Mjesto ranjivosti na SARS-CoV-2 šiljak inducira široko zaštitno antitijelo protiv antigenski različitih podvarijanti Omikrona

Brza evolucija varijanti Omicron teškog akutnog respiratornog sindroma coronavirus 2 (SARS-CoV-2) naglasila je potrebu da se identifikuju antitijela sa širokim sposobnostima neutralizacije kako bi se informirale o budućim monoklonskim terapijama i strategijama vakcinacije. Ovdje smo identificirali S728-1157, široko neutralizirajuće antitijelo (bnAb) koje cilja na mjesto vezanja receptora (RBS) koje je izvedeno od osobe koja je prethodno bila zaražena WT SARS-CoV-2 prije širenja varijante zabrinutosti (VOC). S728-1157 je pokazao široku unakrsnu neutralizaciju svih dominantnih varijanti, uključujući D614G, Beta, Delta, Kappa, Mu i Omicron (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/ BL.1/XBB). Nadalje, S728-1157 je štitio hrčke od in vivo izazova sa WT, Delta i BA.1 virusima. Strukturna analiza je pokazala da ovo antitijelo cilja na epitop klase 1/RBS-A u domeni vezivanja receptora putem višestrukih hidrofobnih i polarnih interakcija sa svojom regijom 3 koja određuje komplementarnost teškog lanca (CDR-H3), pored uobičajenih motiva u CDR-H1/ CDR-H2 antitela klase 1/RBS-A. Važno je da je ovaj epitop bio lakše dostupan u otvorenom stanju i stanju prefuzije, ili u heksaprolinom (6P)-stabiliziranim šiljastim konstruktima, u poređenju sa diprolinskim (2P) konstruktima. Sveukupno, S728-1157 pokazuje širok terapeutski potencijal i može dati informaciju o ciljanom dizajnu vakcine protiv budućih varijanti SARS-CoV-2.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Uvod

Od početka pandemije u decembru 2019. godine, virus teškog akutnog respiratornog sindroma korona virus 2 (SARS-CoV-2) doveo je do preko 660 miliona slučajeva korona virusne bolesti 2019. (COVID-19) i preko 6,5 miliona smrtnih slučajeva širom sveta. Iako su brzi razvoj i distribucija vakcina i terapeutika u velikoj mjeri obuzdali učinak COVID-19, pojava cirkulirajućih varijanti zabrinutosti (VOC) i dalje predstavlja veliku prijetnju zbog potencijala za daljnju imunološku evaziju i povećana patogenost. Varijanta D614G je bila najranija varijanta koja se pojavila i nakon toga je postala univerzalno rasprostranjena. U poređenju sa WT, varijanta D614G je pokazala povećanu prenosivost, a ne povećanu patogenost i stoga nije vjerovatno da će smanjiti efikasnost vakcina u kliničkim ispitivanjima (1). Između pojave D614G do oktobra 2021., 4 dodatna značajna VOC-a su se razvila širom svijeta, uključujući Alpha, Beta, Gamma i Delta. Među ovim varijantama, Delta je postala ozbiljna globalna prijetnja zbog svoje prenosivosti, povećane ozbiljnosti bolesti i djelomične imunološke evazije, što pokazuje smanjena sposobnost poliklonskog seruma i mAbs da neutraliziraju ovaj soj (2-6). Ubrzo nakon toga, u novembru 2021., varijanta Omicron je identificirana i najavljena kao novi VOC. Ova varijanta je imala najveći broj mutacija do sada i činilo se da se širi brže od prethodnih sojeva (7, 8). Trenutno postoji širok spektar podvrsta Omicron koji dovode do novih slučajeva COVID-19, pri čemu BQ.1, BQ.1.1 i XBB.1.5 postaju dominantni u odnosu na BA.5 i čine većinu novih slučajeva širom svijeta u to vrijeme pisanja. Omicron varijante mogu izbjeći prepoznavanje od strane imuniteta povezanog s vakcinom COVID-19 u različitim mjerilima, čime se značajno smanjuje neutralizirajuća moć serumskih antitijela kod rekonvalescentnih, potpuno mRNA vakcinisanih pojedinaca i pojedinaca pojačanih novim WT/BA.5 bivalentom mRNA vakcina (9, 10). Slično, Omicron varijante su bile u stanju da izbjegnu vezivanje nekoliko terapijskih mAbs s odobrenjem za hitnu upotrebu (EUA), iako je prethodno pokazano da su učinkoviti protiv ranijih VOC (10-12). Zbog smanjene neutralizacije protiv Omikrona i kontinuirane prijetnje budućih VOC-a, postoji hitna potreba da se identifikuju široka i moćna neutralizirajuća antitijela koja mogu zaštititi od različitih, evoluirajućih SARS-CoV-2 linija. U ovoj studiji identifikovali smo moćno mAb-reaktivno (RBD-reaktivno) mAb iz periferne krvi SARS-CoV-2-rekonvalescentne osobe koja je efikasno neutralisala Alfa, Beta, Kappa, Delta, Mu, i Omicron varijante (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 i XBB). Ovo mAb, S728-1157, značajno je smanjilo BA.1 Omicron, Delta i WT virusno opterećenje u plućima i nosnoj sluznici nakon in vivo izazova kod hrčaka. S728-1157 vezuje mjesto vezivanja receptora (RBS) koje je potpuno izloženo kada je RBD na šiljku u konformaciji nagore. mAb koristi motive pronađene u CDR-H1 i CDR-H2 koji su zajednički za IGHV3-53/3-66 klasa 1/RBS-A antitijela (13, 14), ali i kroz opsežne jedinstvene kontakte sa CDR -H3 da zaobiđe mutacije u šiljcima VOC. Ovo sugerira da bi racionalni dizajn budućih pojačanja cjepiva koji pokrivaju varijante Omicrona trebao biti modificiran kako bi se prikazao stabilizirani skok u konfiguraciji uglavnom naviše kako bi se optimalno inducirala mAb klase 1/RBS-A koja imaju slične karakteristike CDR-H3.

cistanche koristi - jača imuni sistem

Rezultati

Izolacija RBD-reaktivnih mAbs koji pokazuju različite obrasce neutralizacije i potencije. Prije širenja Omicron loza, prethodno smo okarakterizirali 43 mAbs koji ciljaju različite epitope na proteinu šiljaka, uključujući N-terminalni domen (NTD), RBD i podjedinicu 2 (S2). Nijedno od ovih antitijela nije bilo u stanju da neutralizira SARS-CoV-2 varijante koje su cirkulirale u to vrijeme (15). U ovoj studiji, dodatni panel RBD-reaktivnih mAbs je eksprimiran od 3 osobe sa visokim odgovorom koji su postavili robusne anti-spike IgG odgovore, kao što je prethodno definirano (16) (Dodatne tabele 1 i 3; dodatni materijal dostupan na internetu uz ovaj članak; https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). Iako je udio B-ćelija koje se vezuju za RBD bio sličan kod osoba sa visokim odgovorom u poređenju sa osobama srednjeg i niskog odgovora (Slika 1, A–C), stope somatskih hipermutacija teškog lanca bile su značajno veće u grupi sa visokim odgovorom (Slika 1 , D i E), što sugerira da ove osobe mogu imati najveći potencijal za stvaranje moćnih unakrsno reaktivnih mAbs (16). Ova antitijela su dalje istražena protiv RBD mutanata kako bi se identificirale njihove klasifikacije epitopa (17). Među 14 RBD-reaktivnih mAbs, identificirali smo 4 mAbs klase 2, 2 klase 3 mAbs i 8 neklasificiranih mAbs koji su pokazali malo ili nikakvo smanjenje vezivanja protiv bilo kojeg testiranog ključnog RBD mutanata (Slika 1F). Treba napomenuti da antitela klase 2, klase 3 i klase 4 približno odgovaraju epitopima RBS BD, S309 i CR3022 definisanim u prethodnim studijama (13, 18). RBD mAbs klase 2 i 3 nisu prepoznali multivarijantni RBD mutant koji sadrži zamjene K417N/E484K/L452R/ N501Y, umjetno dizajniran RBD koji uključuje ključne mutacije za bijeg virusa (17, 18), niti su pokazali bilo kakvu unakrsnu reaktivnost na RBD SARS-CoV-1 i bliskoistočnog respiratornog sindroma (MERS)-CoV (Slika 1F). Funkcionalno, RBD mAbs klase 2 i 3 potentno su neutralisala D614G i Delta varijante, ali je aktivnost neutralizacije bila ograničenija protiv Beta, Kappa i Mu (Slika 1G). Nijedno od ispitanih antitijela klase 2 ili 3 nije neutraliziralo nijednu testiranu varijantu Omicron-a.

