Mali, ali moćni – egzosomi, novi međućelijski glasnici u neurodegeneraciji, 1. dio

Jednostavan sažetak:

Egzozomi su biološke nanočestice koje su nedavno prepoznate kao međućelijski glasnici. Sadrže teret lipida, proteina i RNK. Oni mogu prenijeti svoj sadržaj ne samo na ćelije u blizini, već i na ćelije na udaljenosti.

Egzosomi su novootkriveni međućelijski komunikacijski alat koji može osloboditi male i osjetljive vezikule u okolne stanice, isporučujući neke proteine, signalne tvari i druge tvari okolnim stanicama. Ove supstance mogu pomoći ćelijama da promene svoje stanje i čak utiču na rast, razvoj, metabolizam i druge aspekte drugih ćelija. Posljednjih godina studije su pokazale da egzosomi igraju važnu ulogu u funkciji ljudskog mozga, posebno u održavanju i poboljšanju pamćenja.

Prvo, egzosomi mogu promovirati prijenos signala između neurona. Prijenos informacija između neurona jedan je od neophodnih uvjeta za normalan rad nervnog sistema, a egzosomi imaju ulogu glasnika, koji mogu učiniti prijenos informacija između neurona glatkijim, čime se poboljšavaju moždane spoznaje i pamćenje.

Drugo, egzosomi takođe mogu regulisati metabolizam neurona. U procesu stvaranja i otpuštanja egzozoma neurona uključen je veliki broj metaboličkih procesa koji pospješuju ravnotežu i regulaciju ćelijskog metabolizma. Ovi procesi mogu ne samo poboljšati sposobnost neurona, već i pomoći u uklanjanju metaboličkog otpada i štetnih molekula i održavanju moždanih stanica zdravima.

Konačno, egzosomi također mogu pomoći neuronima da poprave oštećenje. Mnogi proteini i nukleinske kiseline koje nose egzosomi su korisni za rast, popravak i regeneraciju stanica, te mogu promovirati popravak i regeneraciju neurona, čime se poboljšava sposobnost preživljavanja moždanih stanica i jačaju centri za pamćenje i kognitivne sposobnosti.

Ukratko, postoji bliska veza između egzosoma i pamćenja. Dječje pamćenje možemo promijeniti počevši od prehrane. Aktivno vođenje strukture ishrane djece i jedenje više hrane bogate korisnim sastojcima kao što su masne kiseline, proteini i vitamini mogu promovirati proizvodnju i oslobađanje egzosoma, pomažući djeci da poboljšaju svoje sposobnosti učenja i pamćenja. Djeci se također mogu pružiti neke igre i vježbe za treniranje mozga kako bi se izazvalo i vježbalo njihovo razmišljanje, stimuliralo potencijal egzosoma i igralo bolju ulogu. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche može značajno poboljšati pamćenje jer je Cistanche tradicionalni kineski ljekoviti materijal sa brojnim jedinstvenim efektima, od kojih je jedno poboljšanje pamćenja. Djelotvornost Cistanchea proizlazi iz različitih aktivnih sastojaka koje sadrži, uključujući taninsku kiselinu, polisaharide, flavonoidne glikozide, itd. Ovi sastojci mogu promovirati zdravlje mozga na mnogo načina.

Kliknite Znaj da poboljšate kratkoročno pamćenje

Ova jedinstvena sposobnost im daje moć da moduliraju fiziologiju stanica primaoca. U mozgu, egzosomi igraju ulogu u neurodegenerativnim bolestima kao što su Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest i amiotrofična lateralna skleroza.

sažetak:

Egzozomi endosomalnog porijekla su jedna klasa ekstracelularnih vezikula koji su važni u međućelijskoj komunikaciji. Egzosome oslobađaju sve ćelije u našem tijelu i njihov teret koji se sastoji od lipida, proteina i nukleinskih kiselina ima otisak koji odražava njihovo roditeljsko porijeklo.

Egzozomalni teret ima moć da modulira fiziologiju stanica primaoca u blizini ćelija koje se oslobađaju ili ćelija na daljinu. Iskorištavanje potencijala egzosoma oslanja se na čistoću pripreme egzosoma.

