 Indukcija oksidativnog starenja i X-gal analiza bojenja

In vitro model starenja NK stanica korištenjem vodikovog peroksida (H2O2). Kako bi se utvrdio antioksidacijski učinak kalcitriola, NK ćelije su prvo tretirane kalcitriolom, a zatim izložene 100 μM H2O2 tokom 24 h. Aktivnost -galaktozidaze je mjerena korištenjem 5-bromo-4-hloro-3-indolil- -D-galaktopiranozida (X-gal) bojenja. Tretirane ćelije su fiksirane u 4% paraformaldehida i obojene rastvorom za bojenje -galaktozidaze (Beyotime, Šangaj, Kina) preko noći na 37 stepeni [28]. Obojene ćelije su zatim suspendovane u PBS i slike ovih ćelija su dobijene korišćenjem Leica fluorescentnog inverzionog sistema mikroskopa. Tri mikroskopske slike su nasumično sakupljene sa različitih pozicija pri povećanju od 40x za svaku grupu. Procenat ćelija obojenih X-gal je izračunat i korišćen za procenu starenja ćelija korišćenjem softvera ImageJ V.1.45S.

2.6 Bojenje i analiza potencijala mitohondrijalne membrane

Chlorometil-X-Rosamine (CMXRos) i Hoechst (Beyotime, Shanghai, Kina) korišteni su za procjenu potencijala mitohondrijalne membrane. Ćelijska jezgra (plava) su locirana Hoechstovim bojenjem, dok je potencijal mitohondrijalne membrane određen mitohondrijalnom specifičnošću koja označava fluorescentnu boju, CMXRos. Hoechst plus CMXRos ćelije (označene bijelim strelicama) pokazale su nisku aktivnost. Relativni nivo fluorescencije je izračunat deljenjem broja Hoechst-pozitivnih ćelija sa CMXRos-pozitivnim ćelijama [29]. Ćelije su inkubirane sa 200 nM CMXRos i Hoechst (30 min, 37 stepeni) i detektovane korišćenjem Leica invertnog mikroskopa na talasnim dužinama ekscitacije od 579 nm i 350 nm. Procenat Hoechst plus CMXRos plus ćelija je izračunat kako je opisano u Odjeljku 2.5.

2.7 Western blotting

Ćelije su lizirane korišćenjem radioimunoprecipitacionog testa (RIPA) pufera za lizu (Beyotime, Šangaj, Kina) sa inhibitorom fosfataze PhosSTOP (Roche, Basel, Švajcarska) i 1 μM fenilmetilsulfonil fluorida (PMSF) (Beyotime, Šangaj, Kina). Ukupni protein je kvantificiran korištenjem Bradford Protein Assay Kit (TAKARA, Tokio, Japan). Uzorci proteina su odvojeni elektroforezom natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnog gela (SDS-PAGE) i prebačeni na 0.22 μm poliviniliden fluorid (PVDF) membrane (Immobilon-P membrana; Millipore, Massachusetts, SAD). Nakon blokiranja, membrane su ispitane primarnim antitijelima i inkubirane sa sekundarnim antitijelima [30]. Membrane su detektovane pomoću Odyssey sistema (LI-COR, Nebraska, SAD).

2.8 Statistička analiza

Podaci su analizirani jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA) koristeći GraphPad Prism i predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). 6846 W. LI ET AL. Razlike su smatrane statistički značajnim na P < 0.05. Rezultati su takođe analizirani pomoću softvera GraphPad.

Pitajte za više:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950