Nasuprot tome, većina neklasifikovanih mAbs vezala se za multivarijantnu RBD i unakrsno je reagovala na SARS-CoV-1 RBD (slika 1F). Među njima smo identificirali 3 mAbs, S451-1140, S626-161 i S728-1157, koji su pokazali visoku potenciju neutralizacije protiv D614G i unakrsno neutraliziranih Beta, Delta, Kappa, Mu i Omicron BA.1 sa 99% inhibitornom koncentracijom (IC99) u rasponu od 20-2.500 ng/mL (Slika 1G). S obzirom na široku potenciju neutralizacije ova 3 mAbs, pored platforme za analizu plaka, izvršili smo i aktivnost neutralizacije protiv autentičnog BA.2.75, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 i XBB virusi koji koriste test neutralizacije smanjenja fokusa (FRNT) (Slika 1G). Od njih, S728-1157 je pokazao visoke neutralizacijske aktivnosti protiv panela Omicron varijanti uključujući BA.1, BA.2, BA.4 i BA.5, sa IC99 do 100 ng/mL mjereno pomoću test plaka. Sličan scenario je primijećen korištenjem FRNT, gdje je S728-1157 zadržao svoju visoku neutralizaciju aktivnosti protiv BA.2.75, BL.1, BA.4, BA.5 i XBB sa IC50 u rasponu od 8-300 ng /mL (Slika 1G). S451-1140 je snažno neutralizirao BA.1, BA.2, BA.2.75 i BL.1, ali ne i BA.4 i BA.5, kao što je uočeno na obje platforme za analizu neutralizacije. S druge strane, S626-161 nije pokazao neutralizirajuću aktivnost protiv Omicron varijanti izvan varijante BA.1 (Slika 1G). Iako je S626-161 imao nižu potenciju neutralizacije protiv testiranih VOC-a od druga 2 antitijela, to je bilo jedino mAb koje je pokazalo unakrsnu reaktivnost ne samo na SARS CoV-1 RBD, već je također moglo neutralizirati šišmiša korona virusi WIV-1 i RSSHC014 (Slika 1, F i G). Ovi podaci sugeriraju da S626-161 prepoznaje konzervirani epitop koji je zajednički između ovih arbovirusnih linija, ali je odsutan u BA.2 i kasnijim sojevima. Dodatno, u poređenju sa S728-1157 i S451-1140, S626-161 ima duži CDR-H3 koji bi mogao pružiti poboljšanu sposobnost prepoznavanja visoko očuvanog dijela ostataka koji se dijele među arbovirusima, kao što je opisano u prethodnoj studiji (19) (Dopunska slika 1). Upoređujući varijabilne gene teškog (IGHV) i lakog lanca (IGLV ili IGKV) ova 3 mAbs sa dostupnom bazom podataka o mAbs neutralizirajućim SARS-CoV-2 (13, 15, 20–27), otkrili smo da teški lanac varijabilni geni koje koriste S728-1157 (IGHV3-66), S451-1140 (IGHV3-23) i S626-161 (IGHV4-39) imaju ranije je prijavljeno da kodira nekoliko snažno neutralizirajućih SARS-CoV-2 antitijela koja ciljaju RBD (21, 22, 28, 29). Međutim, samo S728-1157 je imao jedinstvene parove varijabilnih gena teškog i lakog lanca koji nisu prijavljeni u bazi podataka (Dopunska tabela 3), što ukazuje da nije javni klonotip.

Slika 1. Karakterizacija RBD-reaktivnih mAbs izolovanih od COVID-19-rekonvalescentnih osoba

Ova 3 mAb (S451-1140, S626-161 i S728-1157) su dodatno okarakterizirana kako bi se odredila širina njihovog vezivanja protiv SARSCoV-2 VOC (Slika 2, A i B) . Pokazalo se da je prefuzijski stabiliziran šiljak koji sadrži 2-prolinske zamjene u podjedinici S2 (2P; diprolin) superiorniji imunogen u poređenju sa WT šiljkom i osnova je nekoliko trenutnih SARS-CoV-2 vakcine, uključujući vakcine zasnovane na mRNA (30, 31). Nedavno je objavljeno da spike protein stabiliziran sa 6 prolina (6P; heksaprolin) pojačava ekspresiju i čak je stabilniji od originalnog diprolinskog konstrukta; kao rezultat toga, predložena je za upotrebu u sljedećoj generaciji vakcina protiv COVID-19 (32, 33). Da bi se utvrdilo da li postoje razlike u antigenosti između diprolinskih i heksaprolinskih šiljastih konstrukcija, oba imunogena su uključena u naš test panel. Kao što je mjereno ELISA-om, otkrili smo da su 3 mAbs vezala 6P-WT spike antigen u većoj mjeri u odnosu na WT-2P spike (Slika 2, A i B). Sva 3 mAb pokazala su uporedivo vezivanje za šiljke Alfa, Beta, Gama i Delta virusa, u odnosu na WT-2P (Slika 2, A i B). Međutim, reaktivnost vezivanja ovih 3 mAbs je značajno smanjena u odnosu na panel antigena porodice Omicron (Slika 2, B i C). S451-1140 vezivanje je bilo osjetljivo na mutacije pronađene u BA.1 i BA.2, što je rezultiralo velikim smanjenjem vezivanja i 31-putostrukim smanjenjem neutralizacije u odnosu na ove varijante u poređenju sa WT-2 P antigen i D614G virus, respektivno (slika 2B). Unakrsno neutralizirajuće mAb sarbecovirusa, S626-161, također je pokazalo 1.2- do 3.5-puta smanjeno vezivanje za šik BA.1 antigen, što može predstavljati {{45} } puta smanjenje aktivnosti neutralizacije protiv BA.1 (Slika 1G i Slika 2, B i C). Za najmoćnije široko neutralizirajuće antitijelo (bnAb), S728-1157, vezivanje za Omicron antigene je smanjeno u manjoj mjeri (u rasponu od 1.1- do 4.4-puta) u poređenju sa WT-2P šik i nije utjecao na aktivnost neutralizacije (Slika 1G i Slika 2, B i C). Značajno smanjenje Omicron-neutralizirajućeg mAb vezanja za BA.1 šiljak može biti posljedica promjena u njegovoj mobilnosti i povezano sa zbijenim pakiranjem Omicron 3-RBD-down struktura i preferencije za 1- up RBD koji pomažu u izbjegavanju antitijela, kao što je objavljeno u prethodnoj studiji (34). Stabilizirajuće mutacije 2P i 6P također imaju različite efekte u varijantama Omicron gdje su sva 3 mAbs pokazala preko 2.8-putostruko povećano vezivanje za šiljak BA.1-6P u poređenju sa BA.1-2P verzija, ali samo neznatno povećano vezivanje za spike BA.2 i BA.4/5 6P verzije u poređenju sa njihovim 2P verzijama za 1,2 × do 1,4 ×, što sugerira nešto bolju dostupnost Omicron-neutralizirajućih mAbs verzijama heksapola, posebno za šiljak BA.1 konstrukciju. Pored ELISA-e, interferometrija biosloja (BLI) je korištena za kvantifikaciju brzine vezivanja i konstanti ravnoteže (kon, koff i KD) ovih 3 mAbs na panelu šiljastih antigena (dodatna slika 2). Stope prepoznavanja kon stope vezivanja antigena fragmenta (Fab) za heksaprolinske šiljke bile su 1.5- do 3.3-puta brže u poređenju sa diprolinskim šiljcima (dodatna slika 2, B i C), pokazujući da antitijela su vezana za 6P konstrukt brže nego za 2P konstrukt. Ovo bi se moglo očekivati ​​da su epitopi bili dostupniji na RBD u otvorenom stanju na heksaprolinskom šiljku. Osim za S626- 161, Fabs se odvajao od heksaprolinskog šiljka sporije (imali su niži koff) od diprolina, tako da je ukupni KD pokazao da su se S728-1157 i S451-1140 vezali za heksaprolinski šiljak sa većim afinitetom (dodatna slika 2, B i C). Povećanje vezivanja za heksaprolinski šiljak bio je još uočljiviji za intaktni IgG po modelu interakcije 1:2 kao što su pokazali S728-1157 i S451- 1140 mAbs, u skladu sa izlaganjem više epitopa sa 6P stabilizacijom koja omogućava poboljšana avidnost (dodatna slika 2, A i C). Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da ciljani epitopi mogu biti relativno pristupačniji na 6P-stabiliziranom šiljku kada je RBD u otvorenom stanju. Zatim su izvršene strukturne analize kako bi se potvrdila ova pretpostavka.