Stoga su razvijene mnoge metode za izolaciju i dajemo sažeti sažetak nekoliko metoda. Unatoč izoliranosti koju nameće krvno-moždana barijera, stanice u CNS-u nisu imune na egzosomalne intruzivne utjecaje. I neuroni i egzozomi gliarelaze, često na način ovisan o aktivnostima.

Dat je kratak opis egzosoma koje oslobađaju različite stanice u mozgu i njihova uloga u održavanju homeostaze CNS-a. Obilježje nekoliko neurodegenerativnih bolesti je nakupljanje proteinskih agregata. Nedavne studije impliciraju međućelijsku komunikatorsku ulogu egzosoma u širenju pogrešno savijenih proteina, govoreći o širenju patologije.

U ovom pregledu razmatramo potencijalni doprinos egzosoma u progresiji Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti i amiotrofične lateralne skleroze.

Razumijevanje doprinosa egzosoma u patogenezi neurodegeneracije otvara polje za korištenje egzosoma kao terapeutskih agenasa za isporuku lijeka u mozak budući da egzosomi prelaze krvno-moždanu barijeru.

Ključne riječi: egzosomi; neuroni; glijalne ćelije; centralni nervni sistem (CNS); neurodegenerativne bolesti;Alchajmerova bolest; Parkinsonova bolest; amiotrofična lateralna skleroza.

1. Uvod i istorijska perspektiva

Međućelijska komunikacija je od velikog interesa za embrionalni razvoj, regeneraciju/zamjenu epitela, gametogenezu i održavanje homeostaze.

Nekoliko mehanizama komunikacije stanica-ćelija, kao što su endocitoza/egzocitoza i gutanje izbočenih citoplazmatskih mjehurića, identificirano je korištenjem ultrastrukturnih i biokemijskih studija [1–3]. Identifikovan je još jedan igrač, ekstracelularni vezikuli, ali njihova uloga u međućelijskoj komunikaciji nije odmah procijenjena [4].

Ekstracelularne vezikule otkrivene su slučajno tokom istraživanja oslobađanja enzima povezanih sa plazma membranom, ekto-ATPaze i ekto{2}}nukleotidaze u medijum ćelijske kulture. 1981. godine, Tramsand saradnici uzgajali su normalne i neoplastične ćelijske linije mišjeg i ljudskog porijekla u mediju bez seruma jer je poznato da serum ima katalitičku aktivnost ATPaze i 50-nukleotidaze.

Nakon uklanjanja plutajućih ćelija i ostataka, kondicionirani medij je centrifugiran brzinom od 310,000×g 90 min u Spinco Ti{3}} rotoru i pelete su pregledane pod elektronskim mikroskopom. Otkrivene su dvije populacije vezikula obavijenih ekstracelularnom membranom, jedna prosječnog prečnika između 500 i 1000 nm i druga, manja populacija prečnika od ~40 nm.

Ove vezikule, koje su autori prvobitno opisali kao "eksfoliirane vezikule", sadržavale su i enzimsku aktivnost 50-50-nukleotidaze i ATPaze. Osim toga, eksfolijirane vezikule su sadržavale RNK i fosfolipide koji su se razlikovali od matičnih stanica i roditeljske plazma membrane, respektivno.

Inkubacija eksfolijiranih vezikula iz C6 glioma ćelija sa 32P-preobilježenim neuroblastomaćelijama stimulirala je defosforilaciju proteina neuroblastoma uz istovremeno oslobađanje slobodnog radioaktivno označenog fosfora (32P).

Ovi podaci su utvrdili da oljuštene vezikule nisu bile samo nosioci ćelijskog otpada (enzima) već su imale i fiziološku funkciju. Tram i kolege su skovali termin egzosomi da opišu "eksfolijirane vezikule" [5] (vidi članak [6] za povijest ekstracelularnih vezikula prije 1981.). Nekoliko godina kasnije, dvije istraživačke grupe su nezavisno proučavale sudbinu transferinskog receptora u retikulocitima elektronskom mikroskopijom [7–9].

