Wen-Lan Li, Jing-Xin Ding, Jing Bai, Yang Hu, Hui Song, Xiang-Ming Sun, Yu-Bin Ji

Kontakt: joanna.jia@wecistanche.com

Abstract

LC tehnologija je priznata metoda koja se koristi širom svijeta za procjenu kvaliteta tradicionalnih kineskih lijekova (TCM). Kvalitet TCM ima direktan uticaj na njegovu efikasnost. Stoga, da bi se temeljno otkrilo kako TCM ispoljava svoju djelotvornost, prije svega je potrebno razumjeti materijalnu osnovu za njegovu djelotvornost, a zatim i kontrolisati kvalitetu aktivnih spojeva. Primjena metode odnosa spektra i efekta je ključna za određivanje farmakološke materijalne osnove. Cilj ovog rada bio je istražiti osnovne korelacije između hemijskih profila i estrogenske aktivnostiCistanche, za otkrivanje aktivnih spojeva. Hemijski profiliCistanchesu zabilježeni pomoću HPLC/Q-TOF-MS/MS, a estrogenska aktivnost je određena testom rasta materice i MTT testom. Zatim je kombinovanjem rezultata bivarijatne analize, analize glavnih komponenti i metode analize sivih korelacija identifikovano petnaest aktivnih jedinjenja. To su 8-epiloganska kiselina, salidrozid, siringalid A 3'- -l-ramnopiranozid, cistanozid A,echinacoside, cistanozid F, cistanozid B, cistanozid C, osmantuzid B, akteozid, izoakteozid, tubulozid B, 2'-acetilakteozid i dva nepoznata jedinjenja. Ova studija postavlja temelje za in vivo studijeCistanche, te za razvoj njegove kliničke primjene.

Cistanche može povećati estrogen, kliknite ovdje da saznate više

Ključne riječi:Cistanchedeserticola; LC/Q-TOF-MS; estrogenska aktivnost; analiza glavnih komponenti (PCA); Test rasta materice.

Skraćenice

TCM: Tradicionalna kineska medicina

HPLC/Q-TOF-MS: tečna hromatografija visokih performansi/kvadrupolna vremenska masena spektrometrija

BA: bivarijatna analiza

PCA: analiza glavnih komponenti

GCAM: metoda analize sivih korelacija

MTT :Tripsin, 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolijumbromid

DMSO: dimetil sulfoksid

RPMI1640 Memorijalni institut Roswell Park 1640

1. Uvod

U posljednje vrijeme TCM postaje sve popularniji u azijskim i zapadnim zemljama zbog svojih stabilnih terapijskih učinaka i niske toksičnosti u klinici. Kao rezultat toga, potrebno je razviti nove tipove TCM-a i razumjeti efikasne kompozicije koje se koriste tokom njihove kliničke primjene [1-6].

Prvo, proučava se odnos spektra i efekta kako bi se uočila korelacija između hromatografskog otiska prsta i farmakodinamičke efikasnosti. Zatim koristeći odnos za traženje efektivnih komponenti u TCM-u i za formulisanje kontrolnih standarda koji odražavaju njihov interni kvalitet. Odnos spektra i efekta primijenjen je u mnogim područjima istraživanja TCM, kao što su materijalna osnova jednostrukog i složenog TCM, kompatibilnost komponenti, mehanizam obrade, prognoza farmakološkog efekta i optimizacija tehnologije [7-12]. Odnos spektra i efekta koristi se za iznošenje novih ideja i metoda za istraživanje aktivnih supstanci, optimizaciju formula, poboljšanje procesa pripreme, praćenje i odvajanje ciljnih sastojaka, te za razvoj novih TCM lijekova [13-17].