Slika 2. Širina vezivanja Omicron-neutralizirajućih mAbs

Strukturna analiza široko neutralizirajućih mAbs. Kao prva aproksimacija vezanih epitopa, ELISA kompetitivni test je korišten da se utvrdi da li se ova 3 široko neutralizirajuća mAb preklapaju s našim trenutnim panelom mAb, kolekcijom mAb sa poznatim specifičnostima epitopa iz prethodnih studija (15, 25, 35) , i 2 druga mAb koja su trenutno u kliničkoj upotrebi, LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) i REGN10933 (Regeneron) (37). Vezna mjesta S451-1140 i S728-1157 djelomično su se preklapala sa CC12.3 (23, 25), neutralizirajućim antitijelom klase 1, i većinom antitijela klase 2, uključujući LY-CoV555 i REGN10933, ali ne sa antitelima klase 3 i klase 4 (slika 3A). S626-161 je dijelio značajno preklapanje u regiji vezivanja sa klasom 1 CC12.3, nekoliko antitijela klase 4, uključujući CR3022, i drugim neklasifikovanim antitelima, dok je imao delimično preklapanje sa nekoliko antitela klase 2 i jedne klase 3 (Slika 3A). Analogno tome, kompetitivni BLI test je otkrio da se S451-1140 i S728-1157 snažno takmiče jedni s drugima u vezivanju za šiljak WT-6P, dok S626-161 nije (dodatna slika 3). Sve u svemu, ovi podaci sugeriraju da S451-1140 i S728-1157 prepoznaju slične epitope koji se razlikuju od S626-161.

Slika 3. Mehanizam široke neutralizacije S728-1157

Antitijelo S728-1157 je kodirano od strane IGHV3-66 i posjedovalo je kratku regiju 3 koja određuje komplementarnost (CDR-H3). Posebno, mAbs koja vezuju RBS u načinu vezivanja 1 (tj. RBS-A ili mjesto klase 1), tipizirano sa CC12.1, CC12.3, B38 i C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39), imaju tendenciju da koriste IGHV3-53 ili 3-66 i osjetljivi su na VOC mutacije (40). Međutim, CDR-H3 regija S728-1157 se veoma razlikuje od drugih antitijela ove klase, što potencijalno objašnjava njegovu širu aktivnost. Da bismo razumjeli strukturnu osnovu široke neutralizacije od strane S728-1157 na ovom epitopu, riješili smo krio-elektronsku mikroskopsku (cryo-EM) strukturu (slika 3B) IgG S728-1157 u kompleksu sa šiljkom WT{ {31}}P-Mut7, verzija spike WT-6P koja posjeduje interprotomernu disulfidnu vezu na C705 i C883, na približno 3,3 Å globalne rezolucije (dodatna slika 4E). Koristeći proširenje simetrije, fokusiranu klasifikaciju i metode preciziranja, postigli smo lokalnu rezoluciju na RBD-Fv interfejsu na približno 4 Å (dodatna slika 4E i dopunska tabela 8). Kristalna struktura S728-1157 Fab je određena pri rezoluciji 3,1 Å i korištena za izgradnju atomskog modela na RBD-Fv interfejsu. Naše strukture potvrđuju da je S728-1157 vezao epitop RBS-A (ili klase 1) u RBD-up konformaciji (slika 3B i dopunska slika 4E), slično kao i drugi IGHV3-53/{{55} } antitela (slika 3C). Sterička blokada vezivnog mjesta za angiotenzin-konvertirajući enzim 2 (ACE2) od strane S728-1157 objašnjava njegovu visoku neutralizaciju protiv SARS-CoV-2. Motiv 32NY33 i motiv 53SGGS56 (23) u S728-1157 CDR-H1 i -H2 stupaju u interakciju sa RBD-om na skoro isti način kao CC12.3 (dodatna slika 4, B i C). Međutim, u poređenju sa VH 98DF99 u CC12.3, VH 98DY99 u S728-1157 CDR-H3 formira opsežnije interakcije, uključujući i hidrofobne i polarne interakcije, sa RBD, što može objasniti široku neutralizaciju protiv VOC (slika 3D i dopunske tabele 6 i 7). Diglicin VH 100GG101 u S728- 1157 CDR-H3 također može olakšati ekstenzivnije vezivanje u poređenju sa VH Y100 u CC12.3, vjerovatno zbog fleksibilnosti ostataka glicina koji dovode do drugačije konformacije vrha CDR-a -H3 petlja i relativni pomak ostataka na 98DY99.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Iako Omicron VOC imaju opsežne mutacije u RBD-u, većina ovih ostataka ne stupa u interakciju sa S728-1157, jer se vezivanje još uvijek opaža (dopunska slika 4A). Od našeg šiljastog WT-6P-Mut7 + Fab S{5}} modela, Y505 do VL Q31, i E484 do VH Y99 predviđa se da stvaraju vodonične veze (dodatna slika 4D i dopunska tabela 6 ), koji imaju potencijal da budu poremećeni Omicron mutacijama Y505H i E484A. Međutim, mutacija Y505H bi i dalje omogućila vodoničnu vezu sa VL Q31, a mutacija E484A bi dodala još jedan hidrofobni bočni lanac u blizini hidrofobnih ostataka VL Y99, F456 i Y489. Ovi kontakti mogu djelomično objasniti mehanizam koji omogućava S728-1157 da zadrži neutralizirajuću aktivnost, iako smanjenu, protiv šiljastog BA.1 antigena (Slika 1G i Slika 2B). Antigen BA.1 je, zauzvrat, verovatno povezan sa Omicron mutacijama koje menjaju konformacioni pejzaž proteina šiljaka (34). Međutim, nekoliko somatski mutiranih ostataka, tj. VH L27, L28, R31, F58 i VL V28 i Q31, u S728-1157 uključeno je u interakciju sa SARS-CoV-2 RBD (dodatna slika 1 i Dodatna tabela 7), što takođe može doprineti njegovoj širokoj reaktivnosti u poređenju sa CC12.3. Sve u svemu, naše strukturne studije su otkrile osnovu široke neutralizacije S728-1157 koja može prihvatiti većinu mutacija u SARS-CoV-2 VOC-ima.

Slika 4. Zaštitna efikasnost bnAbs protiv SARS-CoV-2 infekcije kod hrčaka.

S728-1157 smanjuje replikaciju SARS-CoV-2 BA.1 Omicron, Delta i WT SARS-CoV-2 kod sirijskih hrčaka. Da bismo procijenili zaštitnu efikasnost naših široko neutralizirajućih mAb, koristili smo model infekcije zlatnog sirijskog hrčka koji se naširoko koristi za SARS-CoV-2. Hrčci su primili 5 mg/kg naših test mAbs ili kontrolu izotipa usmjerenu na irelevantan antigen (glikoprotein ebolavirusa) intraperitonealnom injekcijom 1 dan nakon infekcije SARS CoV-2 virusima. Tkivo pluća i nosa sakupljeno je 4 dana nakon infekcije (Slika 4A). Terapeutska primjena S728-1157 rezultirala je smanjenim titarima varijanti WT, BA.1 Omicron i Delta u nosnim čahurama i plućima zaraženih hrčaka (Slika 4, B–D). Zanimljivo je da je efekat S728-1157 na pluća bio dramatičan, smanjujući virusno opterećenje WT i BA.1 Omicron za približno 104PFU, pri čemu su virusni titri varijante BA.1 Omicron potpuno ukinuti (Slika 4C). Za razliku od in vitro neutralizacije (Slika 1G), S451-1140 nije smanjio replikaciju virusa BA.1 Omicron u plućnim i nazalnim turbinama, što ukazuje na nepovezanost između in vitro neutralizacije i in vivo zaštite za ovaj klon (Slika 4E) . Za poređenje, primjena S626-161 rezultirala je marginalno značajnim smanjenjem titara plućnih virusa nakon izazivanja WT i BA.1 (Slika 4, F i G). Ovi podaci naglašavaju da je, da bi se precizno definisala široka zaštitna mAb, potrebna evaluacija efikasnosti zaštite paralelno sa aktivnošću neutralizacije. U nastavku, bit će zanimljivo ispitati u kojoj mjeri je zaštitni kapacitet S728-1157 zavisan od Fc. Sve u svemu, S728-1157 predstavlja obećavajuće mAb sa širokom efikasnošću neutralizacije protiv SARS CoV-2 varijanti koje su sposobne dramatično smanjiti replikaciju WT, Delta i BA.1 in vivo.