Sazrevajućim retikulocitima nije potreban transferin pa gube transferinske receptore. Obje grupe su primijetile da kultivirani retikulociti oslobađaju male vezikule prečnika ~50 nm u ekstracelularni prostor.

Ove male vezikule sadržavale su nerazgrađene transferinske receptore. Godine 1987. Johnston i saradnici su koristili termin egzosomi da opisuju male vezikule koje sadrže transferinske receptore [10]. Nakon ovih prvih godina, potencijal egzosoma je ostvaren kao novi međućelijski glasnici koji mogu modulirati fiziologiju ciljnih stanica.

Zanimljivo je da geneza egzosoma započinje endocitozom (proces identificiran 1883; pregledan od strane [3]) u stanicama, a oslobađanje egzosoma u intracelularni prostor koristi proces egzocitoze. Od njihovog početnog otkrića, sada znamo da su egzosomi podtip ekstracelularnih vezikula endocitnog porijekla s rasponom veličina od 40-160 nm u prečniku [11].

Studije praćenja pokazale su da se makromolekule endocitozuju u invaginacijama obloženim čekinjama (tj. klatrinom obloženim) ili jamicama na površini ćelije. Ove invaginacije se na kraju odvoje od plazma membrane i detektuju u citoplazmi.

Nakon gubitka čekinja (tj. klatrina), endocitozirane presvučene vezikule postaju glatke i stapaju se sa ranim endosomima za brzo recikliranje natrag na površinu ćelije (recikliranje endozoma na slici 1) [12] ili podvrgavanje sazrevanju kako bi se formirali kasni endozomi.

Rani i kasni endosomi se ponašaju kao "središta za sortiranje" kako bi na odgovarajući način usmjerili svoj sadržaj: (i) za retrogradni transport u trans-Golgi mrežu (tj., preuzimanje endosoma u TGN) [13,14]; (ii) na lizozome za razgradnju makromolekula do jednostavnih proizvoda za ponovnu upotrebu unutar ćelije [15,16]; i/ili (iii) za reciklažu na površinu ćelije kroz multivezikularna tijela [17].

Tokom sazrevanja ranih endosoma u endozome, unutrašnja endosomska membrana je podvrgnuta invaginaciji, što rezultira formiranjem intraluminalnih vezikula (sada označenih kao egzosomi). Specifični makromolekuli kao što su citosolni proteini, nukleinske kiseline i lipidi se sortiraju u egzozome u razvoju.

Kasni endosomi prepuni egzozoma identificirani su kao multivezikularna tijela koja migriraju prema plazma membrani. Nakon fuzije sa plazma membranom, multivezikularna tijela oslobađaju egzosome u ekstracelularni prostor kroz proces egzocitoze (Slika 1) [18,19]. Velika podskupina proteina koji se uzastopno regrutuju igra odlučujuću ulogu u procesu endocitoze do ranih endozoma, sazrijevanju endosoma do lateendosoma i njihovoj kasnijoj intracelularnoj sudbini (pregledano od strane [17,18,20]).

Važnost ovih proteina je naglašena njihovim gubitkom i/ili mutacijama koje uzrokuju različite bolesti. Na primjer, Strumpellin i SWIP proteini su dio WASH kompleksa koji sudjeluje u polimerizaciji aktina, kao i u fisiji i sortiranju endosoma. Mutacije gena Strumpellina uzrokuju nasljednu spastičnu paraplegiju, koju karakterizira degeneracija motornih neurona [21].

Jedna tačka mutacije (Pro1019Arg) u SWIP proteinu destabilizuje WASH kompleks. Destabilizirani WASH kompleks inhibira endolizosomalni promet, uzrokujući zgrušavanje endosoma. Defektan endosomalni promet utječe na kogniciju i funkciju motorneurona, sa simptomima opisanim kao nesindromska mentalna retardacija [22,23].

U citoplazmi egzosomi potiču iz endozoma koristeći endosomske sortirne komplekse potrebne za transport (ESCRT), također poznat kao ESCRT-ovisni mehanizam biogeneze egzosoma (pregledano u [18,20]).

