Strukturna karakterizacija i procjena antiinflamatornog i antitirozinaznog djelovanja polifenola iz melastoma normale 2. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Jedinjenje 3 imalo je istu molekularnu formulu kao i jedinjenje 2, što je određeno njegovim HRESIMS podacima. Poređenje između NMR podataka za 3 i 2 (Tabela 2) otkrilo je da je metoksilna grupa na galoil-C-4 u 2 prešla u galoil-C-3' u 3. Ovo je potvrđeno korelacijama HMBC (Slika 2) metoksil protona (8y 3.88) i aromatičnog protona (bH7.24) sa galoil-C-3'(6c 149.1) u 3, i hemijskim pomacima metoksilne grupe, galoil-C{ {24}}, galoil-C-4, i galoil-C-3' koji su se pomaknuli sa bc60.8,151.5,141.3, i 146.5 u 2tobc56.7,146.6,140.7, odnosno 149.1 u 3.A, respektivno pamučni efekat na 237 nm i negativan na 262 nm u CD spektru ukazuje na (S) konfiguraciju HHDP grupe za 3 [24]. Konfiguracija šećernog dijela je izvedena iz konstante spajanja (=8.5 Hz) anomernog protona glukozilnog dijela. Kisela hidroliza 3 sa 1 M HCl dala je D-glukozu, što je potvrđeno TLC i GC analizama. Stoga je jedinjenje 3 identificirano kao 1-O-galoil-6-O-(3-metoksigaloil)-2,3-O-(S)-heksahidroksidifenoil{{ 66}}D-glukoza.

Molekularna formula 4 je izvedena iz njenog HRESIMS spektra (m/z 783,1032, [MH]-) kao C35 H28 O21. Njegova molekularna težina bila je 16 jedinica mase manja od one od 3, što se može pripisati odsustvu hidroksila i prisustvu aromatičnog protona (6H6.87) u vaniloil-C-5' u 4 (Tabela 2) . Ovo je potvrđeno prisustvom 1,2,4-trisupstituiranog aromatičnog dijela (μ7.60 （dd, J=8.3,1.8 Hz）,6.87 （d, J=8 .3 Hz）, i 7.57 (d, J=1.8 Hz)） i promjena hemijskog pomaka galoil-C-5' na δc 145.8 u 3 u vaniloil-C-5 ' na bc 115,9 u 4. Korelacije metoksil protona (6H 3,90) i aromatičnog protona (H 6,87) sa vaniloil-C-3' u HMBC spektru (slika 2) dodatno su potvrdile aromatični proton (H 6,87) na vaniloil-C-5'. Pokazalo se da je atropizomerizam HHDP-a S konfiguracija pojavom pozitivnih i negativnih efekata pamuka na 239 nm i 263 nm, respektivno [24]. Konstante spajanja anomernog protona u 4 bile su 8,5 Hz koje podsjećaju na -anomernu konfiguraciju. Kiselinska hidroliza je otkrila da 4 ima iste jedinice šećera kao 3. Dakle, jedinjenje 4 je identificirano kao 1-O-galoil-6-O-vaniloil-2,3-O- (S)-heksahidroksidifenoil- -D-glukoza.

Molimo kliknite ovdje da saznate više

2.2. Testovi antiinflamatorne aktivnosti

Four new compounds 1-4 were tested for potential anti-inflammatory activity by measuring the inhibition of nitric oxide (NO) production. Unfortunately, none of them displayed significantly anti-inflammatory activity. The IC5o values for the inhibition of NO production by compounds 1-4 are all>50uM. Prijavljeno je da poznati flavonoli kaempferol(7)[26[, kvercetin (10)[27l i miricetin-3-O- -L-ramnopiranozid(12)28 imaju protuupalno djelovanje, ali kempferol -3-ramnozid (8) [26] i kvercetin-3-O- -L-ramnozid (11)[29] nemaju protuupalno djelovanje. Prema eksperimentalnim rezultatima i literaturnim podacima, flavonoidi u naslovnoj biljci imaju bolje protuupalno djelovanje od elagitanina, može biti aktivni sastojak koji odgovara protuupalnom dejstvu ove biljke.