Infekcija SARS-CoV-2 rijetko izaziva snažne mAbs poput S728-1157 unakrsne neutralizacije. S obzirom na unakrsnu neutralizaciju i profilaktički potencijal S728-1157, pokušali smo procijeniti da li se antitijela slična S728–1157 obično induciraju među poliklonskim odgovorima kod pacijenata sa SARS-CoV-2. Da bismo to procijenili, izveli smo kompetitivne ELISA testove koristeći rekonvalescentni serum za otkrivanje titara anti-RBD antitijela koja bi se mogla nadmetati za vezivanje sa S728-1157 (Slika 5A). Subjekti su podeljeni u 3 grupe na osnovu veličine odgovora antitela, kao što je prethodno definisano (15, 16). Iako su osobe sa visokim i umjerenim odgovorom imale veće titre S728-1157-kompetitivnih serumskih antitijela u poređenju sa onima sa niskim odgovorom (Slika 5B), titri su bili prilično niski u svim grupama, što sugerira da je neuobičajeno dobivanje visokih nivoa S{{ 18}}–slična antitijela u poliklonskom serumu nakon infekcije WT SARS-CoV-2. Pored S728-1157, testirali smo konkurenciju rekonvalescentnog seruma sa drugim mAbs, uključujući S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022 i CC12.3. Slično kao kod S728-1157, primijetili smo relativno niske titre antitijela koja se takmiče sa S451-1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933 i CC12.3 u poliklonskom serumu većine rekonvalescenta pojedinaca (Slika 5, C–F i H). Bez obzira na to, osobe sa visokim odgovorom obično imaju značajno veće titre u odnosu na neutralizirajuća mAb od onih sa niskim odgovorom (Slika 5, B–F i H). Nasuprot tome, antitijela koja ciljaju na mjesto epitopa CR3022 bila su izraženija kod rekonvalescentnih osoba, što sugerira obogaćivanje RBD antitijela klase 4 u poliklonskom serumu (Slika 5G). Primjetno je da nije bilo značajne razlike u titrima CR3022 u 3 grupe koje su odgovorile, što sugerira da su antitijela na CR3022-mjesto konzistentno inducirana tokom WT SARS-CoV-2 infekcije kod većine osoba. Zanimljivo, u poređenju sa CC12.3, S728-1157 je detektovan na 4-puta nižim nivoima u serumu osoba sa visokim odgovorom. Stoga, uprkos tome što se antitijela klase 1 često induciraju prirodnom infekcijom i vakcinacijom (14, 20, 28, 29, 41–43), naši podaci sugeriraju da su antitijela slična S728–1157 koja predstavljaju podskup ove klase relativno rijetka.

Dodatno, ispitali smo razliku u reaktivnosti na 2P naspram 6P-stabilizirani šiljak u našim rekonvalescentnim kohortnim serumima (Slika 5, I-K). Otkrili smo da su sve 3 grupe koje su odgovorile postavile anti-spike reaktivna antitijela protiv 6P-stabiliziranih šiljastog WT-a u većoj mjeri nego 2P-stabiliziranog šiljka WT, faktorom od 6-do-11- puta (slika 5J), što ukazuje da glavni antigeni epitopi su bili bolje izloženi ili stabilizirani na 6P-stabiliziranom antigenu. Koristeći iste uzorke, osobe s visokim i umjerenim odgovorom su također imale niže titre anti-spike antitijela protiv BA.1-2P od BA.1-6P, za 4 do 5 puta (Slika 5K). Treba napomenuti da su osobe sa slabim odgovorom imale manju promjenu u reaktivnosti vezivanja na šiljak BA.1 Omicron-2P i 6P (2-smanjenje puta) u poređenju sa WT-2P i 6P šiljkom ({ {28}}smanjenje puta) (Slika 5, J i K), što sugerira da serumsko antitijelo protiv BA.1 Omicron-reaktivnih epitopa može biti ograničenije kod subjekata sa slabim odgovorom. Sve u svemu, ovi podaci sugeriraju da postoji poboljšano poliklonsko vezivanje izazvano prirodnom infekcijom za 6P-stabilizirani šiljak, kako za WT tako i za Omicron viruse.

Antitijela slična S728–1157 optimalno se induciraju u kontekstu hibridnog imuniteta. Primarna infekcija SARS-CoV-2 bez vakcinacije postala je rijetka u trenutnom globalnom okruženju, a nekoliko studija je izvijestilo da se imunitet na SARS-CoV-2 razlikuje kod pojedinaca sa specifičnom istorijom vakcinacije/infekcije. Kao rezultat, zatim smo pokušali da istražimo koje bi uobičajene izloženosti, osim WT infekcije samo sa SARS-CoV-2 predaka, efektivno inducirali antitijela slična S728–1157 u plazmi od monovalentnih mRNA baziranih vakcina sa i bez prethodnog infekcija. Neophodan biouzorak smo dobili od istraživačke kohorte Zaštite povezane sa brzim imunitetom na SARS-CoV-2 (PARIS), koja je pratila zdravstvene radnike uzdužno od početka pandemije (44). Odabrali smo uzorke plazme od potpuno imuniziranih (2 × vakcinisana) učesnika studije sa i bez infekcije, kao i od pojačanih učesnika (3 × vakcinisana) sa i bez infekcije. Osim toga, uključili smo i uzorke učesnika studije koji su primili dvovalentnu mRNA vakcinu (predak WA1/2020 plus Omicron BA.5) (slika 6A i dopunska tabela 2). Probojne infekcije kod učesnika koji su primili dopunsku vakcinaciju dogodile su se u vrijeme kada su Omicron loze raselile sve druge loze SARS-CoV-2 u gradskom području New Yorka. Otkrili smo da su dvostruko vakcinisane osobe imale najniže titre S728-1157 kompetitivnih serumskih antitijela među 5 grupa testiranih uzoraka (Slika 6B). Značajno je da su ovi nivoi bili slični onima uočenim za našu rekonvalescentno nevakcinisanu kohortu (svi reagovali; Slika 5B). Za usporedbu, osobe s istorijom prirodne infekcije, uključujući rekonvalescentne osobe s 2 od 3 doze vakcine, i osobe koje su doživjele probojnu infekciju i primile bivalentni booster, pokazale su značajno veće nivoe izazivanja S728-1157 u poređenju sa neinficiranim ali vakcinisane osobe (slika 6B). Iako je neinficirana 3-dozna grupa pokazala samo neznatan porast u poređenju sa grupom doze 2-, upareni podjeli prema vrsti vakcine su pokazali da homologne treće doze BNT162b2 i mRNA-1273 značajno povećavaju S{{ 38}}kao neutralizirajući titar antitijela za 2,72 × i 2,85 ×, respektivno (Slika 6, C i D). Da napomenemo, među učesnicima sa 3 ukupna kontakta sa šiljkom na bilo koji način, titri antitijela poput S728-1157- su bili 3 puta veći kod rekonvalescentnih dvostruko vakcinisanih u poređenju sa trostrukim vakcinisanim osobama koje nisu bile zaražene, što sugerira da je SARS-CoV{{ 51}} infekcija optimalnije izaziva ovaj klonotip. Među grupama hibridnog imuniteta, primijetili smo da je većina pojačanih pojedinaca s probojom koji su primili bivalentnu dozu dopunske vakcine imala samo neznatno veći titar S728-1157 antitela u poređenju sa preomikronskim rekonvalescentnim vakcinisanim grupama, što sugeriše da je S{{53 }} titar se vjerovatno približavao platou nakon 3 ekspozicije. Također smo istraživali titre poliklonskih antitijela koja su se nadmetala sa CC12.3 i CR3022 pored S728-1157. Sve osobe su pokazale relativno visoke titre CC12.3- i CR3022-antitijela, nezavisno od broja i vrste izloženosti (dopunska slika 5), ​​suprotno onome što smo primijetili za S728-1157- poput antitela. Sve u svemu, ovi podaci ukazuju da infekcija SARS-CoV-2 i vakcinacija mRNA doprinose indukciji antitijela poput S728-1157-, pri čemu infekcija igra dominantniju ulogu kod vakcinisanih osoba.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Konačno, u poređenju odgovora na 2P- nasuprot 6P-stabiliziranom skoku u kohorti vakcinacije mRNA, otkrili smo da je većina grupa izazvala slične nivoe antitijela protiv oba konstrukta. Izuzetak od ovoga bila je neinficirana trostruko vakcinisana grupa, koja je pokazala statistički veću, iako samo neznatno povećanu, reaktivnost na 2P u poređenju sa 6P-stabiliziranim šiljkom (slika 6E). Ovi podaci sugeriraju da za razliku od prirodne infekcije (Slika 5, J i K), sama vakcinacija proizvodi poliklonalni odgovor koji je više ograničen na epitope u konstrukciji Spike-2P, u skladu sa Spike{{12 }}P formulacija trenutnih vakcina. Konačno, ovi nalazi podržavaju ideju da bi 6P-stabilizacija budućih SARS-CoV-2 vakcina mogla biti od velike koristi u izazivanju široko zaštitnih klonotipova antitijela kao što je S728-1157.

Slika 5. Konvalescentna serumska konkurencija antitijela sa široko neutralizirajućim RBD-reaktivnim mAbs i poređenje serumskog odgovora antitijela na 6P- naspram 2P-stabiliziranih šiljaka

Slika 6. Konkurencija serumskih antitijela vakcinisanih mRNA sa S728-1157 neutralizirajućim RBD-reaktivnim mAbs i poređenje serumskog odgovora antitijela na 6P- naspram 2P-stabiliziranih šiljaka.