Dvije grupe su nezavisno prijavile biogenezu egzosoma posredovanu lipidima, mehanizam nezavisan od ESCRT. Dva lipida identifikovana u ovim studijama su bis(monoacilglicero)fosfat/lizobisfosfatidna kiselina (BMP/LBPA) i ceramid [29,30].

Rab31 je još jedan mehanizam nezavisan od ESCRT za biogenezu egzosoma u citoplazmi. Aktivacija Rab31 stimulira stvaranje intraluminalnih vezikula [31]. Postoji još jedan mehanizam o kojem se trenutno nedovoljno govori i nije dovoljno istražen.

Ovaj mehanizam se zasniva na ultrastrukturnim zapažanjima napravljenim od kasnih 1950-ih do 1970-ih koja su pokazala da ćelijska jezgra mogu biti mjesto nastanka multivezikularnih tijela prepunih malih vezikula. Male vezikule opisane u ovim studijama su možda egzosomi, ali termin egzosom nije skovan u to vrijeme. Kilarski i Jasinski promatrali su proces nazvan nuklearni blebbing ili nuklearne ekstruzije u stanicama plivajućeg mjehura ribe smuđ, Perca fluviatilis L. (Slika 2a) [24] sa sadržajem sličnim nukleolarkarioplazmi [32].

Ovi autori su primijetili da se nuklearni blebbing može stimulirati uklanjanjem plina iz plivajućeg mjehura ribe smuđa [24]. Čini se da proces nuklearnog blebbinga ima zasluge kao mjesto porijekla egzosoma obogaćenih nukleinskim kiselinama i/orribonukleoproteinom.

Nuklearni mjehurići su bili ispunjeni malim vezikulama koje su nastale iz pojedinačnih nabora unutrašnje membrane nuklearnih mjehurića (slika 2b), što je proces sličan formiranju intraluminalnih vezikula u endosomima. Nuklearne mjehuriće ispunjene 'malim vezikulama' koje su se na kraju odvojile od jezgara kako bi postale dio citoplazme (slika 2c).

Kilarski i Jasinski u svom rukopisu nazivaju nuklearne mjehuriće kao multivezikularna tijela zbog nedostatka bolje terminologije. Nenamjerno, ovi autori su možda bili u pravu jer su naknadne studije izvijestile o prisutnosti multivezikularnih tijela u jezgrima stanica [33]. Nuklearne mjehuriće ispunjene malim vezikulama imaju morfologiju sličnu multivezikularnim tijelima koja potječu od endosoma u citoplazmi (Slike 1 i 2).

Zbog sličnosti nuklearnih multivezikularnih tijela s virusnim nukleokapsidom, istraživači su svoju pažnju usmjerili na virologiju, a fenomen nuklearnog blebbinga i njegova ćelijska funkcija ostali su nedovoljno istraženi [34].

Bez obzira na način biogeneze, egzosomi se sastoje od alipidnog dvosloja i sadrže makromolekularni sadržaj koji se sastoji od lipida, proteina i nukleinskih kiselina.

Neke od makromolekula su zajedničke egzozomima koji potiču iz svih ćelija i stoga su klasifikovani kao markeri egzosoma i koriste se kao potvrdni alat za razlikovanje eksozoma od drugih ekstracelularnih vezikula. Jedinstvene makromolekule prisutne u egzozomima često odražavaju njihovo roditeljsko porijeklo i stoga će vjerovatno biti označene kao biomarker(i).

Sve ćelije oslobađaju egzosome u ekstracelularni prostor. Iz ekstracelularnog prostora, egzosomi pronalaze svoj put u različite biološke tekućine i stižu do stanica lokalno i na udaljenosti. Ćelije kultivisane in vitro oslobađaju svoje egzosome u podloge za kulturu. Kontinuirano oslobađanje egzosoma u ekstracelularni prostor čini medij za kulturu i biološke tekućine bogatim izvorom za izolaciju egzosoma.