Cistanchenaširoko se koristi za liječenje seksualne disfunkcije, zatvora, prostatitisa i nedostatka bubrega. Ima širok spektar bioaktivnosti uključujući estrogenski efekat, anti-aging, antioksidativno i imunološko djelovanje [18-19]. Generalno, feniletanoidni glikozidi (kao što su cistanozid A, tubulozid A), lignani i iridoidni glikozidi smatrani su farmakološkim sastojcima i hemijskim markerima za kontrolu kvaliteta Cistanchea i njegovih proizvoda [20-21]. Hemijski spektriCistancheiz različitih područja snimljeni su tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC) [22-23]. U ovoj studiji odabrali smo test rasta materice i test proliferacije ćelija MCF7 kako bismo procijenili njihove estrogenske aktivnosti. Za korelaciju estrogenske aktivnosti sa pojedinačnim komponentama korištene su metode analize glavnih komponenti, bivarijantne analize i analize sivih korelacija. Ova studija je imala za cilj da identifikuje bioaktivna jedinjenja Cistanchea odgovorna za in vivo estrogene efekte. Studija postavlja temelj za dubinsko proučavanjeCistanche.

Svi eksperimentalni postupci su pregledani i odobreni od strane Etičkog odbora za životinje Harbinskog univerziteta trgovine.

Cistanchedeserticola(cd-20120227-005) je kupljen na tržištu droge i identifikovan od strane prof. Zhang Deliana (Harbin University of Commerce). Dietilstilbestrol je kupljen od HEFEI JIULIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD. RPMI1640 i RPMI1640 bez fenol crvenog su kupljeni od kompanije HyClone (SAD). MTT i DMSO su svi kupljeni od Sigma-Aldrich Co. LLC (St Louis, SAD). Ćelijska linija raka dojke kod ljudi MCF7 osigurana je od strane Istraživačkog centra za prirodne nauke i nauke o životnoj sredini (Harbin University of Commerce). Korišteni standardi su sljedeći: akteozid (111530- 200505), ehinakozid (111670-200503) i salidrozid (110736-200628) dobijeni su od Nacionalnog instituta za kontrolu farmaceutskih i bioloških proizvoda (Peking , Kina). Acetonitril, metanol i mravlja kiselina bili su MS kvaliteta, dok je voda bila ultra čista. Ostali reagensi su bili analitičkog kvaliteta i bili su komercijalno dostupni.

EchinacosideinCistanchetubuloza ima mnogo efekata

2 Eksperimentalni postupak

2.1 Materijali

Agilent 1290 HPLC sistem, Agilent 6530 serija Quadrupole Time-of-Flight LC/MS (Q-TOF) sistem i hemijske HPLC-3D radne stanice su korištene za analitičke hemijske eksperimente i obradu podataka. Za pripremu uzoraka i standarda korištena je Milli-Q ultračista voda. Dodatni instrumenti uključivali su elektronsku analitičku vagu AR1140 (Ohaus International Ltd), čitač mikroploča 680 (Bio-Rad Corporation) i 64R brzu centrifugu (Beckman Coulter Allegra).

Nezrele ženke Kunming miševa (oko 21 dan od rođenja, odbijene) težine (12 ± 2) g, kupljene su od laboratorijskog centra za životinje na bazi nacionalne biološke industrije u Changchun (Changchun, Kina). Miševi su bili smešteni u prostoriji sa regulisanom temperaturom (22 ± 2 stepena) sa neograničenim pristupom hrani i vodi. Eksperimentisanje na životinjama započeto je nakon pet dana aklimatizacije. Miševi su držani na gladovanju preko noći sa slobodnim pristupom vodi prije primjene testnih otopina. Ova studija je sprovedena u strogom skladu sa preporukama u Vodiču za njegu i upotrebu laboratorijskih životinja Nacionalnog instituta za zdravlje.

2.2 Priprema otopine uzorka

Cistanche uzorci su prikupljeni iz deset različitih staništa, odnosno Neimeng, Xinjiang, Ningxia, Guizhou, Chaidamu, Xizang, Alashan, Qinghai, Sichuan i Hubei Province.