Diskusija

U ovoj studiji identificirali smo moćni bnAb izoliran iz memorijske B ćelije osobe koja se oporavila od infekcije SARS-CoV-2 tokom početnog talasa pandemije COVID-19. Ovaj bnAb, S728- 1157, održao je značajnu vezujuću reaktivnost i imao dosljednu neutralizirajuću aktivnost protiv svih testiranih SARS-CoV-2 VOC, uključujući Omicron BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 i XBB, i bio je u stanju da značajno smanji infektivne virusne titre nakon Delta i BA.1 infekcije kod hrčaka.

Otkrili smo da rekonvalescentni serum iz naše kohorte sadržava niske koncentracije antitijela koja se takmiče sa S728-1157 (antitijelo klase 1/ RBS-A) i mAbs epitopa klase 2. Ovo sugerira da je S728-1157 donekle jedinstven u odnosu na druga antitijela koja ciljaju epitope klase 1 i rijetko se inducira u RBD-specifičnoj memoriji B ćelija. Umjesto toga, činilo se da naša prirodna kohorta infekcije indukuje antitijela koja ciljaju epitop CR3022 (klasa 4); antitijela ove specifičnosti su često unakrsno reaktivna, ali manje neutralizirajuća od antitijela koja ciljaju RBS (14, 17). Ovi podaci su komplementarni našim prethodnim nalazima koji pokazuju da obilje antitijela klase 3/S309 u rekonvalescentnim serumima može doprinijeti neutralizirajućem djelovanju protiv alfa i gama varijanti, dok nedostatak antitijela klase 2 može objasniti smanjenu sposobnost neutralizacije protiv Delta (15) . Bez obzira na to, širina aktivnosti većine ovih RBS-ciljanih antitela (RBS-A/klasa 1, RBS-B, C/klasa 2, i RBS-D, S309/klasa 3) protiv Omicron varijanti je veoma ograničena. (11, 40, 45).

Ključni izazov koji ide naprijed bit će odrediti kako poboljšati elicitaciju široko reaktivnih antitijela na očuvane RBS epitope. S tim u vezi, primijetili smo da su osobe sa hibridnim imunitetom razvile značajno veće titre S728-1157-sličnih antitijela od vakcinisanih osoba bez prethodne infekcije. Važno je da je ovaj fenomen zabilježen čak i kada je kontroliran broj izloženosti (tj. kod rekonvalescentnih dvostrukih vakcinisanih naspram neinficiranih trostrukih vakcinisanih), što sugerira da neki element imuniteta povezanog s infekcijom (ili formulacija cjepiva koja može oponašati ovu vrstu imuniteta) je važno za izazivanje ovog klonotipa. Ovo je u skladu sa eksperimentalnim dokazima koji dokumentuju da osobe sa hibridnim imunitetom imaju širi profil reaktivnosti antitela u poređenju sa onima koji imaju samo imuni odgovor izazvan vakcinacijom ili primarnom infekcijom (9).

Strukture ovdje ilustriraju da je S728-1157 vezao epitop RBS-A/klase 1 u RBD konformaciji gore. Čini se da je ovaj epitop lakše dostupan na 6P-stabiliziranim šiljcima, za koje se navodi da predstavljaju 2 RBD-a u gornjoj državi, u poređenju sa 2P šiljcima, kojih ima samo 1 (30, 33, 46, 47) i na koje naša antitijela specifičan za šiljke up-konformacije pokazuju poboljšano vezivanje. S{14}} je izolovan nakon prirodne infekcije; u takvim kontekstima, izgledi za izazivanje S728-1157-sličnih klonova su vjerovatno veći s obzirom na to da RBD mora biti u stanju da usvoji konformaciju naviše, čak i prolazno, da se veže za ACE2, čime se izlaže ovaj epitop. Za razliku od većine IGHV3-53/3-66 RBS-A/klase 1 antitijela, S728-1157 može prihvatiti ključne mutacije u VOC šiljcima koristeći ekstenzivne interakcije između CDR-H3 i RBD (29, 48–50). S728-1157 također koristi drugačiji laki lanac (IGLV3-9) u poređenju sa drugim manje širokim antitijelima kao što je CC12.3 (IGKV3-20), što može uticati na ukupne interakcije vezivanja; međutim, naša analiza pokazuje da postoji manje vodonične veze između S728-1157 lakog lanca i RBD-a u poređenju sa CC12.3 (Dopunska tabela 7). Iako je većina kontaktnih ostataka CDR-H3 kritičnih za unakrsnu reaktivnost VOC u ovoj interakciji kodirana zametnom linijom i nije uvedena somatskim mutacijama, nekoliko somatski mutiranih ostataka u okvirnim regijama ili CDR-H1, CDR-H2 i CDR-L1 su uključen u interakciju sa SARS-CoV-2 RBD. S jedne strane, ovo sugerira da bi memorijske B ćelije koje kodiraju antitijela klase IGHV3-53/66 mogle steći sličan stepen unakrsne reaktivnosti daljim sazrijevanjem afiniteta. S druge strane, ovo također ukazuje na mogućnost dizajniranja imunogena usmjerenih na zametnu liniju koji ciljaju S728-1157-kao naivne B ćelije. Iako može biti izazov dizajnirati vakcine koje mogu specifično izazvati S728-1157-slična antitijela sa odabranim CDR-H3s sposobnim da prevladaju VOC mutacije, ohrabruje da se restrikcija IGHV-gena primjećuje i kod drugih moćnih SARS-CoV{ {58}} studije neutralizacije mAbs (13, 15, 20–27). Alternativno, ovo može biti izvodljivo iterativnom imunizacijom optimiziranim RBD imunogenima, kao što je ranije objavljeno za druge patogene (51-55).

Iako su uočene mnoge mutacije na antigenskom mjestu RBS-A/ klase 1 (18), s obzirom na epitop S728-1157, 13 od 15 ukupnih RBD kontaktnih ostataka i 2 od 3 CDR-H{{9} }vezani RBD kontaktni ostaci su konzervirani unutar Omikrona i svih drugih VOC-a. Ovo sugerira da RBD regija u kojoj je pronađen epitop S728-1157 može uključivati ​​ostatke kritične za njegovu dinamičku funkciju i virusnu sposobnost i stoga bi bila manje tolerantna na mutacije i antigenski drift od okolnih rezidua RBS-A/klase 1 mjesta. Ako je to slučaj, trebalo bi smanjiti sklonost gubitku ovog epitopa kako varijante virusa evoluiraju, čineći karakterizaciju S728-1157 i sličnih antitijela i epitopa važnim za vakcine otporne na varijante ili terapijski razvoj mAb. Ukratko, naša studija identifikuje bnAbs koji mogu dati informaciju o dizajnu imunogena za sljedeću generaciju varijanti otpornih na koronavirus vakcine ili služe kao mAb terapeutici koji su otporni na evoluciju SARS CoV-2. Konkretno, u smislu kombinovane snage i širine, S728-1157 se čini kao najbolje u klasi izolovano antitijelo do sada. S obzirom na to da se ovo antitijelo lakše veže sa 6P-stabilizacijom, predviđa se da će ga prvenstveno inducirati 6P-stabilizirani rekombinantni šiljasti proteini ili cijeli virus, što sugerira da bi modifikacija heksaprolina mogla biti od koristi budućim konstruktima cjepiva kako bi se optimalno zaštitili od budućih SARS-CoV -2 varijante i drugi arbovirusi.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Metode

Izolacija monoklonskih antitijela. PBMC su izolovani iz leukoredukcionih filtera i zamrznuti kao što je prethodno opisano (24). B ćelije su obogaćene PBMC-ima putem FACS-a. Ćelije su obojene CD19, CD3 i antigen sondama konjugovanim na oligo-fluorofor; ćelije od interesa su identifikovane kao CD3– CD19+ Antigen+. Sva mAb su generisana iz oligo-označenih, antigenom sortiranih ćelija koje su identifikovane preko jednoćelijske RNA-Seq, kao što je prethodno opisano (15, 24). Podaci o pojedinačnim B ćelijama generisani u ovoj studiji deponovani su u Gene Expression Omnibus: GSE171703 i GSM5231088–GSM5231123.

