Interakcije između polifenolnih antioksidanata kvercetina i naringenina diktiraju prepoznatljivo hemijsko i biološko ponašanje njihovih mješavina povezanih s redoksom, 2. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Q pri koncentraciji od 1 μM također je imao tendenciju smanjenja ekspresije ALOX12 i MT3 (0.05<><0.09) as="" well="" as="" sod2="" and=""><><0.09).the latter="" gene="" codes="" for="" a="" protein="" that="" belongs="" to="" the="" family="" of="" thioredoxins="" and="" acts="" as="" an="" endogenous="" antioxidant="" facilitating="" the="" reduction="" of="" other="" proteins8.in="" contrast,="" to="" n-,o="" at="" 1="" um="" up-regulated="" gtf2i=""><0.05).the other="" genes="" whose="" expression="" was="" significantly="" elevated="" by="" q="" at="" l="" μm="" were="" gsr,="" hspa1a,="" ptgsi,="" and="" txnrd1;="" all="" play="" key="" roles="" in="" building="" cellular="" defenses="" against="" oxidants.="" up-regulation="" of="" gsr="" is="" crucial="" for="" maintaining="" redox="">homeostazau ćelijama jer kodirani protein održava visok nivo redukovanog glutationa u citosolu39. Zauzvrat, HSPAlA chaperone je neophodan za ispravljanje bilo kakvog pogrešnog savijanja, također i onih koje su rezultat izlaganjaantioksidansi. Potonje može pomjeriti redoks ravnotežu prema smanjenom stanju, što dovodi do vjerovatnijeg smanjenja disulfidnih mostova nasulfhidril

grupe i na taj način mijenja strukturu proteina i time funkciju0. PTGS1 gen kodira protein koji je vet drugi član porodice antioksidativnih enzima, naime prostaglandin sintaza-241, četvrti spomenuti gen-TXNRD{{4 }}kodovi za tioredoksin reduktazu koja održava tioredoksin (TXN) u reduciranom stanju2.

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Slično 1 μM, Q pri višoj koncentraciji (10 μM) je također smanjio ekspresiju TXN (p<0.05） and="" sod2=""><><0.09). furthermore,="" a="" drop="" in="" expression="" was="" observed="" for="" sod1=""><><0.09). the="" investigated="" flavonol="" at="" 10μm="" influenced="" the="" expression="" of="" also="" 4="" genes="" up-regulated="" by="" its="" lower="" concentration∶="" gsr,="" hspa1a,="" ptgs1,="" and="" txnrd2=""><0.05). the="" additional="" up-regulated="" genes="" by="" the="" higher="" q="" concentration="" included="" gstz1="" and="" stk25=""><0.05) as="" well="" as="" gpx4="" and="" sirt2=""><><0.09). the="" protein="" encoded="" by="" gstz1="" is="" a="" member="" of="" the="" glutathione="" s-transferase="" family="" that="" are="" key="" enzymes="" implicated="" in="" the="" detoxification="" of="" electrophilic="" molecules="" by="" conjugation="" with="" gsh4,="" while="" stk25="" codes="" for="" serine/threonine="" kinase="" 25,="" a="" protein="" activated="" by="" oxidative="" stress="" that="" induces="" apoptotic="" cell="" death.="" in="" turn,="" gpx4="" codes="" for="" glutathione="" peroxidase="" 4,="" which="" supports="" the="" antioxidant="" barrier="" of="" the="" cell="" by="" catalyzing="" the="" reduction="" of="" peroxides="" by="" glutathione="" the="" up-regulation="" of="" sirt2,="" encoding="" nad-dependent="" protein="">deacetilaze, koji deacetilira unutrašnje lizine prisutne u, npr. histonima ili faktorima transkripcije, igra ulogu u modulaciji ključnih bioloških procesa, kao što je kontrola ćelijskog ciklusa, diferencijacija ćelija ili genomski integritet,46.

