Abstract

Depresija predstavlja veoma rasprostranjen i onesposobljavajući psihijatrijski poremećaj na globalnom nivou. Sve veći dokazi pokazuju da pretjerana neuroinflamatorna aktivacija unutar hipokampusa značajno doprinosi nastanku i napredovanju simptoma depresije. Cistanche feniletanol glikozidi (CPhG), glavni bioaktivni sastojci ekstrahovani iz tradicionalne jestivo-ljekovite biljkeCistanche deserticolaiCistanche tubulosa, pokazali su višestruka neuroprotektivna farmakološka svojstva u prethodnim studijama. Ovo istraživanje imalo je za cilj da istraži terapeutske uticaje i molekularne mehanizme koje vrše CPhG na fenotipove ponašanja nalik depresiji izazvane hroničnim nepredvidivim blagim stresom (CUMS) kod C57BL/6 miševa.

Šezdeset miševa C57BL/6 SPF-klase nasumično je podijeljeno u šest eksperimentalnih kohorti: kontrolna grupa, grupa CUMS-modela, grupa sa visokim dozama CPhGs (700 mg/kg), grupa sa srednjom dozom CPhGs (350 mg/kg), niska doza (175 mg/kg), grupa sa niskom dozom (175 mg/kg) grupa fluoksetina (15 mg/kg). Nakon četveronedjeljne intervencije davanja lijeka nakon CUMS modeliranja, primijenjene su sveobuhvatne neurobihejvioralne procjene uključujući test preferencije saharoze (SPT), test otvorenog polja (OFT), test ovjesa repa (TST) i test prisilnog plivanja (FST). Kompleti za enzimski imunosorbentni test (ELISA) kvantificiraju koncentraciju neurotransmitera monoamina u serumu, uz hipokampalne proinflamatorne citokine i inflamatorne medijatore. Bojenje hematoksilin-eozinom (HE) i Nissl bojenje vizualiziraju neuronske patološke ozljede unutar područja zupčastog girusa hipokampusa. Imunohistohemija je detektovala intenzitet ekspresije glijalnog fibrilarnog kiselog proteina (GFAP), jonizovanog adapterskog molekula koji vezuje kalcijum-1 (Iba-1), NLRP3 i proteina kaspaze-1. Imunofluorescentno bojenje dodatno je procijenilo status aktivacije uzvodne TLR4/NF‑κB signalne kaskade.

Naši eksperimentalni rezultati su pokazali da oralna primjena CPhG-a značajno ublažava abnormalnosti ponašanja povezane s depresijom. CPhGs je povećao postotak preferencije saharoze i smanjio trajanje nepokretnosti u paradigmama ponašanja zasnovanim na očaju. Štaviše, tretman CPhGs vratio je osiromašeni nivo seruma i hipokampalnog serotonina (5‑HT), kao i nivoe dopamina (DA). Biohemijska detekcija otkrila je značajnu supresiju hipokampalnih proinflamatornih medijatora i prekomjernu proizvodnju citokina. Histopatološka zapažanja ilustrirala su dozno-ovisno olakšanje CUMS-provociranog oštećenja neurona hipokampusa. Imunohistohemijski rezultati su pokazali da CPhG povećava gustinu astrocita označenu GFAP-om, inhibira patološku hiperaktivaciju Iba-1-pozitivne mikroglije i smanjuje količinu proteina vezanih za NLRP3 inflamazom. Imunofluorescentni testovi su potvrdili da CPhG suzdržavaju prekomjernu TLR4 i fosforiliranu aktivaciju NF-κB p65 unutar hipokampalnog tkiva.

Zajedno, ovi nalazi potvrđuju da CPhG ispoljavaju izraženu efikasnost nalik antidepresivima protiv CUMS-stimuliranih manifestacija sličnih depresiji kod miševa. Njegov farmakološki mehanizam djelomično je posredovan kroz dvostruke regulatorne funkcije: obnavljanje homeostaze monoaminskih neurotransmitera i obuzdavanje neuroinflamatornih odgovora posredovanih signalnom osom TLR4/NF‑κB/NLRP3. Ova studija na životinjama daje pretkliničku eksperimentalnu osnovu koja podržava daljnju eksploataciju CPhG-a kao obećavajućih prirodnih kandidata ili funkcionalnih sastojaka hrane za pomoćne intervencije depresije.

Ključne riječi: Cistanche feniletanol glikozidi (CPhGs); depresija; hronični nepredvidivi blagi stres; neuroinflamacija; astrociti; mikroglija; TLR4/NF‑κB/NLRP3 put inflamasoma

1. Uvod

Depresija je višestruka afektivna psihijatrijska bolest koju karakteriziraju osnovne kliničke manifestacije koje se sastoje od trajnog lošeg raspoloženja, anhedonije, psihomotorne retardacije, poremećaja spavanja i budnosti i somatske disfunkcije. Teške depresivne epizode potencijalno dovode do samopovređivanja i suicidalnih ideja, namećući ogromna opterećenja za javno zdravlje širom svijeta. Podaci epidemioloških istraživanja iz Kine pokazuju da je nacionalna prevalencija depresije dostigla 2,1 %, a Svjetska zdravstvena organizacija je klasifikovala veliki depresivni poremećaj među najbolje rangirane bolesti koje doprinose globalnom gubitku životnih godina prilagođenih invalidnosti.

