Abstract

Cistanche tubulosaje dragocjena tonik biljka koja se široko primjenjuje u tradicionalnoj kineskoj medicini. Feniletanoidni glikozidi predstavljeni ehinakozidom i akteozidom su njegove osnovne bioaktivne supstance. Ovo istraživanje ima za cilj optimizaciju savremenih parametara obrade zaCistanche tubulosakomadići dekocije za poboljšanje prinosa ehinakozida i akteozida i dalje istraživanje njegovog antioksidativnog stresa i antiinflamatornog mehanizma na ćelijskom nivou.

Provedeni su jednofaktorski eksperimenti, nakon čega je uslijedila optimizacija Box-Behnkenove površine odziva s debljinom kriške, vremenom parenja i temperaturom sušenja kao faktorima koji utiču. Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) je usvojena za detekciju sadržaja dva jedinjenja markera. Model povrede makrofaga RAW264.7 izazvan LPS-om je konstruisan da proceni farmakološke aktivnosti. Određene su reaktivne vrste kiseonika (ROS), dušikov oksid (NO), malondialdehid (MDA), aktivnosti antioksidativnih enzima uključujući sadržaj SOD, CAT, LDH i glutationa (GSH). ELISA je korištena za ispitivanje nivoa sekrecije proinflamatornih citokina TNF-, IL-1 i IL-6. Western blot test je izveden za analizu statusa fosforilacije ključnih proteina u signalnom putu p38/AKT/JNK/NF‑κB.

Optimalni uslovi obrade su bili debljina kriške od 0,6 cm, vreme parenja 6 min i temperatura sušenja 57 stepeni. Pod ovim uslovima sadržaj akteozida je dostigao 7,25 %, a ehinakozida 31,62 %. Ekstrakti iz optimiziranih komada dekokcije mogu značajno smanjiti prekomjernu proizvodnju intracelularnih ROS, NO i MDA u ćelijama RAW264.7 stimuliranim LPS. Pojačao je aktivnosti SOD, CAT, LDH i povećao intracelularni nivo GSH, dok je u međuvremenu značajno inhibirao oslobađanje TNF-, IL-1 i IL-6. Western-blot rezultati su pokazali da je ekstrakt smanjio omjer fosforilacije p-p38/p38, p-AKT/AKT, p-JNK/JNK i p-NF-κB/NF-κB.

Optimizovana tehnologija obrade parom i sušenjem može efikasno povećati stopu oporavka glavnih feniletanoidnih glikozidaCistanche tubulosa. Komadići dekokcije imaju antioksidativne i antiinflamatorne efekte protiv oštećenja ćelija izazvanih LPS-om kroz inhibiciju signalnog puta p38/AKT/JNK/NF‑κB. Ova studija daje praktične tehničke parametre za standardizovanu industrijsku preraduCistanche tubulosa, i nudi eksperimentalne dokaze za razvoj funkcionalne hrane i nutraceutskih proizvoda dobivenih iz ovog biljnog resursa.

Ključne riječi: Cistanche tubulosa; tehnologija obrade decoction-komada; acteoside; ehinakozid; antioksidativni stres; RAW264.7 makrofag; p38/AKT/JNK/NF‑κB put

1. Uvod

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight pripada porodici Orobanchaceae, a njen ljekoviti dio je osušena mesnata stabljika sa ljuskavim listovima. U Kini se ova biljka uglavnom sadi u sušnim regijama sjeverozapada, s najvećim područjem sadnje u južnom Xinjiangu. Kao dobro poznati biljni tonik, djeluje tako da tonizira bubrege-yang, nadoknađuje esenciju i krv i vlaži crijeva kako bi ublažio zatvor. Klinički se koristi za liječenje nedostatka bubrega-janga, insuficijencije esencijalne krvi, neplodnosti, bolova i slabosti u struku i koljenima, kao i zatvor suvoće crijeva.

Feniletanoidni glikozidi, uglavnom ehinakozid i akteozid, su primarne aktivne komponenteCistanche tubulosa. Prema zahtjevima kineske farmakopeje, ukupan sadržaj ehinakozida i akteozida u kvalificiranim medicinskim sirovinama ne smije biti manji od 1,50 %, što služi kao kritični pokazatelj ocjene kvaliteta. Tradicionalni pristupi obradi zaCistanche tubulosauglavnom koriste metode namakanja-kvašenja, rezanja-sušenja ili kuhanja vina na pari. Mnoštvo studija fokusira se na poboljšanje prinosa aktivnih komponenti, dok istraživanja koja kombinuju optimizaciju tehnologije obrade sa provjerom biološke aktivnosti ostaju nedovoljna.