Cistanche može poboljšati imunitet

Smjesa aglikona na l μM smanjila je ekspresiju APOE, CCL5, MT3 i MSRA do te mjere da je dostigla statističku značajnost (p<0.05). the="" apolipoprotein="" encoded="" by="" apoe="" is="" a="" core="" component="" of="" plasma="" lipoproteins="" and="" is="" involved="" in="" their="" production,="" conversion,="" and="" clearance47.="" the="" protein="" encoded="" by="" msra="" carries="" out="" the="">enzimskiredukcija metionin sulfoksida u metionin, tako da ovaj protein funkcionira u popravci oksidativno oštećenih proteina kako bi se obnovila biološka aktivnost8. Smjesa QN na 10 μM, slično kao niža doza, smanjila je ekspresiju APOE, MT3 i MSRA(p<0.05). however="" at="" a="" higher="" concentration.="" the="" set="" of="" down-regulated="" genes="" was="" extended="" to="" incorporate="" cygb="" and=""><0.05). the="" latter="" gene="" sepp1="" encodes="" selenoprotein="" p="" the="" extracellular="">glikoproteinkoji ima antioksidativnu ulogu i čini se da je povezan s endotelnim stanicama49. Smjesa QN-samo je neznatno potencirala ekspresiju gena PRDX5 koji kodira člana porodice antioksidativnih enzima peroksiredoksina, čija je uloga da reducira vodonik peroksid i alkilhidroperoksidi50.

Diskusija

Naučna osnova epidemioloških zapažanja koja pokazuju da je cijelo voće i povrće efikasnije u prevenciji kroničnih nezaraznih bolesti od bioaktivnih jedinjenja izoliranih iz njih je slabo shvaćena. Kao moguće objašnjenje predložen je koncept sinergije hrane, koji pretpostavlja aditivni ili čak sinergijski utjecaj različitih sastojaka hrane na zdravlje ljudi. Takvo razmišljanje je, međutim, donekle potkopano našim prethodnim istraživanjem u kojem smo upoređivali bioaktivnost različito pigmentiranog povrća (brassicas), kao i bobičastog voća, bijelog naspram antocijana koji sadrži, i nismo pronašli obrazac aktivnosti koji bi se mogao pripisati obojenim sortama, sa izuzetak veće antioksidativne aktivnosti u hemijskim testovima51. Niti biološki efekti nisu bili usklađeni sa onima izolovanog cijanidin-3-O-glukozida koji su ispitivani u koncentraciji koja se javlja u proučavanom biljnom materijalu12. Dalja mehanička istraživanja rekonstitucije kakaa također nisu pokazala nikakve aditivne/sinergističke biološke efekte mješavina komponenti kao što je predviđeno konceptom sinergije hrane, već potpuno izmijenjenu bioaktivnost3. Činilo se da su se naknadne mješavine polifenola kakaa ponašale kao nove tvari. Pretpostavili smo da bi interakcije između pojedinačnih komponenti u mješavini mogle stvoriti novi entitet koji pokazuje modificirana fizičko-hemijska svojstva koja rezultiraju novim biološkim aktivnostima. Zaista, pokazalo se da raznovrsnost mogućih interakcija između polifenola (vodonik, n, hidrofobni, kelirajući, kovalentni i elektrostatički), otkrivenih tokom istraživanja njihove primjene kao stabilizatora samosastavljenih nanočestica, proizvodi niz struktura koje se razlikuju po funkcionalnosti. Također je uočeno da ove fitokemikalije obično ispoljavaju više od jedne vrste stabilizirajućih privlačnih sila. U trenutnom istraživanju istražili smo kako je međusobna igra čestog nadmetanja za interakcije u mješavini samo dva polifenolna antioksidansa utjecala na njene redoks aktivnosti u poređenju s pojedinačnim komponentama.