Ipak, kompletna molekularna etiologija koja leži u pozadini patogeneze depresije ostaje nepotpuno razjašnjena, što ometa savršena klinička terapijska rješenja. Savremene patofiziološke hipoteze pomjerile su fokus na neuro-imune mehanizme preslušavanja. Akumulirajuća pretklinička i klinička istraživanja naglašavaju upornu neuroinflamaciju kao vitalni patogeni pokretač depresivnih poremećaja. Pod hroničnim psihološkim ili fiziološkim stresom, populacije hipokampalnih glijalnih ćelija prolaze kroz abnormalnu aktivaciju. Prekomjerno aktivirana mikroglija i disfunkcionalni astrociti pokreću snažno oslobađanje višestrukih proinflamatornih medijatora, stvarajući efekte kaskade proinflamatornih citokina. Takvi neuroinflamatorni inzulti dodatno indukuju neuronsko morfološko pogoršanje, poremećaj metabolizma neurotransmitera i oštećenje sinaptičke plastičnosti, na kraju olakšavajući patološku progresiju nalik depresiji.

Trenutne glavne kliničke intervencije antidepresiva uglavnom se oslanjaju na sintetičke hemijske antidepresive predstavljene fluoksetinom, selektivnim inhibitorom ponovnog preuzimanja serotonina (SSRI). Uprkos djelomičnom ublažavanju simptoma kod određenih pacijenata, sintetički antidepresivi posjeduju dobro poznate nedostatke: nezadovoljavajući omjer potpune remisije, česti rezidualni simptomi depresije, velika vjerovatnoća recidiva nakon prestanka uzimanja lijeka, plus štetne gastrointestinalne, jetrene i metaboličke nuspojave tijekom dugotrajne primjene. Nasuprot tome, tradicionalni biljni lijekovi imaju modulatorne karakteristike s više ciljeva i relativno blage sigurnosne profile, zbog čega privlače sve veći istraživački interes za pomoćnu terapiju poremećaja raspoloženja.

Cistanche deserticolaiCistanche tubulosa, koji se obično naziva "pustinjski ginseng", pripada porodici Orobanchaceae. Njihove mesnate stabljike služe kao klasična homologna ljekovito-prehrambena sirovina u tradicionalnoj azijskoj biljnoj praksi. Moderna farmakološka istraživanja dokumentiraju višestruku neuroprotektivnu bioaktivnost zaCistancheekstrakti, uključujući anti-neurodegeneracijske efekte protiv Alchajmerove bolesti i Parkinsonove bolesti. Feniletanol glikozidi čine glavne bioaktivne frakcije unutraCistancheekstrakti, koji uglavnom sadrže ehinakozid i verbaskozid. Cistanche feniletanol glikozidi (CPhG) pokazuju anti-tumorske, antioksidativne, imunomodulatorne i neurozaštitne bioaktivnosti na više eksperimentalnih platformi.

Prethodni preliminarni laboratorijski rad je pokazao da CPhG mogu povećati koncentraciju dopamina u strijatu i ublažiti depresivne fenotipove povezane s menopauzom na životinjskim modelima glodara. Međutim, još uvijek nedostaje sistematsko istraživanje da li CPhG proizvode zaštitne utjecaje na depresiju izazvanu kroničnim stresom i detaljnim kaskadama transdukcije signala koje posreduju u takvim bioaktivnostima. Životinjska paradigma hroničnog nepredvidivog blagog stresa (CUMS) stoji kao jedan dobro uspostavljen pretklinički model depresije. Izlažući laboratorijske glodare različitim nasumičnim blagim stresorima tokom uzastopnih sedmica, CUMS pouzdano rekapitulira osnovne depresivne karakteristike kao što su anhedonija, očaj u ponašanju i neuropatološka oštećenja hipokampusa.

U skladu s tim, ovo istraživanje je konstruiralo model depresivnog miša izazvanog CUMS-om da bi sistematski procijenio in-vivo potenciju nalik antidepresivima tri gradijentne doze CPhG-a. Posebno smo se fokusirali na oporavak monoaminskih neurotransmitera, fenotipsku transformaciju hipokampalnih glijalnih stanica i neuroinflamatorni put NLRP3 inflamasoma koji upravlja TLR4/NF-κB. Namjera ove studije je da pruži objektivne eksperimentalne dokaze koji će podržati budući farmaceutski razvoj i primjenu CPhG-a u funkcionalnoj hrani koji cilja na poboljšanje simptoma depresije.