Egzozomi sadrže značajnu količinu kodirajućih i nekodirajućih RNK, fragmenata dvolančane genomske DNK i mitohondrijalne DNK. Tramvaji i kolege bili su prvi koji su opisali prisustvo RNK u "eksfoliranim vezikulama", mješavini egzosoma i mikrovezikula.

Utvrdili su da "eksfolirani vezikuli ili egzosomi" sadrže 5% RNK [5]. Valadi i kolege su bili prvi koji su sistematski analizirali RNK upakovane ineksozome. Egzozomalne RNK su uključivale translabilne mRNA i mikroRNK (miR) [35].

MikroRNA su klasa nekodirajućih RNK ​​(ncRNA). Dužine su od ~22 nukleotida i regulišu ekspresiju gena na post-transkripcionom nivou vezivanjem za 30-netranslated regione svojih ciljnih glasničkih RNK ​​[36]. Zanimljivo je da neke miRNA obogaćene egzozomima nisu otkrivene u matičnim ćelijama što ukazuje na selektivni sistem sortiranja/pakovanja RNK tokom biogeneze egzozoma [35,37].

Za razliku od ćelija, egzosomi sadrže malo ili nimalo ribosomske RNK, ali sadrže fragmente tRNA [38]. Razvrstavanje RNK u egzozome zavisi od (1) proteina povezanog s kompleksom utišavanja izazvanog RNA (RISC), (2) motiva sekvence RNA i vodećih proteina, (3) dodavanja nukleotida na 30 kraju miRNA, (4) ćelijske dostupnosti miRNA i (5) ceramid [39,40].

Vjerujemo da je nuklearni blebbing još jedan ćelijski proces koji omogućava diferencijalno sortiranje RNK, RNK-proteinskih kompleksa i genomske DNK u egzosome. Postoji nekoliko razloga za ovo gledište: (1) sadržaj 'intraluminalnih vezikula' bio je sličan nukleolarnoj karioplazmi [32]. 'vezikule' u nuklearnim multizikularnim tijelima (MVB II) obogaćene su RNK, kiselim i bazičnim proteinima, pa su autori smatrali ' intraluminalne vezikule' kao mjesto sinteze RNK pored tonukleola [41].

Proteins present in the vesicles may have been RNA-binding proteins and Dicer1 that were detected in exosomes [42] (unpublished data, Kumari Lab, Kansas State University, Manhattan, KS, USA). (2) Considering the nucleus as a site of exosome biogenesis can explain the presence of RNAs including precursor miRNAs (unpublished data, Kumari Lab) and double-stranded genomic DNA fragments ranging from 100 bp to >10 kbin egzosoma [43–47].

Uzgred, genomska DNK je otkrivena samo u egzosomima koji potiču iz ćelijskih linija raka, a ne u normalnim ćelijama [47]. Ćelije raka imaju abnormalni hromatin zbog preuređivanja/translokacije hromatina i možda ploidnosti [48] koja može uzrokovati fragmentaciju genomske DNK u jezgri stanica raka. Ovi fragmenti DNK se lako mogu ugraditi u MVB tipa II (i egzozome) koji se razvijaju u jezgrama. (3) Način biogeneze 'malih vezikula' u nuklearnim mjehurićima koji su opisali Kilarski i Jasinski [24] sličan je formiranju intraluminalnih vezikula u kasnim endosomima u citoplazmi.

Čvrsto vjerujemo da je prisustvo genomske DNK u egzosomima patološko i stoga se njeno prisustvo u egzosomima može koristiti kao dijagnostički alat za razvoj abnormalnih (ili raka) stanica u tijelu. (4) Povećanje broja egzosoma koje otpuštaju stanice ovisno o aktivnosti [49] je uporedivo s plinskim stanicama koje su pokazale povećano nuklearno mjehuriće nakon uklanjanja plina iz plivajućeg mjehura ribe smuđa [24].

Nedavno su mitohondrijski proteini i DNK otkriveni u egzosomima plazme nekih pacijenata oboljelih od raka, a njihovo prisustvo je povezano s agresivnošću raka [50,51].