Otopina (10 g/mL) uzorka Cistanche pripremljena je u destilovanoj vodi za oralnu primjenu. Koncentracija dietilstilboestrola bila je 20ug/mL i korištena je kao pozitivna kontrolna otopina. Otopina (10 g/mL) uzorka Cistanche pripremljena je u 50 posto acetonitrila. Akteozid, ehinakozid i salidrozid (po 2,0 mg) rastvoreni su u 10 mL 50% rastvora acetonitrila. I uzorak i standardna otopina su filtrirani pomoću 0.45-μm filtera prije analize.

2.3 LC-MS uslovi

Za analizu uzoraka korišten je Waters Symmetry Shield RP18 (3,9 mm×150 mm, 5μm; Waters Corporation, Milford, MA, USA). Mobilna faza se sastojala od acetonitrila (A) i 0,2 posto (v/v) vodenog rastvora mravlje kiseline (B) i pumpana je pri brzini protoka od 0,5 mL/min. Zapremina injekcije svakog uzorka bila je 10 μL. Gradijentni program eluiranja bio je sljedeći: Mobilna faza A je pokrenuta na 5 posto i linearno je povećana na 23 posto na 35 min. Rastvor A je naknadno povećan na 25 posto (35 do 65 min). Mobilna faza A je zatim smanjena na 5 posto u posljednjih 5 minuta vožnje (65 do 70 minuta). Temperatura kolone je održavana na 30 stepeni. Kromatogrami su praćeni na 254 nm. Pritisak plina atomizacije bio je 30 psi, a kapilarni napon 3,5 kV. Brzina protoka suvog gasa je podešena na 8 L/min sa temperaturom od 30 stepeni. Maseni spektri su snimljeni unutar opsega skeniranja od 100- 3,000 Da i bili su u načinu skeniranja negativnih jona.

2.4 Procjena otiska prsta

LC otisci prstiju uzoraka prikupljenih iz 10 različitih serija su uspostavljeni i automatski upareni pomoću sistema za procjenu sličnosti za hromatografski otisak prsta TCM-a (verzija 2012; Kineski farmakopejski komitet, Peking, Kina). Nadalje, referentna hromatogramska karta generirana je metodom medijana. Dodatno, primijenjena je klaster analiza za procjenu kvaliteta uzoraka iz deset različitih staništa.

2.5 Analiza glavnih komponenti (PCA)

PCA je multivarijatna statistička metoda. Može zadržati dovoljno informacija iz prikupljanja podataka. U ovoj studiji, karakteristični pikovi iz LC hromatograma su dalje pregledani pomoću PCA sa ciljem da se identifikuju aktivne supstance na osnovu odnosa spektra i efekta.

2.6 Test rasta materice

Miševi su podijeljeni u 12 grupa (10 po grupi). Otopine uzoraka koje su pripremljene od Cistanchea sakupljene su iz deset različitih staništa i davane su dva puta dnevno (ujutro i uveče) gavažom u dozi od 30 g/kg tjelesne težine četiri dana. Slijepe i pozitivne kontrolne grupe sadržavale su jednake količine destilovane vode i otopine dietilstilboestrola i davane su dva puta dnevno tokom četiri dana. Petog dana anesteziranim miševima su uzeti uzorci krvi koji su sadržavali lijek. Uzorci su centrifugirani (5,000 o/min, 10 min), a supernatanti (uzorci seruma koji sadrže lijek) su odvojeni. Uzorci seruma koji sadrže lijek su inaktivirani zagrijavanjem na 56 stepeni u vodenom kupatilu u trajanju od 30 minuta i filtrirani kroz filter od 0.22- μm prije MTT testa. Istovremeno, materice miševa su odmah izrezane i izvagane da bi se izračunali indeksi težine materice. Eksperimentisanje na životinjama započeto je nakon pet dana aklimatizacije. Miševi su postili preko noći sa slobodnim pristupom vodi prije primjene testnih otopina. Ova studija je sprovedena u strogom skladu sa preporukama Vodiča za njegu i upotrebu laboratorijskih životinja Nacionalnog instituta za zdravlje. Svi eksperimentalni postupci su pregledani i odobreni od strane Etičkog odbora za životinje Harbinskog univerziteta trgovine. Sve potencijalno stresne procedure izvedene su pod anestezijom natrijum pentobarbitalom.