2. Materijali i metode

2.1 Eksperimentalni materijali, reagensi i instrumenti

Standardizirani sirovi ekstrakt CPhGs nabavljen je od Hotan Dichen Pharmaceutical Biological Co., Ltd (serija br.. 20231221, Xinjiang, Kina). Ukupni sadržaj feniletanol glikozida veći ili jednak 85 %, koji sadrži ehinakozid veći ili jednak 40 % i verbaskozid veći ili jednak 16 %. Fluoksetin hidrohlorid kapsule su nabavljene od Patheon Francuska. Komercijalni kompleti za ELISA testove za 5‑HT, DA, iNOS, COX‑2, PGE2, TNF‑, IL‑1, IL‑18, IL‑6, IFN‑ nabavljeni su od kvalifikovanih dobavljača bioloških reagensa. Primarna antitijela primijenjena za imunohistohemiju i imunofluorescenciju uključivala su anti-GFAP, anti-Iba-1, anti-NLRP3, anti-Caspase-1, anti-TLR4 i anti-fosfo-NF-κB antitela. p65. Kompleti za histološko bojenje za HE i Nissl bojenje pripremljeni su za obradu parafinskih sekcija mozga.

Ključni laboratorijski analitički instrumenti pokrivali su preciznu elektronsku analitičku vagu, Milli-Q radnu stanicu za prečišćavanje ultra-čiste vode, SpectraMax multi-mode čitač mikroploča, Leica uspravni fluorescentni mikroskop, plus kompletan hardver za analizu ponašanja glodara i softverski sistem za praćenje kretanja SMART 3.0.

Šezdeset mužjaka SPF-grade C57BL/6 miševa, starih sedam sedmica, sa početnim rasponom tjelesne težine 18-22 g, kupljeni su od Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. ID odobrenja: SUCMDL20231015003). Miševi su bili smješteni u objektima za smještaj životinja bez specifičnih patogena. Parametri životne sredine su održavani na temperaturi okoline (21 ± 2) stepena, relativnoj vlažnosti 60 % ± 10 %, primenom standardnih 12-časovnih ciklusa osvetljenja svetlo-tamno. Hrana za glodare i voda za piće bili su dostupni ad libitum. Jednonedeljni period adaptivne aklimatizacije obavljen je prije pokretanja formalnih eksperimentalnih tokova rada.

2.2 Grupiranje životinja, modeliranje CUMS-a i administracija lijekova

Nakon jednotjednog adaptivnog uzgoja, preliminarni skrining za preferenciju saharoze isključio je pojedinačne miševe s inherentnim niskim preferencijama da piju šećer. Kvalificirani eksperimentalni miševi su randomizirani u šest studijskih grupa (n = 10 životinja u svakoj grupi):

Kontrolna grupa (Con): nema CUMS stresa, intragastrična primjena izovolumetrijske deionizirane vode;

Grupa CUMS modela (Mod): primanje pune CUMS stimulacije, gavaža dejonizovanom vodom jednake zapremine;

Grupa sa visokim dozama CPhGs (CPhGs‑H): izloženost CUMS, CPhGs 700 mg/kg tjelesne težine po dnevnoj gavaži;

Grupa CPhG sa srednjim dozama (CPhGs‑M): izloženost CUMS, CPhGs 350 mg/kg dnevnom gavažom;

Grupa sa niskim dozama CPhGs (CPhGs‑L): izloženost CUMS, CPhGs 175 mg/kg dnevnom gavažom;

Fluoksetin pozitivna kontrolna grupa (FLX): izloženost CUMS, fluoksetin 15 mg/kg gavaža jednom dnevno.

Za konstrukciju CUMS modela, usvojeno je deset različitih vrsta blagih stresora: fizičko ograničenje (60 min), horizontalno mućkanje (60 min), ovjes repa (60 min), ugao nagnutog kaveza od 45 stupnjeva (24 h), vlažno okruženje u postelji (24 h), izolacija praznog kaveza (24 h), izolacija preko noćnog svjetla (21‑2 h). plivanje u toploj vodi na 41 stepen u trajanju od 5 minuta, plivanje u hladnoj vodi na 4 stepena u trajanju od 5 minuta i stimulacija repa u trajanju od 2 min. Dva različita stresora su primijenjena nasumično svaki dan; identični stresor se ne bi pojavio uzastopno u dva susedna dana. Procedura CUMS modeliranja trajala je četiri sedmice.

Po završetku četvoronedeljnog modeliranja stresa, odgovarajuće ispitivane supstance ili vehikulum rastvarača su dostavljeni intragastrično jednom dnevno tokom još četiri nedelje neprekidno. U osmoj eksperimentalnoj sedmici svi projekti neurobihejvioralne detekcije su implementirani uzastopno.

2.3 Baterija za neuro-bihejvioralni test

2.3.1 Test preferencije saharoze (SPT)

Test preferencije saharoze procjenjuje depresivni fenotip nalik anhedoniji kod glodara. Prije formalnog mjerenja, svaki miš je bio pojedinačno smješten. Izvršena je trodnevna faza adaptacije na piće sa saharozom. Prvi dan: dvije boce 1% rastvora saharoze stavljene u svaki kavez na 24 h. Drugi dan: jedna boca rastvora saharoze uparena sa jednom bocom prečišćene vode. Treći dan: zamijenite položaj posuda za šećer-vodu i čistu vodu kako biste eliminirali utjecaj pristranosti lokacije. Nakon ciklusa adaptacije, miševi su postili od hrane i vode 24 sata. Nakon toga, dostavljene su prethodno izvagana boca za vodu od 1% saharoze i boca s pročišćenom vodom. Položaji boca su zamijenjeni nakon 12 h. Nakon ukupnog trajanja testiranja od 24 sata, preostala težina tečnosti obje boce je precizno zabilježena. Stopa preferencije saharoze (%)=(potrošnja rastvora saharoze)/(potrošnja rastvora saharoze + potrošnja prečišćene vode) × 100 %.