Mitohondrijski slom se često opaža u degenerirajućim ćelijama [52,53]. Mitohondrijalne kriste oslobođene iz degenerirajućih mitohondrija mogu biti internalizirane multivezikularnim tijelima i na kraju se pakiraju u ineksosome.

Ovu ideju podržavaju ultrastrukturne slike ljudskih limfoblastoidnih ćelija i lumena acinusa prostate babuna koji su imali 'mikrovezikule' (ili egzozome) nastale razgradnjom krista mitohondrija [54].

Na osnovu gornje rasprave i podupirućih eksperimentalnih dokaza, predlažemo da heterogena priroda egzosoma potječe iz biogeneze multivezikularnih tijela i povezanih egzosoma na različitim subćelijskim lokacijama, a ne u potpunosti u citoplazmi prema našem trenutnom vjerovanju. Naš prijedlog može objasniti heterogenost egzosoma kao i neusklađenost između teorijskih proračuna i eksperimentalnih podataka o broju malih RNK ​​ili proteinskih molekula sadržanih u jednom egzosomu pročišćenom iz seruma [55].

Na osnovu teorijskih proračuna koji koriste prosječnu veličinu egzosoma, Li i kolege su predvidjeli da će svaki egzosom smjestiti približno 70-25,000 malih RNA ili proteinskih molekula.

Međutim, njihovi eksperimentalni podaci su pokazali prisustvo jedne RNA molekule po egzosomu pročišćenom iz seruma [55]. Naša hipoteza zahtijeva dalje istraživanje nuklearnog blebbinga, nuklearnih multivezikularnih tijela i biogeneze egzosoma koji sadrže RNA/ribonukleoprotein innuklearnih multivezikularnih tijela. Lipidi su važan dio membrana egzosoma i raspoređeni su asimetrično između dva lista egzosoma. Sastav lipida razlikuje se između membrane matične ćelije i membrane egzosoma.

Općenito, lipidi obogaćeni egzosomemembranama su sfingomijelin, ceramid, kolesterol i mikrodomene lipidnog rafta bogate kolesterolom, gangliozid GM3, nezasićeni lipidi i fosfatidilserin [56–58]. Egzozomalni proteini se sastoje od onih zajedničkih za većinu egzoprozoma, kao i od specifičnih specifičnih egzoprozomina. na određenu roditeljsku ćeliju.

Sadržaj proteina u svim egzosomima općenito je obogaćen za ciljane i fuzijske proteine ​​kao što su tetraspanini, integrini, chaperoneproteini, npr. proteini toplotnog šoka (Hsp60, Hsp70 i Hsp90), mali proteini HSP membranskog prometa, Rab proteini, ARF GTPaze i aneksini, proteini uključeni u formiranje multivezikularnih tijela kao što su ALIX i TSG101 [59].

Novije studije sugeriraju prisustvo proteina koji se vezuju za RNK koji formiraju RNK-protein komplekse u egzosomima [38]. Nekoliko ćelijskih procesa koji osiguravaju učitavanje proteina u egzozome su (1) ESCRT mehanizmi za proteine ​​sa određenim post-translacijskim modifikacijama kao što su ubikvitinacija, Wnt-stimulirana metilacija arginina, oksidacija, fosforilacija, glikozilacija i citrulinacija; (2) autofagija posredovana šaperonom (CMA) koja se oslanja na interakciju između proteina srodnog toplotnog šoka od 71 kDa (HSC70) i ​​proteina sa KFERQ motivom.

Nakon vezivanja HSC70 za proteine ​​s KFERQ motivom, proteini su ciljani na multivezikularna tijela. Autofagija posredovana šaperonom normalno djeluje na razgradnju proteina u lizosomima. Noviji podaci sugeriraju da CMA igra ulogu u oslobađanju egzosoma i diseminaciji proteinskih agregata posredovanoj egzozomima u nekim neurodegenerativnim bolestima [60–63].