2.3. Testovi aktivnosti inhibicije tirozinaze

Svi spojevi su ispitani na potencijalnu inhibitornu aktivnost tirozinaze. Kao što je prikazano u Tabeli 3, nova jedinjenja 2-4 su pokazala umjerenu inhibitornu aktivnost tirozinaze. Novo jedinjenje 1 pokazalo je slabu inhibitornu aktivnost tirozinaze. Kvercetin (10)[30] ima značajnu inhibitorsku aktivnost na tirozinazu, a njegova aktivnost protiv tirozinaze je bolja od kvercetin-3-OwL-ramnozida(11)[26] i kempferola (7) [26], što je konzistentno sa podacima iz literature. Ovo ukazuje da su 3'- i 4/-hidroksi grupe na B prstenu i 3-hidroksi grupe na C prstenu u flavonolima bile ključne za njihovu aktivnost. Anti-tirozinazna aktivnost kaempferola (7)[26] je bolja od kaempferol-3-ramnozida (8)[26], a jedinjenja 8 i 12 [31] nemaju značajnu aktivnost protiv tirozinaze, što dalje podržava gore navedeno odnosi strukture i aktivnosti.

3. Eksperimentalni 3.1. Materijali

Korijeni M.normale prikupljeni su iz grada Yanshan, Guilin City, provincija Guangxi, u septembru 2018. godine, a autentičnost ih je potvrdio profesor Yusong Huang (Guangxi institut za botaniku). Uzorak vaučera (20180912) deponovan je u Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization, Guangxi Institute of Botany, Kina.

Cistanche može poboljšati imunitet

3.2. Opće eksperimentalne procedure

Optičke rotacije su mjerene pomoću ADP440 plus polarimetra （λ 589 nm, dužina putanje 1.0 cm). NMR spektri su dobijeni na spektrometru Bruker Advance 500 （Bruker Biospin AG, Fällanden, Švicarska）, a rezidualni vrhovi rastvarača korišteni su kao reference. Konstante spajanja i hemijski pomaci dati su u Hz i na skali δ (ppm) respektivno. ESIMS i HIRESIMS podaci su snimljeni na BRUKER HCT masenom spektrometru i LCMS-IT-TOF spektrometru (Shimadzu, Kjoto, Japan), respektivno. GC je izveden na Agilent 7890ON (Agilent Technologies, Inc. Chandler, AZ, USA) sistemu sa 0,32 mm id×25 mL-Chirasil-Val kolonom. Analitička HPLC je izvedena na Shimadzu LC-2030C HPLC (Shimadzu, Kyoto, Japan) sistemu koristeći 4.6id×250 mm Agilent Eclipse XDB-C18 (5 um) kolonu. polupreparativni HPLC je sproveden na Shimadzu LC-20AT HPLC sistemu koristeći 20.0id×250 mm Dr. Maisch reprosil 100 C18 (5 um) kolonu pri brzini protoka od 4 mL/min. Kromatografija na koloni (CC) je izvedena korištenjem Sephadex LH-20 （25-100 μm; GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, Švedska）, kolona silika gela (200-300 mreža, Qingdao Marine Chemical Co. Ltd., Qingdao, Kina), MCI gel CHP 20P (75-150 um; Mitsubishi Chemical Co., Tokio, Japan) i Chromatorex ODS (50 um, Merck, Darmstadt, Njemačka) kolone.

3.3. Ekstrakcija i odvajanje

Na zraku osušeni korijeni u prahu (10 kg) M. normale ekstrahovani su sa 8{{20}} posto vodenog acetona (3×7 dana) na sobnoj temperaturi i svaki ekstrakt je filtriran. Filtrati su osušeni pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi ekstrakt (0.6 kg). Ekstrakt je suspendiran u H2O (1 L) i sukcesivno podijeljen sa petroleterom (3×2L), EtOAc (3×2 L). Ekstrakt EtOAce (8{{40}}g) je podijeljen na deset frakcija ( Fr.1-10)pomoću silika gela CC (8 id×20 cm) eluiranjem sa gradijentom CH2Cl-MeOH (100:0,95:5,90:10,80:20, 70 :30,50:50,0:100,v/v). Fr.4 (32 g) je stavljen na MCI gel kolonu (6i.d.×20 cm) i eluiran sa gradijentom MeOH-H,O (0∶100-100∶0,v/ø) do dati osamnaest podfrakcija (Fr4-1-4-18). Odvajanje podfrakcije Fr4-14(3,0g) je izvršeno drugom kolonom silika gela (3i.d.×20 cm) eluiranjem sa gradijentom CH2Cl{{48 }}MeOH (97:3-80:20, o/v) i Sephadex LH-20 Ccelucija sa CH2Cl2-MeOH(1:1,v/o) da se dobije 7(11,3 mg ),8 (10,6 mg), 9 (9,3 mg), 10 (20,6 mg), 11 (7,6 mg) i 12 (6,2 mg). Fr 6 (4,2 g) je primijenjen na kolonu ODS C18 i eluiran sa MeOH-H2O (20:80-80:20) da bi se dobilo 9 subfrakcija (Fr 6-1-6-9). Daljnje odvajanje subfrakcije Fr 6-4(1,2 g) upotrebom Sephadex LH-20 CC (eluirano sa MeOH-H2O,10:90-100:0) dalo je jedinjenja 1(9,6 mg),5( 7,2 mg) i 6 (7,3 mg), respektivno. Jedinjenja 2 (tR 130,5 min, 5,2 mg), 3 (tR 146,8 min, 9,6 mg) i 4 (tR 177,2 min, 15,3 mg) su dobijena iz Fr7 (2,5 g) polupreparativnim HPLCeluiranjem sa gradijentom MeOH-H2O( 20:80-40:60, / u, 0-250 min).