2.7 MTT test

MCF7 ćelije su zajedno kultivisane sa RPMI 1640 bez fenol crvenog (sadrže 5 procenata CDT-FBS) četiri dana. Ćelije su zasijane u 96-ploče sa jažicom u gustini od 2,000 ćelija/bunariću. Postignuta je adherentna kultura i nakon 72 h kulture, ćelije su zajedno kultivisane u medijumu RPMI 1640 koji sadrži uzorke seruma miševa tretiranih Cistancheom. Eksperimenti su izvedeni u šest ponavljanja. Nakon toga, 20 μL MTT rastvora (5 mg/mL u PBS) je dodato u svaku jažicu, a ćelije su inkubirane 4 h. Nakon uklanjanja medija, dodano je 150 µL DMSO da bi se dobio formazanski produkt, a ploče su protresene u mraku da se potpuno rastvore. Apsorbanca je izmjerena na 570 nm pomoću čitača mikroploče. Brzina proliferacije izračunata je kao prosječna vrijednost apsorpcije serumske grupe koja sadrži lijek podijeljena sa prosječnom vrijednošću apsorpcije slepe kontrolne grupe (ćelije koje su kultivisane u RPMI 1640 bez seruma).

2.8 Statistička analiza

T-test uparenog uzorka (dvostrani) je korišten za identifikaciju statistički značajnih razlika između vrijednosti u slepoj kontrolnoj i eksperimentalnoj grupi. Razlike su se smatrale značajnim na nivou pouzdanosti od 95 posto (p <>

PCA je korišten za procjenu karakterističnih površina vrhova u hromatogramima uzoraka iz deset različitih staništa. Bivarijantna analiza i Grey korelaciona analiza korištene su za procjenu korelacije vršnih površina i njihove estrogenske aktivnosti. Korelacija je izračunata pomoću statistike softvera SPSS statistike (SPSS za Windows 21.0, SPSS Inc., SAD). Razlike su se smatrale značajnim na nivou pouzdanosti od 95 posto (dvostrano).

Etičko odobrenje: Provedeno istraživanje nije vezano za upotrebu ljudi ili životinja.

cistanche acteoside imaju mnogo funkcija

3 Rezultati i diskusija

3.1 Klaster analiza i procjena sličnosti

Relativna standardna devijacija vremena zadržavanja i površine vrha karakterističnih pikova iznosila je {{0}}.58 i 0.34 posto za preciznost, 0.52 i {{8} }.31 posto za ponovljivost, i {{10}}.19 i 0.13 posto za stabilnost, respektivno. Ovi nalazi su pokazali da je naša LC metoda utvrđivanja otiska prsta razumna i pouzdana. Sličnosti hromatograma deset uzoraka bile su veće od 0,9. Zajednički vrhovi za sve uzorke nisu mogli u potpunosti predstavljati karakteristične sastojke Cistanchea, jer je vrh mogao biti izgubljen. Stoga je broj podudaranja uzorka podešen sa 26 na 20 kako bi se dobila preciznija mapa hromatograma. Dobijeno je ukupno 26 pikova, a zbir njihovih površina bio je veći od 0,8 u poređenju sa ukupnim površinama pikova u uzorku. Stoga smo zaključili da ovi hromatografski vrhovi mogu efikasno odražavati glavne hemijske sastojke Cistanchea. Rezultati klaster analize prikazani su na slici 1. Ukupno deset raznolikih staništa podijeljeno je u tri kategorije kako slijedi: (A) 2, Guizhou; 3, Qinghai; 4, Chaidamu; 10, Neimeng; 7, Xinjiang i 6, Sichuan. (B) 1, Xizang; 8, Ningxia i 5, Alashan. (C) 9, Hubei. Trend klaster analize pokazao je da su staništa ljekovitog bilja slična kada se nalaze na dnu praga. Ali sa povećanjem praga, klima i uslovi rasta staništa su bliski. To pokazuje da klaster analiza ne samo da može dobro razlikovati različita staništa, već i odražavati afinitete između njih.