Oksidativni stres djeluje kao uobičajena patološka osnova za više metaboličkih i upalnih bolesti. Postojeća istraživanja su dokazala da se ukupni glikozidi ekstrahiraju izCistanche tubulosamože potisnuti inflamatorni odgovor i aktivirati Nrf2/HO‑1 put za ublažavanje ozljede jetre kod životinja sa sepsom. Frakcije lignan glikozida iz ove biljke mogu ublažiti upalu makrofaga regulacijom PI3K/AKT signalizacije. Ipak, farmakološka svojstva modernih prerađenih komada dekokcije i njihov temeljni molekularni mehanizam još uvijek zahtijevaju daljnje istraživanje.

U ovoj studiji, Box-Behnken dizajn površine odziva primijenjen je na osnovu jednofaktorskih testova, uzimajući debljinu kriške, vrijeme parenja i temperaturu sušenja kao varijable za optimizaciju radnog toka obrade. Nakon dobijanja optimalnih tehničkih parametara, uspostavljen je model ćelije RAW264.7 izazvan LPS-om izazvan oksidativnim oštećenjem kako bi se procijenio antioksidativni stres i antiinflamatorni kapacitet i secirao relevantni signalni mehanizam. Ovaj rad ima za cilj da obezbedi stabilne i operativne parametre obrade za pilotsku proizvodnju i postavi eksperimentalne temelje za sveobuhvatno korišćenjeCistanche tubulosaresurse.

2. Materijali i metode

2.1 Biljni materijal, reagensi i instrumenti

Svježe mesnate stabljikeCistanche tubulosaubrane su u jesen iz Hotana, Xinjiang. RAW264.7 ćelije leukemije monocita-makrofaga miša kupljene su od Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, Kina).

HPLC acetonitril i metanol su nabavljeni od kompanije Merck. Referentne standarde za ehinakozid (veći ili jednaki 98%) i akteozid (veći ili jednaki 98%) isporučio je Pekinški institut za mjeriteljstvo North Weiye. Dimetil sulfoksid (DMSO) je kupljen od Sigma-Aldrich. DMEM medij s visokim sadržajem glukoze, fetalni goveđi serum (FBS), otopina dvostrukih antitijela penicilin-streptomicina, komplet za kvantifikaciju BCA proteina, kompleti za analizu NO, MDA, SOD, CAT, GSH i LDH, lipopolisaharid (LPS), MTT reagens i komercijalni proizvodi infltokinesa.

Eksperimentalni instrumenti su uključivali tečni hromatograf visokih performansi Shimadzu, rotacioni isparivač, mlevač kineskog bilja, termostatsku peć za sušenje, parni štednjak, čitač mikroploča pune talasne dužine, elektronsku analitičku vagu, hlađenu centrifugu, biosigurnosni mikroskopski ormarić.

2.2 Eksperiment obrade sa jednim faktorom

SvežeCistanche tubulosamesnate stabljike su izrezane na kriške debljine 0,2 cm, 0,4 cm, 0,6 cm, 0,8 cm, 1,0 cm i 1,2 cm. Kriške su parene 3 min, 6 min, 9 min, 12 min, 15 min, 18 min i 21 min, respektivno, i sušene pod različitim temperaturnim gradijentima uključujući sobnu temperaturu (25 stepeni), 40 stepeni, 50 stepeni, 60 stepeni, 70 stepeni i 80 stepeni. Osušeni uzorci dekokcijskih komada su usitnjeni i prosijani kroz sito od 40 mesh za naknadnu detekciju. Za sveobuhvatnu procjenu usvojena je kompozitna formula za bodovanje: Kompozitni rezultat=sadržaj ehinakozida × 50 % + sadržaj akteozida × 50 %.

2.3 HPLC određivanje akteozida i ehinakozida

Priprema rastvora uzorka: precizno izmeriti 1,0 g uzorka praha, dodati 100 mL 50 % rastvora metanola. Nakon 30-minutnog namakanja, ultrazvučna ekstrakcija je izvedena 40 min. Gubitak težine je dopunjen sa 50% metanola nakon hlađenja. Supernatant je filtriran preko 0,22 μm mikroporozne membrane prije HPLC injekcije.