2.3.2 Test otvorenog polja (OFT)

Aparat otvorenog polja formirao je kubičnu kutiju s otvorenim vrhom veličine 50 cm × 50 cm × 50 cm. Centralna kvadratna oblast je definisana kao centralna zona dimenzija 25 cm × 25 cm sa središtem unutar arene. Svaki miš je nježno pozicioniran na središnju površinu kutije otvorenog polja. Dozvoljeno je petominutno slobodno vrijeme za adaptaciju. Snimanje ponašanja i analiza podataka koncentrisani su na naredni period posmatranja od pet minuta. Primarni indikatori očitavanja sadržavali su ukupnu udaljenost kretanja, vrijeme provedeno unutar centralne zone i učestalost ulaska u centralnu zonu. Ovi parametri odražavaju spontanu lokomotornu aktivnost i istraživačku spremnost u nepoznatim uslovima sredine.

2.3.3 Test repnog ovjesa (TST)

Mišji repni dio bio je sigurno fiksiran, omogućavajući životinji da visi naglavačke iznad površine zemlje. Ukupno vrijeme snimanja bilo je šest minuta. Dokumentovano je trajanje nepokretnog vremena tokom kasnijeg segmenta od četiri minuta. Produženo vrijeme nepokretnosti predstavlja poboljšani status nalik depresivnom ponašanju-očajanju.

2.3.4 Test prisilnog plivanja (FST)

Prozirna cilindrična bačva za plivanje (prečnik 15 cm, visina 50 cm) napunjena je vodom održavane na (25 ± 2) stepena; dubina vode dostigla 20 cm. Svaki miš je nežno stavljen u posudu za plivanje u ukupnom intervalu snimanja od šest minuta. Statistički je kvantificirano vrijeme plutajuće nepokretnosti u posljednje četiri minute. Duži period nepokretnosti ukazuje na pojačanu performansu ponašanja u vezi sa očajem.

2.4 Sakupljanje uzoraka i priprema tkiva

U eksperimentalnoj terminalnoj točki 8. sedmice, miševi su podvrgnuti intraperitonealnoj injekciji 3% pentobarbital natrijuma (10 mL/kg) za duboku anesteziju. Uzorci krvi su uzeti tehnikom krvarenja uklanjanja očne jabučice. Nakon toga je izvršena cervikalno-dislokacija eutanazije. Hladna normalna fiziološka perfuzija srca očistila je cirkulirajuću krv unutar cerebralnih tkiva. Kompletni uzorci cijelog mozga brzo su secirani. Polovina moždanog tkiva je uronjena u 4% rastvor paraformaldehida za 72 sata fiksacije tkiva za kasniju histologiju. Regije mozga hipokampusa su brzo izolovane od preostalih uzoraka mozga na prethodno ohlađenoj ledenoj platformi i sačuvane u okruženju za skladištenje tečnog azota. Za biohemijsko mjerenje, 10 mg uzorka hipokampalnog tkiva pomiješano je sa prethodno ohlađenim normalnim fiziološkim rastvorom u odnosu mase i zapremine 1:9, podvrgnuto mehaničkoj homogenizaciji u ledenoj kupki. Homogenat tkiva je centrifugiran na 4000 r/min tokom 15 minuta, a frakcije supernatanta su sakupljene za ELISA biomarker kvantifikaciju.

2.5 Mjerenje biohemijskog indeksa

Prema uputstvima proizvođača za upotrebu komercijalnih ELISA kompleta, izmjereni su uzorci supernatanta seruma i hipokampalnog homogenata kako bi se dobile vrijednosti koncentracije monoaminskih neurotransmitera uključujući 5‑HT i DA. Supernatant hipokampalnog homogenata je dalje analiziran na indikatore inflamatornih medijatora iNOS, COX-2, PGE2, uz proinflamatorne citokine TNF-, IL-1, IL-18, IL-6 i IFN-. Očitavanja apsorbancije optičke gustoće su snimljena spektrofotometrom na mikroploči. Koncentracija proteina u uzorku je kalibrirana primjenom kompleta za kvantifikaciju BCA proteina prije detekcije citokina.

2.6 Hipokampalno histopatološko bojenje

Fiksni uzorci moždanog tkiva ugrađeni su u parafinski vosak i isječeni na histološke rezove debljine 4 µm. Za HE bojenje: parafinski rezovi su prošli kroz deparafinaciju ksilenom, gradijentnu hidrataciju etanolom, nuklearno bojenje hematoksilinom, kontra-bojenje eozinom, diferencijaciju hlorovodoničnog alkohola, gradijentnu dehidrataciju etanolom, tretman providnosti ksilenom i neutralnu gumu. Mikroskopsko promatranje fokusirano je na ćelijsku morfologiju, nuklearni status i strukturni integritet citoplazme unutar regije zupčastog vijuga hipokampusa.