3.2 Identifikacija hemijskih sastojaka

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0.8). Što je veća apsolutna vrijednost Eigen opterećenja, veći je utjecaj spojeva na estrogenske indekse.

Upoređeni su hromatogrami Cistanchea i standardnih uzoraka da bi se identifikovale pojedinačne komponente pod istim LC-MS uslovima. Kao što je prikazano u tabeli 1, identifikovano je ukupno 26 sastojaka na osnovu vremena zadržavanja i MS podataka [24-26]. Aktivni sastojci se daju oralno u obliku mješavina, a ne u obliku monomera, jer je tradicionalna kineska medicina u obliku mješavine koja ima terapeutsku ulogu. Nije utvrđeno da jedno jedinjenje nakon pojedinačnog odvajanja nije igralo ulogu. Naš cilj je otkriti jedinjenja koja imaju estrogensku aktivnost u poznatim komponentama Cistanchea [23-30], te stoga nismo odabrali NMR i druga tehnička sredstva za validaciju njihovog identiteta. Pik 1 je ukazivao na dominantan deprotonirani jon sa m/z odnosom od 373 (C16H22O10), što je bilo identično elementarnom sastavu geniposidne kiseline. Ovo je potkrijepljeno gubitkom glukoznog dijela koji je dao fragment jona s omjerom m/z od 211. Pik 2 je ukazivao na dominantan deprotonirani ion sa m/z omjerom od 461 (C20H30O12), koji je bio identičan elementarnom sastavu dekafeoilakteozida, a podržano je gubitkom ramnozilnog dijela, formirajući fragmentaciju sa m/z omjerom od 315. Pik 4 je ukazivao na dominantan deprotonirani ion sa m/z omjerom od 375 (C16H24O10), koji je bio identičan elementarni sastav 8-epiloganske kiseline. Gubitak glukoznog dijela, koji je formirao fragmentaciju s omjerom m/z od 213, dodatno je podržao zaključak. Pik 6 je ukazivao na dominantan deprotonirani jon sa m/z odnosom od 607 (C29H36O14), koji je bio identičan elementarnom sastavu siringalida A3'{30}} l-ramnopiranozida.

Gubitak caff ostatka, koji je formirao fragment jona sa m/z odnosom od 445, dodatno je potkrepio zaključak. Pik 8 je ukazivao na dominantan deprotonirani ion sa m/z odnosom od 799 (C36H48O20), koji je bio identičan elementarnom sastavu cistanozida A. Gubitak caff dela, formirao je fragment ion sa m/z odnosom od 637, dodatno potkrepio zaključak. Pik 11 je ukazivao na dominantan deprotonirani ion sa m/z odnosom od 487 (C21H28O13), koji je bio identičan elementarnom sastavu cistanozida F. Ovo je potkrijepljeno gubitkom ramnozilnog dijela koji je dao fragment jona s m/z omjerom od 341, a gubitak drugog dijela caffa formirao je fragment jona sa omjerom m/z od 179, što je dodatno potkrepilo zaključak. Pik 12 je ukazivao na dominantan deprotonirani ion sa m/z odnosom od 813 (C37H50O20), koji je bio identičan elementarnom sastavu cistanozida B. Gubitak glukoznog dela, formirao je fragment ion sa m/z odnosom od 651, dodatno potkrepio zaključak. Pik 13 je ukazivao na dominantan deprotonirani jon sa m/z odnosom od 827 (C37H48O21), koji je bio identičan elementarnom sastavu tubulozida A. Gubitak ramnozilnog dela formirao je fragmentaciju sa m/z odnosom od 681, dalje podržao zaključak. Pik 14 je ukazivao na dominantan deprotonirani ion sa m/z odnosom od 637 (C30H38O15), koji je bio identičan elementarnom sastavu cistanozida C. Gubitak ramnozilnog dela formirao je fragment ion sa m/z odnosom od 491, dodatno potkrepio zaključak.