Došlo je do eksponencijalnog povećanja istraživanja egzosoma od 1990-ih i prikupljeno je mnogo podataka o egzosomskom teretu. Stvorene su baze podataka kako bi se obezbijedio komplet egzosomalnog tereta prije nego što postane preteško upravljati velikim skupovima podataka.

Ponovljivost objavljenih podataka o egzosomima je još jedan razlog jer većina laboratorija koristi varijacije različitih metoda razvijenih za izolaciju egzosoma. Na primjer, Vesiclepedia je ručno odabrana zbirka molekularnog tereta (lipida, RNK i proteina) identificiranog u različitim klasama ekstracelularnih vezikula [64]. Vesiclepedia pruža vrijedan izvor za istraživače.

Baza podataka Vesiclepedia je javno dostupna i omogućava korisnicima da postavljaju upite i preuzimaju podatke o egzozomskom teretu na osnovu kriterija pretraživanja koje je unio korisnik. EV pedia, Exocarta, ExoRbase i EV miRNA su dodatne baze podataka koje katalogiziraju egzosomalne proteine ​​i RNK [64].

Baze podataka pokreću napomene zajednice. Podaci prikupljeni u ovim bazama podataka dobivaju se izolacijom egzosoma korištenjem niza različitih tehnika razdvajanja koje nisu uključene u bazu podataka.

Sadržaj egzosomalnog tereta se stoga može razlikovati ovisno o korištenoj metodi izolacije, što dovodi do određenog stepena dvosmislenosti u prijavljenim rezultatima. Da bi se poboljšala eksperimentalna ponovljivost i transparentnost, razvijena je baza znanja EV-TRACK sa otvorenim kodom. EV-TRACK obuhvata podatke o pripremi egzosoma i karakterizaciji egzosoma [65].

Ključna karakteristika EV-TRACK je EV-METRIC koja predstavlja izveštavanje eksperimentalnih parametara kao procenat ispunjenih komponenti liste od devet [66]. Ove komponente je odlučio konzorcij EVTRACK i smatralo se da su potrebne za nedvosmislenu interpretaciju podataka i reprodukciju eksperimentalnih podataka. Stoga je EV-METRIC dizajniran da pomogne istraživačima i recenzentima u pružanju sveobuhvatnog pregleda podataka.

2. Trenutne metode za izolaciju egzosoma

Egzosomi predstavljaju bogat resurs za otkrivanje biomarkera i za nove terapijske strategije uključujući regenerativnu medicinu. Najvažniji za uspjeh ovih ciljeva je izolacija čistih egzosoma putem reproducibilne metode.

Izolacija funkcionalno kompetentnih eksosoma je posebno kritična za potencijalne terapijske primjene. Egzozomi su pročišćeni iz različitih bioloških tekućina kao što su krv, plazma, likvor, pljuvačka, urin i mlijeko. Svaka biološka tekućina ima različite fizičke i kemijske karakteristike koje je potrebno razmotriti prije izolacije egzosoma.

U nekim slučajevima mogu biti potrebne posebne mjere opreza za izolaciju egzosoma. Krajnja primjena pročišćenih egzosoma je još jedna determinanta koja utiče na metodu izolacije egzosoma.

Do danas je razvijeno nekoliko metoda izolacije egzosoma, a neke od njih su zasnovane na karakteristikama egzosoma kao što su njihova veličina, gustoća, površinski naboj i proteini povezani s površinom egzosoma (Slika 3) [67].

Neke od trenutno korištenih metoda izolacije egzosoma navedene su u Tabeli 1. Većina njih nisu samostalne metode i zahtijevaju prethodne korake obrade nakon uzorkovanja. Istaknute metode su ukratko razmotrene u nastavku.

Slika 3. Često korištene metode za izolaciju egzosoma i njihove nizvodne primjene. Nekoliko metoda razvijenih do danas za izolaciju egzosoma zasniva se na njihovoj plovnoj gustoći, šema 1, 13 i 1,19 g/mL, metoda ultracentrifugiranja (UC) je dodatno rafinirana na izolovati čiste preparate egzosoma na osnovu njihove plovne gustine pomoću izopikničkog ultracentrifugiranja preko saharoze ili gradijenta gustine jodiksanola (DG).