Nissl bojenje vizualizira neuronske Nissl tjelešce koje odražavaju biosintetičku aktivnost neurona i vitalnost stanica. Odvoskane parafinske kriške su inkubirane u Nissl radnom rastvoru za bojenje. Nakon koraka pranja destilovanom vodom, sekcije su dehidrirane, prozirne procedure i zapečaćene. Pod optičkim mikroskopom uočene su histomorfološke varijacije neurona hipokampusa.

2.7 Imunohistohemijski test

Sekcije hipokampalnog tkiva ugrađene u parafin su devoskane i hidratizirane. Koraci preuzimanja antigena, blokiranja endogene peroksidaze i blokiranja nespecifičnog vezanja proteina su implementirani uzastopno. Rezovi tkiva su inkubirani preko noći na temperaturi od 4 stepena sa razblaženim primarnim antitelima: anti‑GFAP (1:400), anti‑Iba‑1 (1:400), anti‑NLRP3 (1:300), anti‑Caspase‑1 (1:400). Nakon inkubacije sekundarnih antitijela, izvedena je DAB hromogena reakcija. Procedure protiv bojenja jezgra, dehidracije i montaže su završene. Svetlosnim mikroskopom su snimljene digitalne slike vidnog polja. Softver za obradu slike Image-J izračunao je prosječne vrijednosti optičke gustine da bi semi-kvantitativno procijenio intenzitet ekspresije ciljnog proteina.

2.8 Imunofluorescentno bojenje

Pripremljeni parafinski presjeci hipokampusa su doživjeli operaciju deparavanja, uzimanja antigena i blokiranja. Primarna antitela anti-TLR4 (1:400) i anti-fosfo-NF-κB p65 (1:200) su primenjena i inkubirana preko noći na uslovima od četiri stepena Celzijusa. Fluorescentno označena sekundarna antitijela su dodana za jednosatnu inkubaciju pod statusom zaštite od svjetlosti. DAPI nuklearna kontra-boja je uključena u medij za montažu. Laserski fluorescentni mikroskop fotografisao je fluorescentne signale. Image-J softver je izračunao prosječan intenzitet fluorescencije koji predstavlja veličinu aktivacije proteina TLR4 i p-NF-κB p65.

2.9 Statistička analiza

Originalni eksperimentalni podaci obrađeni su pomoću SPSS 26.0 statističkog softvera i GraphPad Prism 9.0 grafičkog programa. Svi kvantitativni podaci o ishodu izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Međugrupna statistička poređenja vršena su odgovarajućim statističkim testovima. P-vrijednost manja od 0,05 ocijenjena je kao statistički značajna razlika; P< 0.01 represented highly significant statistical distinction.

3. Eksperimentalni rezultati

3.1 CPhGs poboljšan simptom anhedonije i obnovljeni nivoi monoaminskih neurotransmitera

Prije početka CUMS modeliranja, osnovne stope preferencije saharoze nisu pokazale očiglednu statističku varijaciju u svim eksperimentalnim životinjskim kohortama. Nakon četvoronedeljnog CUMS stresa plus četvoronedeljnih ciklusa intervencije, grupa CUMS-modela je pokazala izrazito smanjen odnos preferencije saharoze u odnosu na kontrolne životinje bez stresa (P< 0.01), demonstrating successful establishment of anhedonia depressive‑like phenotype. Serum and hippocampal tissue 5‑HT and DA concentrations in Mod group were significantly reduced compared with Con group (P < 0.05 or P < 0.01).

U poređenju sa kohortom modela Mod, grupe tretmana sa visokim, srednjim i niskim dozama CPhGs-a, kao i pozitivna grupa na fluoksetin generisale su značajno povećanje procenta preferencije saharoze, serumskog 5-HT, serumskog DA, hipokampalnog 5-DA i sadržaja hipokampalnog hipokampalnog< 0.05 or P < 0.01). Pharmacological improvement effect exhibited apparent dose‑dependent tendency; high‑dose CPhGs group achieved more robust biomarker‑rescue outcome than medium‑dose and low‑dose subgroups. This set of findings illustrated CPhGs could ameliorate anhedonic behavioral performance and reverse stress‑provoked depletion of key mood‑regulating monoamine neurotransmitters inside peripheral circulation and hippocampal brain tissue.

3.2 CPhGs poboljšana istraživačka aktivnost u testu otvorenog polja

U evaluaciji ponašanja na otvorenom polju, miševi CUMS-modela su pokazali značajno smanjenje ukupne udaljenosti kretanja, vremena boravka u centralnoj zoni i učestalosti ulaska u centralnu regiju u odnosu na kontrolni miš (P< 0.01). Chronic unpredictable stress suppressed spontaneous exploratory behaviors. Following CPhGs or fluoxetine intervention, those three open‑field‑test indicators increased observably (P < 0.05 or P < 0.01). High‑dose CPhGs‑treated mice displayed 46.63 % increase of total travel distance, 127.92 % growth of central‑zone residence time compared against Mod group. Medium‑dose and low‑dose CPhGs also produced measurable but weaker improvement effects. It indicated CPhGs alleviated stress‑induced suppression of autonomous exploration activity.