Prva serija eksperimenata koncentrisana je na hemijsko i elektrohemijsko određivanje parametara koji karakterišu oksidaciju pojedinačnih i 1:1 mešanih flavonoida (predstavnika flavonolne i flavanonske grupe), odvojeno u obliku aglikona (Q N-) i glikozida (R, N plus ) . Korelacije između rezultata ovih mjerenja date su na slici 8. Inicijalne procene koje je izvršio najpopularniji DPPH serijski test su pokazale da iako su oba flavanona (N-, N plus) delovala kao veoma slabi antioksidansi, oni su povećali antioksidativnu aktivnost smeša, i QN i RN plus, na sinergistički način (Sl. 2A). DPVanalysis je pružila dublje objašnjenje ovog efekta i ukazala na odlučujući uticaj kinetike reakcije. Pokazalo se da proučavani flavanoni lako oslobađaju elektrone prema visokoj vrijednosti termodinamičkog parametra E, (Sl.2C). Ipak, kinetika ovog procesa bila je prespora da bi se mogla uočiti DPPH i PT testovima. Flavanoli, jaki antioksidansi u DPPH testu i PT, pokazali su u DPV-u suprotna svojstva – nepovoljnu termodinamiku oslobađanja elektrona, ali visoku brzinu procesa oksidacije. Poređenje strukture intermedijarnih radikala sugerira da je flavonol semikinon radikal stabilniji od flavanon fenoksil radikala zahvaljujući nekoliko mehanizama stabilizacije (Sl.1). Slijedi da je stabilizacija radikalnog intermedijera od presudne važnosti za kinetiku reakcije oksidacije i, posljedično, za reduktivnu aktivnost ispitivanih spojeva.

Konačna antioksidativna aktivnost ispitivanih mješavina je povećana pomoću termodinamičkih faktora, povoljno utječući na proces oksidacije, što je naknadno poboljšalo kinetiku reakcije (slika 2B-F). Detaljniji mehanizam ovog poboljšanja je trenutno neobjašnjen, najvjerovatnije uključuje specifične interakcije flavonol/flavanon. Ovo poboljšanje je uočeno ne samo u epruveti, već iu ćelijskim okolnostima, kao što je pokazao CAA test u kojem je antioksidativna aktivnost obje mješavine, ON i RN plus, istisnula antioksidativnu aktivnost veću od one pojedinih komponenti (Sl.4). Hemijski dio naših istraživanja otkrio je neslaganje u antioksidativnoj aktivnosti između pojedinih spojeva i njihovih mješavina. Može se

ukazuju na važnost kinetike oksidacione reakcije za ukupnu antioksidativnu aktivnost i sugerišu da interakcije između pojedinih komponenti utiču na redoks svojstva smeše. Mora biti ispravno barem u ovom slučaju kada je prisustvo flavonola (Q, R) u mješavini povećalo sposobnost flavanona (N-, N plus ) da doniraju elektrone.