B ćelije specifične za antigen su odabrane da generišu mAb na osnovu intenziteta antigen-sonde koju je analizirao JMP Pro 15. Geni teškog i lakog lanca antitela su sintetizovani Integrated DNK Technologies (IDT) i klonirani u ljudski IgG1 i ljudski κ ili λ laki lanac ekspresioni vektori Gibsonovim sklopom, kao što je prethodno opisano (56). Teški i laki lanci odgovarajućih mAb su prolazno kotransficirani u HEK293T ćelije (ATCC). Nakon transfekcije u trajanju od 18 sati, transficirane ćelije su dopunjene supernatantom hibridoma bez proteina (PFHM-II, Gibco). Supernatant koji je sadržavao izlučeno mAb sakupljen je 4. dana i pročišćen korištenjem zrnca protein A-agaroze (Thermo Fisher Scientific) kao što je detaljno opisano ranije (56). Sekvence teških i lakih lanaca dobro okarakteriziranih antitijela izvedene su iz Protein Data Bank (PDB), LY-CoV555 (PDB ID: 7KMG), CR3022 (PDB ID: 6W7Y) i REGN1{{ 125}}933 (PDB ID: 6XDG) i sintetizirani su kako je gore opisano. CC12.3 mAb (PDB ID: 6XC4) je obezbijedila Meng Yuan sa Scripps Research Institute (San Diego, Kalifornija, SAD). Ekspresija rekombinantnog spike proteina. Rekombinantni D614G SARS-CoV-2 šiljak pune dužine (FL), BA.2-6P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P, XBB-6P, WT RBD, pojedinačni RBD mutanti (R346S, K417N, K417T, G446V, L452R, S477N, F486A, F486Y, N487Q, Y489F, Q493Y, N Y505A i Y505F), kombinacija RBD mutanta (K417N/E484K/L452R/NN501Y), SARS-CoV-1 RBD i MERS-CoV RBD generirani su u kompaniji. Ukratko, rekombinantni antigeni su eksprimirani pomoću Expi293F ćelija (Thermo Fisher Scientific). Gen od interesa je kloniran u vektor ekspresije sisara (in-house modificirani AbVec) i transfektiran korištenjem ExpiFectamine 293 kita (Thermo Fisher Scientific) prema protokolu proizvođača. Supernatant je sakupljen 4. dana nakon transfekcije i inkubiran sa Ni-nitrilotrioctenom kiselinom (Ni-NTA) agarozom (Qiagen). Prečišćavanje je izvedeno upotrebom gravitacione kolone i eluirano puferom koji sadrži imidazol kao što je prethodno opisano (57, 58). Eluat je puferovan i zamenjen sa PBS upotrebom Amicon centrifugalne jedinice (Millipore). Rekombinantni FL šiljci stabilizirani 2P mutacijama varijanti B.1.1.7 Alpha, B.1.351 Beta, P.1 Gamma, B.1.617.2 Delta, BA.1, BA.2 i BA.4 Omicron i bili su proizvedeno u Sather laboratoriji na Institutu za dječja istraživanja u Sijetlu. K417V, N439K i E484K RBD i rekombinantni FL spike WT-2P i 6P proizvedeni su u Krammer laboratoriji na Icahn School of Medicine na Mount Sinai. SARS-CoV-2-6P-Mut7 i šiljak BA.{91}}P dizajnirani su i proizvedeni kako je opisano u prethodnoj studiji (59). Proteinske sekvence i resursi za svaki antigen navedeni su u Dodatnoj tabeli 4. ELISA. Rekombinantni SARS-CoV-2 spike/RBD proteini prevučeni su na mikrotitarske ploče sa visokim stepenom vezivanja proteina (Costar) pri 2 ug/mL u PBS-u na 50 μL/bunariću i držane preko noći na 4 stepena. Ploče su isprane sa PBS koji sadrži 0,05% Tween 20 (PBS-T) i blokirane sa 150 μL PBS koji sadrži 20% FBS tokom 1 sata na 37 stepeni. Monoklonska antitijela su serijski razrijeđena 3-put počevši od 10 ug/mL u PBS-u i inkubirana u bazenčićima 1 sat na 37 stepeni. Ploče su zatim isprane i inkubirane sa HRP-konjugiranim kozjim anti-humanim IgG antitijelom (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098), 1:1,000) 1 sat na 37 stepeni. Nakon ispiranja, dodato je 100 μL Super AquaBlue ELISA supstrata (eBioscience) po jažici. Apsorpcija je mjerena na 405 nm na spektrofotometru za mikroploče (Bio-Rad). Testovi su standardizovani korišćenjem kontrolnog antitela S144-509 (15), sa poznatim karakteristikama vezivanja u svakoj ploči, a ploče su razvijane sve dok apsorbancija kontrole nije dostigla OD od 3,0. Sva mAb testirana su u duplikatu, a svaki eksperiment je izveden dva puta.

Serum ELISA. Mikrotitarske ploče sa visokim stepenom vezivanja proteina obložene su rekombinantnim SARS-CoV-2 spike antigenima u količini od 2 ug/mL u PBS-u preko noći na 4 stepena. Ploče su oprane sa PBS 0.05% Tween i blokirane sa 200 μL PBS 0.1% Tween + 3% obrano mlijeko u prahu 1 sat na sobnoj temperaturi (RT). Uzorci plazme su termički inaktivirani 1 sat na 56 stepeni prije izvođenja serološkog eksperimenta. Plazma je serijski razrijeđena 2- puta u PBS 0,1% Tween + 1% obranog mlijeka u prahu. Ploče su inkubirane sa razblaženjima seruma 2 sata na sobnoj temperaturi. HRP-konjugirano kozje anti-humano Ig sekundarno antitijelo razrijeđeno u omjeru 1:3,000 sa PBS 0,1% Tween + 1% obranog mlijeka u prahu korišteno je za otkrivanje vezivanja antitijela. Nakon 1 sata inkubacije, ploče su razvijene sa 100 μL SigmaFast OPD rastvora (Sigma-Aldrich) tokom 10 minuta. Zatim je upotrijebljeno 50 μL 3M HCl da se zaustavi razvojna reakcija. Apsorpcija je izmjerena na 490 nm na spektrofotometru za mikroploče (Bio-Rad). Titri krajnjih tačaka su ekstrapolirani iz standardne krive sigmoidne 4PL (gdje je x log koncentracija) za svaki uzorak. Granica detekcije (LOD) je definirana kao srednja + 3 SD OD signala snimljena korištenjem plazme osoba prije SARS-CoV-2. Svi proračuni su izvedeni u softveru GraphPad Prism (verzija 9.0).

Takmičenje ELISA. Da bi se odredila ciljna klasifikacija epitopa RBD-reaktivnih mAbs, izvedene su kompetitivne ELISA analize koristeći druga mAb sa poznatim karakteristikama vezivanja epitopa kao konkurentska mAbs. Konkurentska mAbs su biotinilirana upotrebom EZ-Link sulfo-NHS-biotina (Thermo Fisher Scientific) tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Višak biotina biotiniliranih mAbs je uklonjen sa 7k molekularne težine (MWCO) Zeba spin kolonama za odslađivanje (Thermo Fisher Scientific). Ploče su obložene sa 2 ug/mL RBD antigena preko noći na 4 stepena. Ploče su blokirane sa PBS–20% FBS 2 sata na sobnoj temperaturi i dodano je 2-putorazrjeđenje mAb neodređene klase ili seruma, počevši od 20 ug/mL mAbs i 1:10 razrjeđenje seruma. Nakon inkubacije antitijela od 2 sata na sobnoj temperaturi, biotinilirano konkurentsko mAb je dodano u koncentraciji dvostruko većoj od njegove konstante disocijacije (KD) i inkubirano još 2 sata na sobnoj temperaturi zajedno sa mAb ili serumom koji je prethodno dodat. Ploče su isprane i inkubirane sa 100 μL HRP-konjugovanog streptavidina (Southern Biotech) u razrjeđenju 1:1,000 1 sat na 37 stepeni. Ploče su razvijene sa Super AquaBlue ELISA supstratom (eBioscience). Za normalizaciju testova, konkurentsko biotinilirano mAb je dodano u jažicu bez ikakvih konkurentskih mAb ili seruma kao kontrole. Podaci su snimljeni kada je apsorbancija kontrolne jažice dostigla OD od 1,0–1,5. Procenat konkurencije između mAbs je zatim izračunat dijeljenjem uočenog OD uzorka sa OD postignutim pozitivnom kontrolom, oduzimanjem ove vrijednosti od 1 i množenjem sa 100. Za serum, OD su transformirani log10 i analizirani nelinearnom regresijom kako bi se odredilo 50 % vrijednosti koncentracije inhibicije (IC50) korištenjem softvera GraphPad Prism (verzija 9.0). Podaci su transformisani u Log1P i ucrtani u grafikon koji predstavlja recipročno razblaživanje seruma IC50 razblaženja seruma koji može da postigne 50% konkurencije sa konkurentskim mAb od interesa. Sva mAb su testirana u duplikatu, svaki eksperiment je izveden 2 puta nezavisno, a vrijednosti iz 2 nezavisna eksperimenta su usrednjene.