Pik 15 je ukazivao na dominantan deprotonirani ion sa m/z odnosom od 591 (C29H36O13), koji je bio identičan elementarnom sastavu osmantuzida B. Gubitak ramnozilnog dela, formirao je fragment jona sa m/z odnosom od 445, dodatno potkrepio zaključak. Pik 16 je ukazivao na dominantan deprotonirani jon sa m/z odnosom od 623 (C29H36O15), koji je bio identičan elementarnom sastavu akteozida. Gubitak caff ostatka, formirao je fragment ion sa m/z odnosom od 461,dodatno potkrepio zaključak. Pik 18 je ukazivao na dominantan deprotonirani jon sa m/z odnosom od 623 (C29H36O15), koji je bio identičan elementarnom sastavu izoakteozida. Gubitak caff grupe, predvrh15 ukazuje na dominantan deprotonirani ion sa m/z odnosom od 591 (C29H36O13), koji je identičan elementarnom sastavu osmantuzida B. Gubitak ramnozilnog dela, formirao je fragment jona sa m/z odnosom od 445, dalje podržao zaključak. Pik 16 je ukazivao na dominantan deprotonirani jon sa m/z odnosom od 623 (C29H36O15), koji je bio identičan elementarnom sastavu akteozida. Gubitak caff ostatka, koji je formirao fragment jona sa m/z odnosom od 461, dodatno je potkrepio zaključak. Pik 17 je ukazivao na dominantan deprotonirani ion sa m/z odnosom od 623 (C29H36O15), koji je bio identičan elementarnom sastavu cis-akteozida. Gubitak caff dijela, formirao je fragment ioda fragment jona sa m/z odnosom od 461, dodatno je podržao zaključak. Pik 21 ukazuje na dominantan deprotonirani jon sa m/z odnosom od 653 (C30H38O16), koji je identičan elementarnom sastavu kampneozida Ⅰ.

Gubitak caff ostatka formirao je fragment jona sa m/z omjerom od 491, a gubitak drugog ramnozilnog dijela formirao je fragment ion sa m/z omjerom od 345, što dalje podržava zaključak. Pik 22 ukazuje na dominantan deprotonirani ion sa m/z odnosom od 665 (C31H38O16), koji je identičan elementarnom sastavu tubulozida B. Gubitak CH3 CO ostatka formirao je fragment ion sa m/z odnosom od 623, i gubitak drugog caff ostatka formirao je fragment jona sa m/z odnosom od 461, što dalje podržava zaključak. Pik 23 ukazuje na dominantan deprotonirani jon sa m/z odnosom od 639 (C29H36O16), što je identično elementarnom sastavu kampneozida. Gubitak ramnozil ostatka, koji je formirao fragment ion sa m/z odnosom od 493, dalje podržava zaključak. Pik 24 ukazuje na dominantan deprotonirani jon sa m/z odnosom od 665 (C31H38O16), koji je identičan elementarnom sastavu 2'-acetilakteozida. Gubitak Ac grupe, formirao je fragment jona sa m/z odnosom od 623, i gubitak drugog caff ostatka formirao je fragment jona sa m/z odnosom od 461, što dalje podržava zaključak. Pik 25 je ukazivao na dominantan deprotonirani ion sa m/z odnosom od 445 (C20H30O11), koji je bio identičan elementarnom sastavu cistanozida G. Gubitak ramnozilnog dela formirao je fragment ion sa m/z odnosom od 299, dodatno potkrepio zaključak. Strukture jedinjenja su navedene na slici 2.