3.3 CPhGs skraćeno vrijeme nepokretnosti u paradigmama ponašanja zasnovanim na očaju

Test ovjesa repa i test prisilnog plivanja otkrivaju očaj u ponašanju, što predstavlja ključna očitanja ponašanja nalik depresiji. Grupa Mod je pokazala drastično produženo vrijeme nepokretnosti i u TST i FST (P< 0.01) relative to Con group. After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M, CPhGs‑L and FLX groups generated statistically significant shortening of immobility durations (P < 0.05 or P < 0.01). For forced‑swim immobility time, high‑dose CPhGs brought 34.67 % reduction; medium‑dose 30.71 % reduction; low‑dose 20.78 % reduction. For tail‑suspension immobile time: CPhGs‑H achieved 35.91 % decrease. Results suggested CPhGs mitigated despair‑related passive coping behavioral patterns triggered by long‑term unpredictable stress stimulation.

3.4 CPhGs smanjene prekomjerno izražene hipokampalne proinflamatorne citokine

Koncentracije proinflamatornih citokina hipokampusa (TNF‑, IL‑1, IL‑18, IL‑6, IFN‑) kod životinja na CUMS modelu bile su drastično povišene u poređenju sa kontrolnim kolegama (P< 0.01). After CPhGs intervention, these pro‑inflammatory cytokine contents descended in dose‑responsive fashion. High‑dose CPhGs generated the most powerful inhibitory influence. For instance, relative to Mod group, CPhGs‑H decreased TNF‑α level by 42.93 %, lowered IL‑1β by 45.72 %, and reduced IL‑18 by 35.17 %. Medium‑dose CPhGs delivered moderate anti‑inflammatory potency, and low‑dose group exerted limited but detectable inhibitory impacts. This data demonstrated CPhGs could suppress excessive pro‑inflammatory‑cytokine release inside hippocampal tissue under chronic‑stress challenge.

3.5 Biomarkeri inflamatornog medijatora hipokampusa regulirani prema dolje

Hipokampalni inflamatorni medijatori iNOS, COX‑2 i PGE2 kod miševa CUMS modela značajno su porasli (P< 0.01). After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M markedly diminished iNOS, COX‑2 and PGE2 concentrations (P < 0.05 or P < 0.01). Low‑dose CPhGs‑L group showed limited statistical significance for partial indicators. High‑dose CPhGs treatment group exhibited iNOS reduction rate reaching 49.55 %, COX‑2 reduction 39.58 %. Collectively, CPhGs suppressed stress‑induced up‑regulation of inflammatory‑mediator molecules inside hippocampus.

3.6 CPhGs atenuirana CUMS-pokrenuta patološka povreda neurona hipokampusa

HE staining results: hippocampal dentate‑gyrus neurons from Mod group presented severe pathological lesions: disordered cellular arrangement, nucleus pyknosis, cytoplasmic vacuolar degeneration, manifesting prominent neuronal damage. CPhGs‑L grupa je pokazala samo trivijalni efekat poboljšanja. Srednje i visoke doze CPhG-a očito su poništile takve patološke promjene; Grupa sa visokim dozama CPhGs‑H pokazala je superiorni efekat zaštite neurona u poređenju sa grupom sa fluoksetinom u parcijalnim vidnim poljima.

Ishodi bojenja po Nissl-u: Hipokampalni neuroni mod-grupe pokazali su neorganizirani raspored, upadljivo smanjenje količine Nissl-ovih tjelešca, što je odražavalo poremećenu sintetičku funkciju neurona i nisku ćelijsku vitalnost. Davanje CPhG-a dozno-ovisno je obnovilo obilje Nissl tijela. Morfologija neurona i gustina Nissl-telešaca unutar CPhGs-H grupe približile su se normalnom nivou kontrolne grupe. Histopatološki nalazi potvrdili su da CPhG štiti integritet hipokampalnog neurona od hroničnog razaranja posredovanog stresom.

3.7 CPhG regulirani status aktivacije hipokampalne glijalne ćelije

GFAP je specifičan biomarker za populaciju astrocita. U poređenju sa Con grupom, intenzitet pozitivnog signala hipokampalnog GFAP grupe Mod‑grupe je značajno opao (P< 0.01), indicating massive astrocyte functional impairment induced by CUMS stress. CPhGs‑H and CPhGs‑M intervention groups distinctly elevated GFAP expression level (P < 0.05 or P < 0.01); high‑dose CPhGs‑H enhanced GFAP average optical density by 64.23 % relative to Mod group. Low‑dose CPhGs‑L generated upward trend without statistical significance.

Iba‑1 proteinski marker predstavlja mikrogliju. Grupa modela CUMS pokazala je dramatično povećan Iba-1 signal pozitivne ekspresije (P< 0.01), implying robust microglia hyper‑activation. After CPhGs intervention, Iba‑1 expression intensity decreased dose‑dependently. CPhGs‑H produced 23.73 % reduction of Iba‑1 optical‑density value versus Mod group. It illustrated CPhGs preserved astrocyte abundance while dampening pathological microglia over‑activation inside hippocampal compartments.