Mješoviti referentno-standardni rastvor akteozida i ehinakozida pripremljen je sa 50% metanola i razrijeđen u serijske koncentracije za crtanje standardne krive. Uslovi hromatografije: COSMOSIL C₁₈ hromatografska kolona; sistem mobilne faze sastojao se od 0,1 % vodenog rastvora fosforne kiseline (A) i acetonitrila (B); talasna dužina detekcije je postavljena na 330 nm; temperatura kolone 35 stepeni; protok 1 mL/min. Za kvantitativni proračun ciljnih jedinjenja korištena je metoda eksternog standarda.

2.4 Eksperimentalni dizajn Box-Behnken Response-površine

Prema jednofaktorskim eksperimentalnim rezultatima, debljina kriške (X₁), vrijeme parenja (X₂) i temperatura sušenja (X₃) odabrani su kao nezavisne varijable. Sadržaj akteozida (Y₁, %) i sadržaj ehinakozida (Y₂, %) poslužili su kao vrijednosti odgovora. Softver Design-Expert 13.0 je korišćen za uspostavljanje trofaktorske trostepene Box-Behnken eksperimentalne šeme sa ukupno 17 grupa testova. Prilagođavanje modela, analiza varijanse i predviđanje parametara završeni su softverom. Praktični verifikacioni eksperimenti izvedeni su u tri primerka nakon podešavanja teoretskih optimalnih parametara kako bi odgovarali stvarnom proizvodnom pogonu.

2.5 Ćelijska kultura i priprema uzoraka

Uzorak decokcionog komada dobijen pod optimizovanim uslovima obrade pripremljen je u prah ekstrakta. Prašak je otopljen u DMSO i dalje razrijeđen kompletnim DMEM medijumom koji sadrži 10 % FBS i 1 % penicilin-streptomicina za eksperimente na ćelijama. RAW264.7 ćelije su uzgajane u vlažnom inkubatoru na 37 stepeni sa 5% CO₂.

2.6 MTT test za vitalnost ćelija

Suspenzija ćelija je inokulisana u ploče sa 96 jažica pri gustini ćelija od 8 × 10⁴ ćelija/mL. Grupe su postavljene kao kontrolna grupa otapala (0,1 % DMSO), grupa LPS modela (1 ug/mL LPS) i više koncentracionih grupaCistanche tubulosaekstrakt (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/mL). Nakon 2-satne pre-inkubacije uzoraka, dodan je LPS sa konačnom koncentracijom od 1 ug/mL osim kontrolnih jažica otapala i inkubiran još 24 h. MTT rastvor (5 mg/mL) je dodan tokom 4-satne reakcije. Nakon uklanjanja supernatanta, DMSO je dodat da se rastvori kristal formazana. Vrijednost apsorpcije na 490 nm detektirana je čitačem mikroploče da bi se izračunala vitalnost ćelije. Za prateće funkcionalne testove odabran je siguran raspon koncentracije.

2.7 Intracelularno ROS mjerenje

RAW264.7 ćelije su zasejane u ploče sa 6 jažica pri gustini od 4 × 10⁵ ćelija po jažici. Nakon prianjanja na zid, ćelije su prethodno tretirane gradijentom koncentracijeCistanche tubulosaekstrakt (12,5, 25, 50, 100 ug/mL) tokom 2 h, zatim stimulisan sa 1 ug/mL LPS tokom 24 h. Intracelularni nivo ROS detektovan je kompletom reagensa za fluorescentnu sondu. Intenzitet fluorescencije je zabilježen pri talasnoj dužini ekscitacije 488 nm i talasnoj dužini emisije 525 nm.

2.8 Detekcija NO, MDA, SOD, CAT, LDH i GSH

Supernatant ćelijske kulture je sakupljen kako bi se otkrio sadržaj NO pomoću Griessove metode. Ćelije su isprane prethodno ohlađenim PBS-om i lizirane na ledu. Ćelijski lizat je centrifugiran na 10 000 rpm ispod 4 stepena tokom 5 minuta da bi se dobio intracelularni supernatant. Sadržaj MDA, aktivnosti enzima nivoa SOD, CAT, LDH i GSH mjereni su striktno u skladu sa specifikacijama kompleta. BCA metoda je primijenjena za normalizaciju ukupne količine proteina.