3.4.Spektroskopski podaci

Tanin viskija C (1): Smeđi amorfni prah; [ ]-12.6 stepen (c= 0.16, MeOH);UV (MeOH)λmaxnm (log e)∶203(2.02),276(1.19）; CD （MeOH）λmax（△e）263（-7.8）,240（10.9）,225(2.9).1Hand 13C NMR podaci,vidi tabelu 1;HRESIMSm/z:[MH]{{24} }.1240 (izračunato za C4sH33O27-, 1005.1215). 1-O-(4-metoksigaloil)-6-O-galoil-2,3-O-(S)-heksahidroksidifenoil- -D-glukoza( 2): Smeđi amorfni prah amorfni prah; 【】5-5.5 stepen (c=0.17, MeOH); UV (MeOH) 入max nm (log e)∶203 (2,52), 275 (2,01); CD （MeOH）λmax（△8）264（-8.0）,238（30.6）,218（1.3）.'H i 13C-NMR podaci, vidi tabelu 2; HRESIMS m/z:799,0983[MH]-(izračunato za C3sH2O22-, 799,099).

{{0}}O-galoil-6-O-(3-metoksigaloil)-2,3-O-(S)-heksahidroksidifenol-6- D-glukoza(3); Smeđi amorfni prah;【】7-33.5 stepeni （c=0.12, MeOH）; UV (MeOH) 入max nm (log e)∶203 (2,40), 273 (1,68); CD （MeOH）λmax（△e）262（-3.1）,237（11.1）,210（-2.7）.'Hand13CNMR podaci, vidi tabelu 2;HRESIMS m/z:769 [MH]-(izračunato za C35H2O22-, 799,0999). 1-O-galoil-6-O-vaniloil-2,3-O-(S)-heksahidroksidifenoil- -D-glukoza (4): Smeđi amorfni prah; 【】7-20.6 stepen (c=0.15, MeOH); UV (MeOH) λmax nm (log e)∶203 (2.42), 278 (1.86）; CD (MeOH) λmax (△e) 263 (-12.1), 239 (42,5), 219 (0,9).'H i 13CNMR podaci, vidi tabelu 2; HRESIMS m/z: 0328 (izračunato za C35H27O21-,783,1050).

3.5. Kisela hidroliza 2-4

Jedinjenje 2 (2 mg) je tretirano sa 1 M HCl (5 mL) na 80 stepeni tokom 4 h, a zatim ekstrahovano etilacetatom (3×5 mL). Vodena faza je osušena u struji N2 da bi se dobio neutralni ostatak koji je analiziran upotrebom TLC(SiO2) sa EtOAc-piridin-EtOH-H, O(7:1:1:2) kao sistemom rastvarača. R-vrijednost neutralnog ostatka bila je ista kao kod autentične D-glukoze što ukazuje da je šećerna komponenta 2 glukoza. Neutralni ostatak i 5 mg L-cistein metil ester hidrohlorida rastvoreni su sukcesivno u 3 mL bezvodnog piridina i zagrevani na 80 stepeni 1 h. Nakon uklanjanja rastvarača isparavanjem pod sniženim pritiskom, reakciona smeša je zatim reagovala sa 0,6 mL N-trimetilsililimidazola na 80 stepeni tokom 1 h. Reakciona smeša je podeljena sa n-heksanom i H, O, a zatim je n-heksanski sloj analiziran GC instrumentom. Temperature injektora i detektora su postavljene na 250 stepeni i 280 stepeni, respektivno. Početna temperatura kolone je održavana na 160 stepeni 1 min, zatim je povećana na 280C pri 5 stepeni/min i držana 10 min. Autentična D-glukoza i autentična L-glukoza silirane su i analizirane na isti način, a njihova retencijska vremena bila su 19,09 i 19,25 min. Rezultati GC analize su pokazali da je šećerna komponenta 2 D-glukoza (t 19,1 min). Komponente šećera 3 i 4 određene su istim postupkom.