3.8 CPhGs inhibirao ekspresiju proteina povezanu s hipokampalnim NLRP3‑inflamazomom

Imunohistohemijska detekcija pokazala je da je ekspresija NLRP3 i kaspaze-1 proteina unutar hipokampusa Mod-grupe bila izrazito povećana (P< 0.01). Following CPhGs treatment, NLRP3 and Caspase‑1 protein abundance declined dose‑responsively. High‑dose CPhGs‑H decreased NLRP3 expression by 50.00 %, lowered Caspase‑1 expression level by 57.65 %. It demonstrated CPhGs suppressed pathological NLRP3 inflammasome complex activation in CUMS‑damaged hippocampal tissue.

3.9 CPhGs potisnuta prekomjerna aktivacija TLR4/NF‑κB signalnog puta

Detekcija imunofluorescencije pokazala je da miševi CUMS-modela pokazuju značajno povećan intenzitet fluorescencije TLR4 receptora i fosforilirane NF-κB p65 podjedinice (P< 0.01). CPhGs intervention obviously reduced TLR4 and p‑NF‑κB p65 fluorescence signal strength (P < 0.05 or P < 0.01). Combined with above‑mentioned NLRP3 inflammasome‑protein detection results, these observations supported the inference: CPhGs inhibited TLR4/NF‑κB upstream signal‑cascade hyper‑activation, which sequentially restrained downstream NLRP3 inflammasome assembly and neuro‑inflammatory cascade amplification.

4. Diskusija

Veliki depresivni poremećaj predstavlja tešku neuropsihijatrijsku bolest. Posljednjih godina neuroinflamatorna teorija depresije privukla je široku istraživačku pažnju. Hronični ponavljajući psihološki stres može izazvati aktivaciju urođenog imunološkog sistema unutar centralnog nervnog sistema. Hipokampus, jedna regija mozga koja je vrlo osjetljiva na stresne uvrede, usko je povezana s modulacijom raspoloženja, obradom nagrađivanja i funkcijom pamćenja. Pod trajnom stresnom stimulacijom, homeostaza glijalnih ćelija hipokampusa pada. Hiperaktivirana mikroglija i oštećeni astrociti luče velike količine proinflamatornih citokina, što dovodi do oštećenja strukture neurona, metaboličkog poremećaja monoamin-neurotransmitera, što na kraju potiče pojavu ponašanja nalik depresiji.

Tradicionalni aktivni prirodni proizvodi dobiveni iz biljne medicine posjeduju višeciljane farmakološke prednosti, postajući obećavajući resursi kandidati za otkrivanje antidepresivnih lijekova. CPhG su prepoznatljive bioaktivne komponente izolirane izCistancheljekovito bilje. Ovo istraživanje je konstruiralo CUMS-indukovanu kroničnu stresnu depresiju na mišu, sveobuhvatno potvrđujući in vivo efikasnost CPhG s gradijentom doze nalik antidepresivima. Eksperimentalni rezultati u ponašanju pokazali su da je tretman CPhGs značajno ublažio simptome anhedonije, poboljšao istraživačku aktivnost i smanjio vrijeme nepokretnosti povezanog s očajem kod miševa modela depresije, pokazujući jasnu korelaciju doze i efekta.

Hipoteza monoaminskih neurotransmitera je klasična teorija o depresiji i patogenezi. Serotonin i dopamin preuzimaju ključne regulatorne uloge koje pokrivaju emocionalnu stabilizaciju, percepciju povratnih informacija o nagradi i modulaciju ponašanja vezanu za motivaciju. CUMS stres je doveo do očiglednog pada koncentracija 5‑HT i DA u serumu i hipokampalnom tkivu kod naših modelnih životinja. Intervencija CPhG-a je efikasno obnovila ova dva nivoa monoaminskih neurotransmitera. Ovaj rezultat je u skladu s ranije objavljenim istraživačkim izvještajima u veziCistancheekstrakti koji moduliraju moždane monoaminske neurotransmitere.

Dalje testiranje biokemijskih biomarkera otkrilo je da je CUMS inducirao snažno povećanje višestrukih proinflamatornih citokina (TNF‑, IL‑1, IL‑18, IL‑6, IFN‑) plus medijatora upale u tkivu kuka (iNOS, COX‑2). Intervencija CPhG-a značajno je preokrenula takav status prekomjerne ekspresije upale. Histopatološki HE i Nissl bojenje intuitivno su dokazali da CPhG ublažavaju oštećenje neurona hipokampusa uzrokovano stresom i štite morfološki integritet neurona.