2.9 ELISA detekcija proinflamatornih citokina

RAW264.7 ćelije su tretirane uzorkom i LPS tokom 16 sati. Supernatant kulture je sakupljen i centrifugiran na 10 000 o/min 10 min. Koncentracije sekrecije TNF‑, IL‑1 i IL‑6 su kvantificirane pomoću ELISA kompleta.

2.10 Western blot analiza

Nakon 45-minutne intervencije uzoraka i LPS-a, ukupni ćelijski protein je ekstrahiran korištenjem RIPA pufera za lizu. Koncentracija proteina je kvantificirana pomoću BCA kompleta. Jednaka količina uzorka proteina (50 ug za svaku traku) je denaturirana, odvojena SDS-PAGE elektroforezom i prebačena na PVDF membranu. Membrana je blokirana 5% rastvorom TBST obranog mleka tokom 1 h, a zatim inkubirana sa primarnim antitelima preko noći na 4 stepena. Nakon ponovljenog ispiranja sa TBST, sekundarno antitijelo je inkubirano na sobnoj temperaturi 1 h. Ciljne proteinske trake su vizualizirane ECL hemiluminiscencijskim reagensom. Provedena je analiza sivih skala traka da bi se izračunao odnos fosforilacioni protein/ukupni protein.

2.11 Statistička analiza

Za crtanje grafikona i statističku analizu korišten je softver GraphPad Prism 8.0.2. Jednosmjerna ANOVA i t-test su usvojeni za poređenje podataka.P < 0.05 represented statistically significant difference; P < 0.01 and P < 0.001 stood for higher significance. All experimental data were expressed as mean ± standard deviation (\(\bar{x}\pm s\)).

3. Rezultati

3.1 Jednofaktorski eksperimentalni rezultati

Debljina preseka imala je značajan uticaj na sadržaj ciljnih glikozida. Kriške debljine 0,2 cm lako su se preparile, što je izazvalo termičku razgradnju aktivnih sastojaka. Predebele kriške ometale su oslobađanje unutrašnjih aktivnih supstanci. Kada je vrijeme parenja bilo fiksirano na 10 minuta, a temperatura sušenja na 60 stepeni, 0,4 cm je bio optimalni parametar debljine kriške u jednofaktorskom prosejavanju.

Nedovoljno vrijeme parenja nije moglo u potpunosti uništiti strukturu biljnih stanica i dovelo je do niskog prinosa glikozida. Kada je vrijeme parenja premašilo 6 minuta, došlo je do raspadanja tkiva i degradacije ehinakozida i akteozida. Pod fiksnom debljinom kriške od 0,4 cm i temperaturom sušenja od 60 stepeni, 6 min je bio najbolji uslov za vreme parenja.

Unutar određenog opsega, sadržaj feniletanoidnih glikozida je rastao zajedno sa povećanjem temperature sušenja, ali je degradacija nastupila kada je temperatura prešla 60 stepeni. Sa debljinom kriške od 0,4 cm i vremenom parenja od 6 minuta, 60 stepeni je pokazao najbolje sveobuhvatne performanse u jednofaktorskom skriningu.

3.2 Test optimizacije i verifikacije površine odziva

Analiza varijanse je pokazala da su regresijski modeli za sadržaj akteozida i ehinakozida značajni (P < 0.05, P < 0.01). The lack‑of‑fit term was non‑significant (P >0,05), što ukazuje na dobar stepen uklapanja modela. Koeficijent determinacije R² bio je blizu 1, što je dokazalo visoku korelaciju između predviđene vrijednosti i stvarnih eksperimentalnih podataka.

Redoslijed utjecaja faktora za sadržaj akteozida bila je debljina kriške > temperatura sušenja > vrijeme parenja. Za sadržaj ehinakozida red je bio vrijeme kuhanja na pari > temperatura sušenja > debljina kriške.

Teoretski optimalni parametri izračunati softverom su bili debljina kriške 0,600 cm, vrijeme parenja 5,685 min i temperatura sušenja 57,009 stepeni. Uzimajući u obzir praktične uslove proizvodnje, parametri su podešeni na debljinu kriške 0,6 cm, vreme parenja 6 min i temperaturu sušenja 57 stepeni. Tri grupe paralelnih verifikacionih eksperimenata dobile su sadržaj akteozida od 7,25 % i sadržaj ehinakozida od 31,62 %. Odstupanje između praktične vrijednosti i teorijske predviđene vrijednosti iznosilo je 3,89 % odnosno 4,92 %, što je pokazalo pouzdanost ovog modela odzivne površine.