Testovi plaka. Testovi plaka su izvedeni sa virusima varijante SARS-CoV-2 na Vero E6/TMPRSS2 ćelijama (Japanska zbirka istraživačkih bioresursa (JCRB)) (dopunska tabela 5). Ćelije su kultivisane da bi se postigla konfluentnost od 90% prije nego što su tripsinizirane i zasijane u gustini od 3 × 104 ćelije/jažici u 96-pločama s jažicom. Sljedećeg dana, 102 PFU SARS-CoV-2 varijante su inkubirane sa 2-prestruko razrijeđenim mAbs tokom 1 sata. Mešavina antitelo-virus inkubirana je sa Vero E6/TMPRSS2 ćelijama 3 dana na 37 stepeni. Ploče su fiksirane sa 20% metanola i zatim obojene kristalno ljubičastim rastvorom. Potpune inhibitorne koncentracije (IC99) su izračunate korištenjem log (inhibitor) u odnosu na normalizirani odgovor (promjenjivi nagib), izveden u GraphPad Prism (verzija 9.0). Sva mAb testirana su u duplikatu, a svaki eksperiment je izveden dva puta. Test neutralizacije smanjenja fokusa. Testovi neutralizacije smanjenja fokusa (FRNT) korišteni su za određivanje aktivnosti neutralizacije kao dodatna platforma osim analize plaka. Serijska razrjeđenja seruma počevši od konačne koncentracije od 1:20 pomiješana su sa 103 jedinice virusa koje formiraju fokus po jažici i inkubirana 1 sat na 37 stepeni. Kao kontrola poslužio je skupni uzorak seruma pred pandemijom. Mješavina antitijela i virusa je inokulirana na Vero E6/TMPRSS2 ćelije (JCRB) u 96-pločama s bunarima i inkubirana 1 sat na 37 stepeni. U svaku jažicu je dodana jednaka zapremina rastvora metilceluloze. Ćelije su inkubirane 16 sati na 37 stepeni, a zatim fiksirane formalinom. Nakon što je formalin uklonjen, ćelije su imuno obojene mišjim mAb protiv SARS-CoV-1/2 nukleoproteina [klon 1C7C7 (Sigma-Aldrich)], nakon čega je slijedio HRP-obilježen kozji anti-mišji imunoglobulin (Sigma- Aldrich; A8924). Inficirane ćelije su obojene TrueBlue supstratom (SeraCare Life Sciences), a zatim isprane destilovanom vodom. Nakon sušenja, brojevi fokusa su kvantificirani korištenjem ImmunoSpot S6 analizatora, softvera ImmunoCapture i softvera BioSpot (ćelijska tehnologija). IC50 je izračunat iz interpolirane vrijednosti iz log (inhibitor) naspram normaliziranog odgovora, koristeći nelinearnu regresiju varijabilnog nagiba (4 parametra) izvedenu u GraphPad Prism (verzija 9.0).

Reference

1. Hou YJ, et al. SARS-CoV-2 D614G varijanta pokazuje efikasnu replikaciju ex vivo i prijenos in vivo. Nauka. 2020;370(6523):1464–1468.

2. Garcia-Beltran WF, et al. Višestruke varijante SARS CoV-2 izbjegavaju neutralizaciju humoralnim imunitetom izazvanim vakcinom. Cell. 2021;184(9):2523.

3. Wall EC, et al. Neutralizirajuća aktivnost antitijela protiv SARS-CoV-2 VOC B.1.617.2 i B.1.351 vakcinacijom BNT162b2. Lancet. 2021;397(10292):2331–2333.

4. Edara VV, et al. Infekcija i reakcije neutralizirajućih antitijela izazvane vakcinom na SARS-CoV-2 B.1.617 varijante. N Engl J Med. 2021;385(7):664–666.

5. Zhou D, et al. Dokaz o bijegu SARS-CoV-2 varijante B.1.351 iz prirodnih seruma i seruma izazvanih vakcinom. Cell. 2021;184(9):2348–2361.

6. Weisblum Y, et al. Pobjeći od neutralizirajućih antitijela pomoću SARS-CoV-2 varijanti spike proteina. Elife. 2020;9:e61312.

7. Graham F. Dnevni brifing: Omicron varijanta koronavirusa stavlja naučnike u stanje pripravnosti. Priroda. 2021;.

8. Karim SSA, Karim QA. Omicron SARS-CoV-2 varijanta: novo poglavlje u pandemiji COVID-19. Lancet. 2021;398(10317):2126–2128.

9. Carreño JM, et al. Aktivnost rekonvalescentnog i vakcinalnog seruma protiv SARS-CoV-2 Omicron. Priroda. 2021;602(7898):682–688.

10. Wang Q, et al. Alarmantna svojstva izbjegavanja antitijela rastućih podvarijanti SARS-CoV-2 BQ i XBB. Cell. 2022;186(2):279–286.

11. VanBlargan LA, et al. Infektivni SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron virus izbjegava neutralizaciju terapijskih monoklonskih antitijela. Nat Med. 2022;28(3):490–495.

12. Takashita E, et al. Efikasnost antitijela i antivirusnih lijekova protiv Covid-19 Omicron Variant. N Engl J Med. 2022;386(10):995–998.

13. Yuan M, et al. Prepoznavanje domene vezivanja SARS-CoV-2 receptora neutralizirajućim antitijelima. Biochem Biophys Res Commun. 2021;538:192–203.

14. Barnes CO, et al. Strukture antitijela koje neutraliziraju SARS-CoV-2 predstavljaju terapijske strategije. Priroda. 2020;588(7839):682–687.

15. Changrob S, et al. Unakrsna neutralizacija zabrinjavajućih varijanti SARS-CoV-2 u nastajanju antitijelima koja ciljaju različite epitope na vrhuncu. Mbio. 2021;12(6):e0297521.

16. Guthmiller JJ, et al. Ozbiljnost infekcije SARS-CoV-2 povezana je sa superiornim humoralnim imunitetom protiv šiljka. Mbio. 2021;12(1):e02940–20.

17. Greaney AJ, et al. Mapiranje mutacija na SARS-CoV-2 RBD koje izbjegavaju vezivanje različitih klasa antitijela. Nat Commun. 2021;12(1):4196.

18. Liu H, Wilson IA. Zaštitni neutralizirajući epitopi u SARS-CoV-2. Immunol Rev. 2022;310(1):76–92.

19. Jette CA, et al. Široka unakrsna reaktivnost na arboviruse koju pokazuje podskup neutralizirajućih antitijela dobivenih od donatora COVID-19. Cell Rep. 2021;36(13):109760.

20. Brouwer PJM, et al. Snažna neutralizirajuća antitijela od COVID-19 pacijenata definiraju višestruke ciljeve ranjivosti. Nauka. 2020;369(6504):643–650.

21. Pinto D, et al. Unakrsna neutralizacija SARS CoV-2 ljudskim monoklonskim SARS-CoV antitelom. Priroda. 2020;583(7815):290–295.

22. Robbiani DF, et al. Konvergentni odgovori antitijela na SARS-CoV-2 kod rekonvalescentnih osoba. Priroda. 2020;584(7821):437–442.

23. Yuan M, et al. Strukturna osnova zajedničkog odgovora antitijela na SARS-CoV-2. Nauka. 2020;369(6507):1119–1123.

24. Dugan HL, et al. Profilisanje imunodominacije B ćelija nakon infekcije SARS-CoV-2 otkriva evoluciju antitijela na ne-neutralizirajuće virusne mete. Imunitet. 2021;54(6):1290–1303.

25. Rogers TF, et al. Izolacija snažnih antitijela koja neutraliziraju SARS CoV-2 i zaštita od bolesti na modelu male životinje. Nauka. 2020;369(6506):956–963.

26. Schmitz AJ, et al. Javno antitijelo izazvano vakcinom štiti od SARS-CoV-2 i varijanti koje se pojavljuju. Imunitet. 2021;54(9):2159–2166.e6.

27. Shi R, et al. Ljudsko neutralizirajuće antitijelo cilja na mjesto vezanja receptora SARS-CoV-2. Priroda. 2020;584(7819):120–124.

28. Cao Y, et al. Snažna neutralizirajuća antitijela protiv SARS-CoV-2 identificirana visokopropusnim jednoćelijskim sekvenciranjem B ćelija rekonvalescentnih pacijenata. Cell. 2020;182(1):73–84.

29. Barnes CO, et al. Strukture ljudskih antitijela vezanih za SARS-CoV-2 šiljak otkrivaju uobičajene epitope i rekurentne karakteristike antitijela. Cell. 2020;182(4):828–842.

30. Corbett KS, et al. Dizajn mRNA vakcine SARS-CoV-2 omogućen je pripremljenošću prototipa patogena. Priroda. 2020;586(7830):567–571.

31. Amanat F, et al. Uvođenje dva prolina i uklanjanje polibaznog mjesta cijepanja doveli su do veće efikasnosti rekombinantne SARS-CoV-2 vakcine zasnovane na šiljcima u modelu miša. mBio. 2021;12(2):e02648–20.