Populacije glija ćelija služe kao centralni učesnici koji posreduju u neuroinflamatornim odgovorima. Astrociti održavaju recikliranje neurotransmitera, strukturnu stabilnost krvno-moždane barijere i opskrbu neurona ishranom. Mikroglija funkcionira kao rezidentne urođene efektorske ćelije unutar moždanog parenhima. Hronični stres izaziva gubitak astrocita ili funkcionalnu nesposobnost, uz patološku hiperaktivaciju mikroglije. Naši imunohistohemijski podaci su pokazali da je tretman CPhGs povećao gustinu GFAP-pozitivnih astrocita, dok je u međuvremenu smanjio Iba-1-označenu prekomjerno aktiviranu količinu mikroglije u hipokampusu. Ovo regulatorno svojstvo fenotipa glija ćelija može djelomično biti u osnovi neurozaštitne i farmakološke moći CPhG-a protiv depresije.

NLRP3 inflamasom predstavlja vitalnu molekularnu platformu koja posreduje neuro-inflamatornu kaskadu. Njegova aktivacija pokreće sazrijevanje i lučenje nizvodnih IL-1 i IL-18 proinflamatornih citokina. TLR4/NF‑κB signalna osa djeluje kao bitan uzvodni primarni signal za aktivaciju NLRP3 inflamasoma. TLR4 receptor stimulation promotes NF‑κB subunit phosphorylation and nuclear translocation, further trans‑activates NLRP3, pro‑IL‑1 gene transcription. In our present study, CUMS stress triggered concurrent enhancement for TLR4, phosphorylated NF‑κB p65, NLRP3 and Caspase‑1 protein expression. Intervencija CPhG-a izrazito je inhibirala aktivaciju cijele ove signalne kaskade. We therefore conclude that CPhGs alleviates neuro‑inflammatory injury partially by restraining TLR4/NF‑κB‑mediated NLRP3 inflammasome activation.

Uzeti zajedno, eksperimentalni dokazi našeg životinjskog modela podržavaju mehanistički model: CPhG stvaraju efekte nalik antidepresivima kod depresivnih miševa izazvanih CUMS-om kroz dvije primarne dimenzije: (1) obnavljanje homeostaze monoaminskih neurotransmitera povezanih s raspoloženjem (5-HT, DA); (2) moduliranje homeostaze hipokampalne glijalne ćelije i supresija neuroinflamatorne patološke kaskade zavisne od TLR4/NF-κB NLRP3 zavisne od inflamazoma.

Nekoliko ograničenja ove istrage zaslužuju razmatranje. Ovaj rad je samo implementirao in-vivo eksperimente na nivou životinja. Nismo izvršili mehaničku validaciju na nivou ćelije niti klinička ispitivanja na ljudima. Stoga bi translacijski zaključak prema terapiji ljudske depresije trebao ostati oprezan. Osim toga, ovo istraživanje nije analiziralo doprinose pojedinačnih monomernih jedinjenja (ehinakozid, verbaskozid) u mešanom ekstraktu CPhGs. Buduća istraživanja mogu se koncentrirati na mehaničku verifikaciju ćelijske kulture, poređenje aktivnosti pojedinačnih komponenti, kao i preliminarna pilot opservacija čovjeka i subjekta.

5. Zaključak

Cistanche feniletanol glikozidi (CPhG) proizvode značajna farmakološka dejstva nalik antidepresivima protiv hroničnih nepredvidivih fenotipova ponašanja nalik depresiji izazvanih blagim stresom kod C57BL/6 miševa. Its therapeutic‑related mechanisms are associated with recovery of serum and hippocampal serotonin and dopamine neurotransmitter levels, preservation of hippocampal neuronal structure integrity, modulation of astrocyte‑microglia functional equilibrium, as well as suppression of TLR4/NF‑κB/NLRP3 inflammasome‑mediated neuroinflamatorna patološka kaskada. This pre‑clinical animal study supplies experimental reference for further development of CPhGs as natural therapeutic adjuvant substance or functional‑food ingredient targeting depressive‑symptom improvement.

Reference

Ren L, Shao YT, Qin SH. Studija o identifikaciji cilja i efektu saponina A na depresivni poremećaj. Nat Prod Res Dev, 2024, 36:44‑51.

Fan L, Peng Y, Wang JW, et al. Ukupni glikozidi iz stabljike Cistanche tubulosa ublažavaju ponašanja nalik depresiji: dvosmjerna interakcija fitokemikalija i crijevne mikrobiote. Phytomedicine, 2021, 83:153471.

Fan L, Peng Y, Chen XN, et al. Integrirana analiza fitokemijskog sastava, farmakokinetike i mrežne farmakologije za ispitivanje razlika između stabljika Cistanche deserticola i C. tubulosa na osnovu antidepresivne aktivnosti. Hrana i funkcija, 2022, 13:8542‑8557.

Yirmiya R, Rimmerman N, Reshef R. Depresija kao mikroglijalna bolest. Trends in Neurosciences, 2015, 38:637‑658.

Jia XN, Gao ZH, Hu HL. Mikroglija u depresiji: trenutne perspektive. Science China-Life Sciences, 2021, 64:911-925.

Wu B, Gan AN, Wang RX, et al. Alpinia oxyphylla Miq. hlapljivo ulje ublažava depresivno ponašanje i inhibira neuroinflamaciju kod miševa izloženih CUMS-u tako što inhibira TLR4 posredovani MyD88/NF-κB signalni put. Journal of Chemical Neuroanatomy, 2023, 130:102270.