3.3 Rezultat provjere vitalnosti ćelije

Unutar raspona koncentracija od 0-100 ug/mL,Cistanche tubulosaEkstrakt decoction-komada nije imao očiglednu citotoksičnost na ćelijama RAW264.7 i pokazao je blagi efekat podsticanja proliferacije. Kada je koncentracija dostigla 200 ug/mL i više, vitalnost ćelija se značajno smanjila. Stoga su 12,5 ug/mL, 25 ug/mL, 50 ug/mL i 100 ug/mL odabrane kao radne koncentracije za naredne eksperimente na ćelijama.

3.4 Utjecaj na intracelularni nivo ROS

U poređenju sa kontrolnom grupom otapala, grupa LPS modela pokazala je značajno povećan intenzitet fluorescencije unutarćelijske ROS (P < 0.001), proving the successful establishment of oxidative‑stress injury model. Pretreatment of Cistanche tubulosaekstrakt smanjuje prekomjernu akumulaciju ROS na način ovisan o dozi (P < 0.001 versus model group).

3.5 Uredba o NO, MDA i indikatorima vezanim za antioksidanse

LPS stimulacija je izazvala oštar porast sadržaja NO i MDA u ćelijama RAW264.7. U poređenju sa grupom LPS modela, intervencija ekstrakta je značajno snizila nivo NO sa tendencijom ovisnosti o dozi. 12.5 ug/mL ekstrakt nije proizveo očigledan učinak na sadržaj MDA, dok je ekstrakt od 25-100 ug/mL uočljivo smanjio koncentraciju MDA (P < 0.001).

Nakon tretmana LPS, aktivnosti SOD, CAT, LDH i intracelularnog GSH sadržaja su se značajno smanjile . 12.5 ug/mL ekstrakt bi mogao poboljšati aktivnost SOD bez poboljšanja aktivnosti CAT i LDH. Ekstrakt u koncentraciji od 25-100 ug/mL značajno je povećao aktivnosti enzima SOD, CAT, LDH i sadržaj GSH na način ovisan o koncentraciji.

3.6 Inhibicijski učinak na lučenje proinflamatornih citokina

LPS stimulacija je pokrenula masovno oslobađanje TNF-, IL-1 i IL-6 u makrofagima RAW264.7.Cistanche tubulosaPredtretman ekstraktom decoction-komada značajno je potisnuo lučenje tri gore navedena proupalna citokina (P < 0.001), presenting prominent dose‑dependent anti‑inflammatory property.

3.7 Modulacija na p38/AKT/JNK/NF‑κB signalnom putu

U poređenju sa kontrolnom grupom otapala, LPS intervencija povećala je omjer fosforilacije p-p38/p38, p-AKT/AKT, p-JNK/JNK i p-NF-κB/NF-κB. Grupe ekstrakata sa srednjim i visokim dozama značajno su smanjile omjer p-p38/p38 i p-JNK/JNK. Sve koncentracijske grupe su smanjile nivo p-AKT/AKT i p-NF-κB/NF-κB (P < 0.05 or P < 0.001). Results illustrated that optimized Cistanche tubulosaEkstrakt decoction-piece-a obuzdao je aktivaciju p38/AKT/JNK/NF-κB signalnog puta inhibiranjem fosforilacije proteina.

4. Diskusija

Trenutni zahtjevi obrade zaCistanche tubulosazabilježeni u kineskoj farmakopeji opisuju samo kvalitativne operativne korake bez preciznih kvantitativnih parametara. Prethodna istraživanja su pokazala da bi različite metode prerade uzrokovale velike razlike u hemijskom sastavu i farmakološkoj aktivnosti između sirovog i prerađenog.Cistanche tubulosauzorci. Prerađeni proizvodi pokazuju bolje antioksidativne i imunoregulatorne performanse u odnosu na sirovine.

U ovom istraživanju, moderna obrada parom i sušenjem optimizirana metodologijom odgovorne površine postigla je mnogo veći prinos ehinakozida i akteozida od mnogih tradicionalnih tehnika obrade. To sugerira da precizna kontrola debljine kriške, trajanja parenja i temperature sušenja može učinkovito zadržati i poboljšati sadržaj feniletanoid-glikozida uCistanche tubulosa.