Naredni dio istraživanja koncentrisao se na poređenje bioloških svojstava vezanih za redoks koji pokazuju pojedinačni flavonoidi (O, R, N-, N plus ) i njihove mješavine (ON- i RN plus ). HT29 ljudske ćelije raka debelog crijeva poslužile su kao preporučeni model za nutricionističke studije ljudskog probavnog trakta3, međutim u ovoj studiji, neke interpretacije podataka također se odnose na neoplastičnu prirodu ove ćelijske linije. Danas je opšte prihvaćeno da je redoks ravnoteža vitalna za opstanak i funkciju ćelije; stoga, izloženost egzogenim antioksidansima kao i ROS može modulirati mnoge ćelijske procese. Nakon reduktivnog stresa, nedovoljna količina ROS-a može promijeniti ćelijsku signalizaciju putem puteva zavisnih od redoks6. Višak ROS, s druge strane, dovodi do oksidativnog stresa i povećanog rizika od oksidativnog oštećenja ćelijskih komponenti. Biološka polazna tačka ovog istraživanja bila je procena uticaja antioksidanata, pojedinačnih i u mešavini, na ćelijski rast; aktivnost koja ovisi o ćelijskoj redoks homeostazi, budući da je odgovarajuća koncentracija ROS ključna za aktivaciju signalizacije koja pokreće ćelijsku proliferaciju. Rezultati testa održivosti MTT ćelija otkrili su značajne razlike između tretmana. Čista jedinjenja nisu značajno uticala na proliferaciju ćelija u poređenju sa kontrolnim netretiranim ćelijama; rast ćelija je dostigao konstantan nivo u širokom rasponu koncentracija. Nasuprot tome, obje mješavine (QN-, RN plus ) značajno su stimulirale proliferaciju stanica. Ovaj posljednji efekat ne mora nužno biti povezan samo sa antioksidativnim svojstvima mješavina, jer su rezultati CAA testa za O bili slični onima za ON-smješu. Ipak, mješavine, ali ne i pojedinačne komponente, očigledno su bolje podržavale HT29 ćelije da se nose sa rezidualnim oksidativnim stresom, npr. vraćanjem optimalnog redoks statusa; efekat koji je ranije uočen za tako jake antioksidante kao što su katehini55. Iako se sinergističko povećanje antioksidativne aktivnosti uočeno za mješavine može shvatiti kao povoljan učinak, činjenica da takve kombinacije antioksidansa stimuliraju rast stanica raka nije poželjna. Prednosti i nedostaci antioksidansa i ROS-a u raku bili su predmet debate već neko vrijeme i doveli su do zaključka da antioksidansi mogu promovirati rak putem složenih mehanizama56, što se i ovdje vidi.

Još jedno zanimljivo otkriće je da su neželjeni efekti tretmana, kao što je prooksidativna aktivnost N-otkrivena CAA testom, kao i genotoksičnost Q uočena u kometnom testu, izglađena za mješavine. Potonji test je otkrio da je oštećenje DNK uzrokovano najvišom proučavanom koncentracijom (100 uM) čistog O smanjeno na kontrolni nivo za ekvimolarnu koncentraciju mješavine QN (Slika 5) koja može biti povezana s poboljšanom antioksidativnom aktivnošću ON -uočeno u elektrohemijskim ispitivanjima. U slučaju procene ćelijske antioksidativne aktivnosti, aglikoni su pokazali jasnija antioksidativna (O) ili prooksidativna (N-) svojstva od odgovarajućih glikozida (slika 4). N- u fiziološkim koncentracijama nije nadjačao redoks puferski kapacitet normoksičnih HT29 ćelija, dok je pri višim koncentracijama od onih pronađenih u ljudskoj plazmi pokazao prooksidativni učinak ovisan o koncentraciji koji se smanjuje s vremenom izlaganja. Generalno, aglikoni su tokom vremena smanjili svoj početni uticaj na ćelijski redoks status (Sl.4). Obje mješavine su pokazale pojačanu antioksidativnu aktivnost, na koju očigledno nije utjecao prooksidativni učinak uočen za pojedinačna jedinjenja.