3.3 PCA

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0.9). Ovi pikovi su bili sljedeći: 9, 12, 14 i 15. Shodno tome, ehinakozid, cistanozid B, osmantuzid B i akteozid, koji odgovaraju ukupno 4 pika, odabrani su kao reprezentativne varijable za estrogensku aktivnost (Slika 3).

.

3.4. Određivanje estrogenske aktivnosti

Izračunat je omjer vlažne težine materice i tjelesne težine svakog miša (Slika 4). Životinje izložene Cistancheu iz devet staništa pokazale su značajne estrogenske aktivnosti povećanjem težine materice u poređenju sa miševima u slijepoj kontrolnoj grupi. Slika 4 dalje prikazuje brzinu proliferacije ćelija MCF7 tretiranih serumom miševa tretiranih Cistancheom. Ćelije tretirane serumima miševa kojima je davan Cistanche iz deset staništa pokazale su značajno veći rast u poređenju sa ćelijama bez tretmana.

3.5 Bivarijatna analiza

U ovoj studiji, uočili smo da se težina materice nezrelih ženki Kunming miševa povećala i da je promovirana proliferacija MCF7 ćelija raka dojke kod ljudi. Ovi nalazi su potvrdili estrogensku aktivnost Cistanchea. Slika 5 pokazuje indekse materice i stope proliferacije MCF7 ćelija ovih sastojaka. Pearsonov koeficijent korelacije korišten je za izračunavanje relativnih površina vrhova, koje su odgovarale estrogenskoj aktivnosti uzoraka. Koeficijenti korelacije veći od 0.3 smatrani su značajnim (p < 0.05),="" dok="" su="" koeficijenti="" korelacije="" veći="" od="" 0.5="" smatrani="" visoko="" značajnim="" (p="">< 0,01).="" na="" osnovu="" rezultata="" pokazalo="" se="" da="" cistanche="" posjeduje="" estrogensku="">

Ukupno devet jedinjenja značajno korelira sa povećanjem težine materice (p < {{0}}}.05),="" dok="" deset="" jedinjenja="" značajno="" korelira="" sa="" ćelijskom="" proliferacijom="" mcf7="" (p="">< 0,05).="" jedinjenja="" koja="" su="" značajno="" korelirala="" sa="" težinom="" materice="" i="" proliferacijom="" ćelija="" su="" 8-epiloganska="" kiselina,="" salidrozid,="" siringalid="" a3'-="" -="" l-ramnopiranozid,="" cistanozid="" a,="" cistanozid="" b,="" cistanozid="" c,="" osmantuzid="" b,="" akteozid,="" izoakteozid,="" tubulozid="" b,="" 2'-acetilakteozid="" i="" dva="" nepoznata="" jedinjenja="" (slika="" 5).="" ovih="" trinaest="" spojeva="" ispoljilo="" je="" estrogensko="">

3.6 Metoda analize sivih korelacija

Slika 6 prikazuje relativnu korelaciju karakterističnih pikova 26 jedinjenja sa indeksima materice, a Slika 7 prikazuje relativnu korelaciju karakterističnih pikova za 26 jedinjenja sa njihovim stopama proliferacije ćelija. Najveću korelaciju sa uterinim indeksima pokazala su ukupno tri jedinjenja, odnosno 8-epiloganska kiselina, cistanozid F i akteozid (Slika 6, u opadajućem redosledu); dok je šest spojeva koji su pokazali najveću korelaciju s proliferacijom MCF7 ćelija bili ehinakozid, cistanozid F, cistanozid B, osmantuzid B, izoakteozid i tubulozid B (Slika 7, u opadajućem redoslijedu). Relativna korelacija ehinakozida, osmantuzida B, akteozida i izoakteozida bila je veća od 0.5.