Oksidativni stres i upala su usko povezani patološki procesi. Prekomjerni ROS dovodi do peroksidacije lipida i akumulacije MDA; u međuvremenu aktivira nizvodne inflamatorne kaskade i potiče stvaranje NO i višestrukih proinflamatornih citokina. Inflamatorni medijatori dodatno ubrzavaju proizvodnju ROS-a i formiraju začarani patološki ciklus. Naši ćelijski eksperimentalni rezultati su pokazali da je to optimiziranoCistanche tubulosaEkstrakt decoction-komada bi mogao eliminirati suvišne ROS, smanjiti markere oksidativnog oštećenja NO i MDA, obnoviti aktivnost antioksidativnog enzimskog sistema predstavljenog SOD, CAT, LDH i nadoknaditi intracelularni GSH, kao i inhibirati oslobađanje proinflamatornih citokina sa očiglednim odnosom doza-efekat.

p38, JNK koji pripada porodici MAPK i AKT-NF-κB osa su centralna čvorišta za transdukciju signala koja posreduju oksidativno-inflamatorni odgovor makrofaga. LPS stimulacija potiče fosforilaciju p38, JNK i AKT, dalje aktivira NF-κB i inducira transkripciju brojnih proinflamatornih gena. Podaci Western-blot-a su to otkriliCistanche tubulosaEkstrakt decoction-piece-a je blokirao aktivaciju fosforilacije p38, JNK, AKT i NF‑κB. Zaključuje se da ehinakozid i akteozid s visokim sadržajem iz optimizirane obrade zajednički doprinose suzbijanju signalne kaskade p38/AKT/JNK/NF‑κB, kako bi se ublažio oksidativni stres uzrokovan LPS i upalne ozljede u RAWmacroph.7.

Još uvijek postoje ograničenja u ovoj studiji. Sve farmakološke evaluacije su završene na in-vitro ćelijskom modelu. Potrebni su daljnji eksperimenti na životinjama kako bi se potvrdila in vivo efikasnost i metaboličke karakteristike prerađenihCistanche tubulosadecoction komada.

U zaključku, ova studija je utvrdila mjerljivu i skalabilnu modernu tehnologiju obrade zaCistanche tubulosadecoction komada. Pod parametrima obrade debljine kriške 0,6 cm, vremena parenja 6 min i temperature sušenja 57 stepeni, sadržaj glavnih feniletanoidnih glikozida je značajno poboljšan. Prerađeni komadići dekokcije mogu ublažiti oksidativni stres i upalna oštećenja u makrofagima RAW264.7 stimuliranim LPS-om inhibiranjem signalnog puta p38/AKT/JNK/NF-κB. Ovo istraživanje pruža praktičnu tehničku referencu za industrijaliziranu proizvodnju i nudi eksperimentalnu osnovu za razvoj funkcionalne hrane i proizvoda dijetetskih suplemenata porijeklom iz Xinjianga.Cistanche tubulosa.

Priznanja

Ovaj rad je podržan od strane Projekta kultivacije kapaciteta za inovacije u razvoju nauke i tehnologije na Akademiji poljoprivrednih nauka u Xinjiangu (xjnkq‑2022022) i „Tianchi Doctor Programme“ u Xinjiangu (2021).

Reference

[1] Lin J, Yu H, Zhao Y, et al. Ekstrakcija ehinakozida izCistanche tubulosai istraživanje njegovog zaštitnog efekta na ozljedu jetre kod pacova sa sepsom.Nauka o hrani i tehnologija. 2023;43:e010523.

[2] Guo J, Tang S, Miao Y, et al. The anti‑inflammatory effects of lignan glycosides fromCistanche tubulosaproizlazi iz ćelija makrofaga RAW264.7 izazvanih LPS/IFN-om putem PI3K/AKT puta.Current Pharmaceutical Biotechnology. 2021;22(10):1380‑1391.

[3] Rani V, Deep G, Singh RK, et al. Oksidativni stres i metabolički poremećaji: Patogeneza i terapijske strategije.Nauke o životu. 2016;148:183‑193.

[4] Martínez-de-Toda I, Ceprián N, Díaz-de-Castro E. Uloga starenja oksi-inflamacije u ljudskoj patofiziologiji.Ćelije. 2021;10(11):2974.

[5] Chung YC, Song SJ, Lee A, et al. Isobavachin ublažava upalne odgovore izazvane lipopolisaharidima u makrofagama i zebricama potiskivanjem MAPK i NF-κB signalnih puteva.Časopis za etnofarmakologiju. 2024;321:117501.