3.6. Anti-inflamatorna aktivnost

3.6.1.NO Proizvodnja od strane LPS-stimuliranih RAW 264.7 ćelija

RAW 264.7 ćelije su kultivisane u DMEM sa dodatkom 10 procenata FBS na 37 stepeni u vlažnoj atmosferi od 5 procenata CO2 tokom 24 sata. Ćelije u ploči sa 24-jažicom (5×104 ćelija/jažicu) tretirane su sa 200 ng/mL LPS-a i ispitivanim jedinjenjima. Nakon 22 h podloga je sakupljena i mjeren je nivo nitrita pomoću Griess sistema reagensa (Promega, Madison, WI, SAD).

3.6.2. Cell Viability

MTT test je sproveden za merenje citotoksičnosti test uzoraka na ćelijskoj liniji RAW264.7. Ćelije koje su bile u logaritamskoj fazi rasta su zasijane u 96-ploču sa gustinom od 5×10 plus -6×10* ćelija/jažici i inkubirane na 37 stepeni sa 5 procenata CO, tokom 24 h. Zatim su ćelije tretirane sa 100 μL podloge za kulturu pri različitim koncentracijama test uzoraka tokom 24 h. Medijum je odbačen i u svaku jažicu je dodato 100 uL medijuma bez FBS koji sadrži MTT (1 mg/mL). Nakon inkubacije u inkubatoru od 4 h, supernatant je odbačen i u svaku jažicu je dodato 100 μL DMSO da bi se rastvorio formazan. Apsorbanca je izmjerena na 570 nm pomoću čitača mikroploče.

3.7. Anti-Ty/rozinaza aktivnost

Antitirozinazne aktivnosti izolata ispitivane su prema proceduri koju su opisali Aoki et al. uz neznatne izmjene [21]. Kao supstrat korišćeni su L-DOPA i kojična kiselina, a pozitivna kontrola. Otopina L-DOPA u 5.0 mM, tirozinaza pečuraka na 100 U/mL, kao i uzorci različitih koncentracija pripremljeni su u fosfatnom puferu (pH6,8) .20 μL otopine uzorka i 10 μL rastvora tirozinaze pečurke su pomešani i prethodno inkubirani na 37 stepeni tokom 10 minuta, zatim je dodato 40 uL rastvora L-DOPA i inkubirano na 37 stepeni tokom 5 minuta. Reakcioni sistem eksperimenta aktivnosti anti-tirozinaze prikazan je u tabeli 4. Apsorbancija je izmerena na 475 nm korišćenjem Spark 10M multimodnog čitača mikroploča (Tecan Trading AG, Cirih, Švajcarska). Svi testovi su ponovljeni tri puta i svaki put u tri primjerka. Procenat inhibicije aktivnosti tirozinaze izračunat je pomoću sljedeće formule:

gdje T predstavlja apsorpciju uzorka i tirozinaze; To predstavlja apsorpciju sa uzorkom, ali bez tirozinaze; C predstavlja apsorpciju sa tirozinazom, ali bez uzorka; Co predstavlja apsorpciju bez tirozinaze i uzorka.

4. Zaključak

Studija ima za cilj da istraži više protuupalnih i enzimskih inhibitornih aktivnosti polifenola iz korijena M.normale na osnovu naših prethodnih radova [20]. Kao što se i očekivalo, dvanaest polifenola je po prvi put dobijeno iz fabrike pločica, a jedinjenje 1-4 je novi elagitanin. Uspješna izolacija i identifikacija strukture elagitanina obezbjeđuju materijale za skrining antiinflamatornih lijekova i inhibitora enzima, a također doprinose razvoju i korištenju M.normale. Elagitanini 1-4 nemaju značajne inhibitorne i antiinflamatorne aktivnosti tirozinaze, zbog čega je manje vjerovatno da će biti potencijalni protuupalni lijek ili inhibitor enzima. Srećom, poseduju nove efekte, kao što je anti-gojaznost [6,7]. Flavonoidi imaju bolje protuupalno i inhibitorno djelovanje enzima od elagitanina u korijenu M. normale, i vjerojatnije je da će biti protuupalni i antienzimski inhibitori. Proučavanje odnosa strukture i aktivnosti pomaže u pronalaženju novih protuupalnih lijekova i inhibitora enzima.

Ovaj članak je preuzet iz Molecules 2021, 26, 3913. https://doi.org/10.3390/molecules26133913 https://www.mdpi.com/journal/molecules