Da bi se uklonio visok sadržaj proteina u proteinurijama, metoda ultracentrifugiranja je kombinovana sa hromatografijom isključivanja veličine (SEC). Vremenska ograničenja povezana sa metodom ultracentrifugiranja dovela su do razvoja metode filtracije (UF).

Propuštanje razrijeđenih uzoraka kao što su podloga za kulturu i urin kroz nano- ili mikro-membranski koncentrator omogućilo je pročišćavanje egzosoma. Začepljenje membrane i loš oporavak egzosomalnih proteina učinili su ovu metodu nepopularnom za nizvodne primjene kao što su izolacija RNK i aplikacije velike propusnosti.

Druga metoda razvijena za izolaciju egzozoma iz vrlo razrijeđenih bioloških fluida je hidrostatička filtraciona dijaliza (HFD*) u kombinaciji sa centrifugiranjem. U HFD metodi, uzorak se dijalizira kroz membranu za dijalizu s graničnom molekulskom težinom od 1000 kDa pod hidrostatskim pritiskom, omogućavajući da se neželjeni makromolekuli uklone iz uzorka, a egzosomi se izvlače centrifugiranjem.

Metoda precipitacije egzosoma zasnovana na rastvorljivosti ili disperzibilnosti i agregaciji razvijena je za simultanu obradu nekoliko uzoraka. Komercijalni kompleti za prečišćavanje egzosoma zasnovani su na ovoj strategiji.

U ovoj metodi, orasciti urina se pomiješaju sa polietilen glikolom (PEG) 6000 ili u kombinaciji sa protaminom (plus PEG35,000) i inkubiraju preko noći ili 1 h na ledu.

Dobijena zamućena smjesa se centrifugira kako bi se izvukli egzozomi koji se koriste za nizvodne analize RNK i proteina. Ostali reagensi koji se koriste za precipitaciju egzosoma su (1) 0.1M natrijum acetat pH 4,75 (metoda isoljavanja) (NaAc), (2)4- puta zapremina hladnog acetona (−20 ◦C) ( Protein Organic Solvent Precipitation i skraćeno PROSPR), (3) i mješavina PEG-a i rastvora dekstrana (do 1,5%) (dvofazna metoda koja omogućava odvajanje proteina od egzosoma).

Identifikacija egzosomalnih površinskih proteina dovela je do razvoja metoda zasnovanih na imunoafinitetnom hvatanju koristeći antitijela na površinske proteine ​​egzosoma, kao što su Tim4, aneksin, EpCAM, uobičajeni površinski protein egzosoma, CD63 i proteini toplotnog šoka (interakcija afiniteta). Afinitet za lektin (koji se veže za glikoproteine ​​na površini egzosoma) i heparin (koji se veže za heparan sulfat proteoglikane na površini egzosoma) je iskorišten za razvoj metoda izolacije egzosoma.

Nekoliko platformi kao što su magnetne perle, visoko porozni monolitni silicijum dioksid, površine plastičnih ploča, celulozni filteri, membranski afinitetni filteri, agarosesorbent i mikrofluidni uređaji korišteni su za metode pročišćavanja egzosoma zasnovane na afinitetima i imaju različite prednosti za njihovu upotrebu u dijagnostički, prognostički, kao sistemi za isporuku lijekova, te forexosomalna detekcija i analize tereta.

Adaptirano uz dozvolu Konoshenko MY, Lekchnov EA, Vlassov AV, Laktionov PP. Izolacija ekstracelularnih vezikula: Opće metodologije i najnoviji trendovi.Biomed Res Int. 2018 Jan 30; 2018:8545347. doi:10.1155/2018/8545347. PMID: 29662902; PMCID:PMC5831698; Copyright © 2022 Maria Yu. Konoshenko i dr.

Ovo je članak otvorenog pristupa koji se distribuira pod licencom Creative Commons Attribution License, koja dozvoljava neograničenu upotrebu, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je originalno djelo pravilno citirano [67].

For more information:1950477648nn@gmail.com