32. Sun W, et al. Virus Newcastleske bolesti koji eksprimira stabilizirani šiljasti protein SARS-CoV-2 inducira zaštitne imune odgovore. Nat Commun. 2021;12(1):6197.

33. Hsieh CL, et al. Dizajn baziran na strukturi prefuzijom stabiliziranih SARS-CoV-2 šiljaka. Nauka. 2020;369(6510):1501–1505.

34. Gobeil SM, et al. Strukturna raznolikost SARS-CoV-2 Omikrona. Mol Cell. 2022;82(11):2050–2068.

35. Yuan M, et al. Visoko očuvan kriptični epitop u domenima za vezivanje receptora SARS-CoV-2 i SARS-CoV. Nauka. 2020;368(6491):630–633.

36. Starr TN, et al. Kompletna mapa SARS-CoV-2 RBD mutacija koje izbjegavaju monoklonsko antitijelo LY-CoV555 i njegov koktel sa LY-CoV016. Cell Rep Med. 2021;2(4):100255.

37. Baum A, et al. Antitijela REGN-COV2 sprječavaju i liječe infekciju SARS-CoV-2 kod rezus makaka i hrčaka. Nauka. 2020;370(6520):1110–1115.

38. Wu NC, et al. Alternativni način vezivanja IGHV3-53 antitijela za vezujuću domenu SARS-CoV-2 receptora. Cell Rep. 2020;33(3):108274.

39. Wu Y, et al. Nekonkurentski par ljudskih neutralizirajućih antitijela blokira vezivanje virusa COVID-19 za njegov receptor ACE2. Nauka. 2020;368(6496):1274–1278.

40. Yuan M, et al. Strukturne i funkcionalne posljedice antigenskog drifta u novijim varijantama SARS-CoV-2. Nauka. 2021;373(6556):818–823.

41. Yan Q, et al. Zametna linija IGHV3-53-kodirana RBD-cilja neutralizirajuća antitijela su obično prisutna u repertoarima antitijela pacijenata sa COVID-19. Emerg Microbes Infect. 2021;10(1):1097–1111.

42. Zhang Q, et al. Potentna i zaštitna IGHV3- 53/3-66 javna antitijela i njihov zajednički mutant koji može pobjeći na vrhuncu SARS-CoV-2. Nat Commun. 2021;12(1):4210.

43. Wang Z, et al. Antitijela na SARS-CoV-2 i cirkulirajuće varijante izazvana mRNA vakcinom. Priroda. 2021;592(7855):616–622.

44. Simon V, et al. PARIZ i SPARTA: pronalaženje Ahilove pete SARS-CoV-2. mSphere. 2022;7(3):e0017922.

45. Starr TN, et al. SARS-CoV-2 RBD antitijela koja maksimiziraju širinu i otpornost na bijeg. Priroda. 2021;597(7874):97–102.

46. ​​Zidovi AC, et al. Struktura, funkcija i antigenost SARS-CoV-2 spike glikoproteina. Cell. 2020;181(2):281–292.

47. Henderson R, et al. Kontrola konformacije SARS-CoV-2 špica glikoproteina. Nat Struct Mol Biol. 2020;27(10):925–933.

48. Shrestha LB, et al. Široko neutralizirajuća antitijela protiv novih SARS-CoV-2 varijanti. Front Immunol. 2021;12:752003.

49. Greaney AJ, et al. Antitijela izazvana vakcinacijom mRNA-1273 vežu se šire za domenu za vezivanje receptora nego ona od infekcije SARS-CoV-2. Sci Transl Med. 2021;13(600):eabi9915.

50. Reincke SM, et al. SARS-CoV-2 Beta varijanta infekcije izaziva moćna antitijela specifična za lozu i unakrsno reaktivna. Nauka. 2022;375(6582):782–787.

51. Wrammert J, et al. Široko unakrsna reaktivna antitijela dominiraju odgovorom ljudskih B ćelija na pandemijsku infekciju virusom gripe H1N1 iz 2009. godine. J Exp Med. 2011;208(1):181–193.

52. Guthmiller JJ, et al. Prvo izlaganje široko neutralizirajućim antitijelima izazvanim pandemijskim virusom H1N1 koja ciljaju epitope glave hemaglutinina. Sci Transl Med. 2021;13(596):eabg4535.

53. Bajić G i dr. Inženjering antigena gripe fokusira se na imunološki odgovor na subdominantni, ali široko zaštitni virusni epitop. Cell Host Microbe. 2019;25(6):827–835.

54. Nachbagauer R, et al. Pristup univerzalne vakcine protiv virusa gripe zasnovan na himernom hemaglutininu izaziva širok i dugotrajan imunitet u randomiziranom, placebom kontroliranom ispitivanju faze I. Nat Med. 2021;27(1):106–114.

55. Angeletti D, et al. Zaobilazeći imunodominaciju radi ciljanja subdominantnih široko neutralizirajućih epitopa. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(27):13474–13479.

56. Guthmiller JJ, et al. Efikasna metoda za stvaranje monoklonskih antitijela iz ljudskih B ćelija. Metode Mol Biol. 2019;1904:109–145.

57. Amanat F, et al. Serološki test za otkrivanje serokonverzije SARS-CoV-2 kod ljudi. Nat Med. 2020;26(7):1033–1036.

58. Stadlbauer D, et al. SARS-CoV-2 serokonverzija kod ljudi: detaljan protokol za serološki test, proizvodnju antigena i postavljanje testa. Curr Protoc Microbiol. 2020;57(1):e100.

59. Torres JL, et al. Strukturni uvid u visoko snažno pan-neutralizirajuće SARS-CoV-2 ljudsko monoklonsko antitijelo. Proc Natl Acad Sci USA. 2022;119(20):e2120976119.

60. Suloway C, et al. Automatska molekularna mikroskopija: novi sistem Leginon. J Struct Biol. 2005;151(1):41–60.

61. Lander GC, et al. Appion: integrisani cevovod vođen bazom podataka koji olakšava EM obradu slike. J Struct Biol. 2009;166(1):95–102.

62. Voss NR, et al. DoG Picker i TiltPicker: softverski alati za olakšavanje selekcije čestica u elektronskoj mikroskopiji s jednom česticom. J Struct Biol. 2009;166(2):205–213.

63. Pettersen EF, et al. UCSF Chimera{1}}sistem vizualizacije za istraživačko istraživanje i analizu. J Comput Chem. 2004;25(13):1605–1612.

64. Punjani A, et al. Neujednačeno prečišćavanje: adaptivna regularizacija poboljšava jednočesticnu krio-EM rekonstrukciju. Nat Methods. 2020;17(12):1214–1221.

65. Zhang K. Gctf: Određivanje i korekcija CTF-a u realnom vremenu. J Struct Biol. 2016;193(1):1–12.

66. Živanov J, et al. Novi alati za automatsko određivanje krio-EM strukture visoke rezolucije u RELION-3. Elife. 2018;7:e42166.

67. Casanal A, et al. Trenutni razvoji u koot za izradu makromolekularnog modela elektronske kriomikroskopije i kristalografskih podataka. Protein Sci. 2020;29(4):1069–1078.

68. Frenz B, et al. Automatsko popravljanje grešaka u glikoproteinskim strukturama sa rozetom. Struktura. 2019;27(1):134–139.

69. Klaholz BP. Izvođenje i rafiniranje atomskih modela u kristalografiji i krio-EM: najnoviji Phenix alati za olakšavanje analize strukture. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2019;75(pt 10):878–881.

70. Pettersen EF, et al. UCSF ChimeraX: Vizualizacija strukture za istraživače, edukatore i programere. Protein Sci. 2021;30(1):70–82.

71. Otwinowski Z, Minor W. Obrada podataka difrakcije rendgenskih zraka prikupljenih u oscilacijskom modu. Metode Enzymol. 1997;276:307–326.

72. McCoy AJ, et al. Phaser kristalografski softver. J Appl Crystallogr. 2007;40(pt 4):658–674.

73. Qiang M, et al. Neutralizirajuća antitijela na SARS CoV-2 odabrana su iz biblioteke ljudskih antitijela koja je napravljena prije nekoliko decenija. Adv Sci (Weinh). 2022;9(1):e2102181.

74. Emsley P, Cowtan K. Coot: alati za izgradnju modela za molekularnu grafiku. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004; 60 (pt 12 pt 1): 2126–2132.

75. Adams PD, et al. PHENIX: sveobuhvatan Python baziran sistem za rješenje makromolekularne strukture. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010;66(pt 2):213–221.

76. Montiel-Garcia D, et al. Epitope-Analyzer: Web alat zasnovan na strukturi za analizu široko neutralizirajućih epitopa. J Struct Biol. 2022;214(1):107839.