Diferencijalni uticaj smeša u poređenju sa pojedinačnim komponentama takođe je uočen u epigenetskoj verziji kometnog testa koji se koristi za praćenje promena u metilaciji DNK. Pojedinačni flavonoidi su pokazali tendenciju smanjenja globalne metilacije DNK na način ovisan o koncentraciji, sa izuzetkom R, koji nije uticao na ovu epigenetsku modifikaciju (Sl.6). Obje mješavine su također smanjile globalni nivo metilacije DNK, ali nije uočena korelacija sa koncentracijom. Vrijedi napomenuti da ne samo da redoks status može igrati ulogu u kombiniranju polifenola, jer u slučaju metilacije DNK, već se čini da utjecaj proučavanih flavonoida nije povezan s njihovim redukcijskim svojstvima. Poznato je da aktivna demetilacija uključuje iterativnu oksidaciju metil grupe u 5-metilcitozinu u karboksi oblik5758, tako da se očekuje da antioksidansi blokiraju ovaj proces. U našim eksperimentima uočili smo suprotan uticaj. Stoga je ovdje najvjerovatnije uključen još jedan mehanizam, a to je inhibicija DNK metiltransferaze (DNMT1) – enzima koji katalizuje prijenos metilnih grupa na dinukleotidne CpG strukture u DNK. Blokada održavanja obrasca metilacije dovodi do pasivne demetilacije tokom uzastopnih krugova replikacije DNK. Naši rezultati su u skladu s drugim studijama koje su pokazale inhibiciju DNMT1 kvercetinom9. Pokazalo se i da neki flavanoni, uključujući N-inhibiraju aktivnost DNMT1 u nuklearnim ekstraktima KYSE-510 ćelija humanog karcinoma skvamoznih ćelija jednjaka. Naša studija je takođe pokazala da mešanje Q sa N-prouzrokuje značajan pad nivoa metilacije DNK pri svim testiranim koncentracijama ove mešavine. Sličan ishod je uočen za RN plus; međutim, hipometilacija DNK se dogodila u manjoj mjeri. Sva ova zapažanja mogu biti interesantna sa terapeutske tačke gledišta Obrazac metilacije DNK kod raka karakteriše se s jedne strane globalnim gubitkom metilacije u genskim tijelima i međugenskim regijama što dovodi do slabljenja stabilnosti genoma!, s druge strane, hipermetilacija regiona bogatih CpG u promotorima i utišavanje transkripcije ekspresije tumorskih supresorskih gena (TSG)! Stoga, hipometilacija DNK izazvana polifenolima može obnoviti ekspresiju utišanih TSG gena i također postepeno povećati nestabilnost genoma raka do točke koja vodi do smrti stanice.

Proučeni opisani ćelijski efekti polifenola pokazali su da ne samo sadržaj ili sastav ili bioraspoloživost, već i interakcije između komponenti moduliraju elektrohemijska, kao i biološka svojstva mješavina. Ovaj zaključak je također jasno potkrijepljen posljednjom aktivnošću analiziranom u ovoj studiji, odnosno modulacijom ekspresije širokog spektra gena povezanih sa antioksidativnom odbranom i odgovorom na oksidativni stres. Venov dijagram (slika 7C) sumira uticaj istraživanih flavonoidnih aglikona na modulaciju ekspresije gena. U slučaju čistih jedinjenja (O, N-) na 1 uM, otkriveno je da je samo jedan gen (GTFZI) pod uticajem oba flavonoida. Međutim, N-uzrokovao je smanjenje regulacije ovog gena, dok je Q povećao njegovu ekspresiju. Ovaj utjecaj nije održan pri višim koncentracijama čistih spojeva niti je uočen za njihovu mješavinu u bilo kojoj dozi. N i mješavina QN-down-regulisali su i dva druga gena, CCL5 i MT3, na 1 μM i tri gena koji obuhvataju CYGB, MT3 i MSRA na 10uM. Najviše iznenađujuće, nisu pronađene nikakve sličnosti u regulaciji ekspresije gena između Q i QN- niti između Q, N- i QN- ni u jednoj od istraživanih koncentracija. Štaviše, mešavina QN značajno je promenila ekspresiju tri druga gena (APOE i SEPPI down-regulation, PRDX5 up-regulation) na čiju transkripcionu aktivnost nije uticala nijedna od pojedinačnih komponenti. U zaključku, naša studija pokazuje da biološka svojstva mješavine polifenola nisu samo kombinacija pojačanih ili oslabljenih aktivnosti pojedinih komponenti. Ova zapažanja ukazuju na to da bioaktivnost fitokemikalija u mješavinama mora biti rezultat interakcija između komponenti koje dovode do pojave nove tvari s novim kemijskim i biološkim svojstvima koja je teško predvidjeti. Rezultati određivanja provedenih u našoj studiji ne podržavaju samo , ali zapravo, proširuju ideju koncepta sinergije hrane naglašavajući činjenicu da čak i manje modifikacije u sastavu mješavine fitokemikalija koje se prenose hranom (vjerojatno i sastojaka hrane drugog porijekla) stvaraju novu cjelinu čiji utjecaj na ljudsko zdravlje ne mora nužno podsjećati na pojedinačnih komponenti. Ova ideja podriva trenutni način na koji su dizajnirani dodaci ishrani, koji se zasnivaju na zdravstvenim tvrdnjama utvrđenim istraživanjem izolovanih jedinjenja. Iz perspektive dijetetske kemoprevencije, predstavljena studija objašnjava zašto trenutni pristup koji naglašava upotrebu izoliranih bioaktivnih komponenti hrane nije bio u stanju da se podudara s epidemiološkim zapažanjima za cjelovitu hranu koju ljudi unose. Da bi dodaci prehrani ponudili istinske dugoročne zdravstvene koristi pojedincima, od vitalnog je značaja da se kombinacije navodnih agenasa proučavaju zajedno iu biološkom kontekstu.

materijali i metode

Hemikalije, reagensi. Za istraživanje su korištena sljedeća bioaktivna jedinjenja: kvercetin(Q), rutin (R), naringin (N plus) i naringenin (N-) iz Sigma-Aldrich (SAD). Korišteni su metanol analitičke čistoće i metanol iz POCH (Poljska) kao i DMSO iz Sigma-Aldrich (SAD). Za prečišćavanje vode korišten je sistem QPLUS185 iz Milliporea (SAD). Za procjenu antioksidativne aktivnosti spektrofotometrijskim testom primijenjen je 1-difenil-2-pikrilhidrazil(DPPH) iz Sigma-Aldrich (SAD).{7}}.1 M natrijum fosfatni pufer pripremljen otapanjem Na, HPO12H , O i NaH, PO2H, O(Sigma-Aldrich, SAD) u dejoniziranoj vodi korišteni su u elektrohemijskim studijama. Radna elektroda i elektrohemijska ćelija su očišćene rastvorom 10 mM kalijum permanganata (Sigma-Aldrich, SAD) u 95% H, SO,(y/y)(POCH, Poljska). Referentna elektroda je pohranjena u 3 M KCl (Sigma-Aldrich, SAD) rastvorenom u dejonizovanoj vodi. Svi reagensi korišćeni u ćelijskoj kulturi (PBS, McCoy's 5A medij, tripsin, fetalni goveđi serum, antibiotici) nabavljeni su od Sigma-Aldrich (SAD). PBS rastvor je pripremljen otapanjem jedne tablete u 200 mL prečišćene vode, tiazolil plavog tetrazolijum bromida (MTT) kompanije Sigma-Aldrich (SAD) primijenjen je u MTT testu. OxiSelect test ćelijskih antioksidansa

Komplet je kupljen od Cell Biolabs, Inc. (SAD). Za analizu kometa korišteni su sljedeći reagensi: hlorovodonična kiselina (HCl), agaroza niske tačke topljenja (LMP agaroza), natrijum hlorid (NaCl, natrijum hidroksid (NaOH), etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA), 2-amino{{1 }}(hidroksimetil)-1,3-propandiol (Trizma-Base), Sybr Green I gel bojenje nukleinske kiseline i Triton X-100 iz Sigma-Aldrich (SAD) kao i normalno topljenje tačka agaroza (NMP agaroza) iz Bioline (UK). Dodatno, u testu kometa osjetljivog na metilaciju, primijenjena je proteinaza K (Merck, SAD), restrikcijski enzimi (HpalI/MspI) i Tango pufer (Promega, UK). OIAshredder , RNeasy Mini Kit, RNase-Free DNase set, RT² First Strand Kit, RT²SybrGreen qPCR Mastermix, RT2Profiler PCR nizovi za oksidativni stres (PAHS 0065) iz Qiagena (Nemačka) korišćeni su u genomskim studijama.

Ovo je članak izvučen izwww.nature.com/scientificreports