3.7 Optimizacija LC-MS uslova

Da bi se dobila bolja hromatogramska mapa, upoređivani su metanol i acetonitril. Na kraju, kombinacija vodene mravlje kiseline (0.2 posto, v/v) - acetonitril bila je najbolja mobilna faza za odvajanje. U rasponu od 200-400nm skeniranja pune talasne dužine, 254nm je odabrano kao optimalno. Pored toga, poboljšani su i MS parametri. Odabran je način skeniranja negativnih jona jer je poboljšao vrijednosti odgovora većine sastojaka u Cistancheu.

4 Zaključak

LC-Q-TOF-MS tehnologija je korištena za identifikaciju estrogenskih aktivnih sastojaka Cistanchea. Ova studija je ilustrovala da 8-epiloganska kiselina, salidrozid, siringalidA3'- -l-ramnopiranozid, cistanozid A, ehinakozid, cistanozid F, cistanozid B, cistanozid C, osmantuzid B, akteozid, izoakteozid B, tubulo 2'-acetilakteozid i dva nepoznata jedinjenja bili su glavni aktivni sastojci Cistanchea. Međutim, ovi nalazi zahtijevaju daljnje studije kako bi se istražili in vivo efekti i mehanizam djelovanja sastojaka.

cistancheakteozid ima mnoge funkcije, kao što je jačanje imunološkog sistema

Priznanja:

Ovaj projekat podržali su Nacionalna fondacija za prirodne nauke Kine (br. 81073015), Fondacija za nauku o prirodi provincije Heilongjiang (ZD2017014) i plan obuke mladih inovativnih talenata Koledža u provinciji Heilongjiang (UNPYSCT-2017209) . Autori izjavljuju da ne postoji sukob interesa u vezi sa objavljivanjem ovog rada.

Reference

[1] Wang Z., Xia Q., Liu X., Liu W., Huang W., Mei X., Luo J., Shan M., Lin R., Zou D., Ma Z., Fitohemija, farmakologija , kontrola kvaliteta i buduća istraživanja Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl: Pregled, J. Ethnopharmacol., 2018, 210, 318- 339.

[2] Shu Y., Liu Z., Zhao S., Song Z., He D., Wang M., Zeng H., Lu C., Lu A., Liu Y., Primijenjena integrirana i globalna pseudociljana metabolomska strategija na skrining za markere kontrole kvaliteta Citrus TCMs, Anal. Bioanal. Chem., 2017, 409(20), 4849-4865.

[3] Yang B., Wang Y., Shan L., Zou J., Wu Y., Yang F., Zhang Y., Li Y., Zhang Y., Novela i praktična hromatografija "Fingerprint-ROC-SVM Strategija primijenjena na analizu kvaliteta injekcija tradicionalne kineske medicine: korištenje KuDieZi injekcije kao studije slučaja, Molecules., 2017, 22(7). PII: E1237.

[4] Zhuo L., Peng J., Zhao Y., Li D., Xie X., Tong L., Yu Z., Skrining bioaktivnih markera kontrole kvaliteta QiShenYiQi pilula za kapanje na osnovu odnosa između ultra-visokih performansi tečna hromatografija otisak prsta i vaskularna zaštitna aktivnost, J. Sep. Sci., 2017, 40(20), 4076-4084.

[5] Liu N., Li J., Li BG, Primena multivarijantne statističke analize i razmišljanja u kontroli kvaliteta kineske medicine, Zhongguo. Zhong. Yao. Za. Zhi., 2014, 39 (21), 4268-4271.

[6] Wang DD, Liang J., Yang WZ, Hou JJ, Yang M., Dai J., Wang Y., Jiang BH, Liu X., Wu WY, Guo DA, HPLC/qTOF-MS orijentirani podaci o karakterističnim komponentama set i kemometrijska analiza za holističku kontrolu kvaliteta složenih TCM preparata: Niuhuang Shangqing pilula kao primjer, J. Pharm. Biomed. Anal., 2014, 89, 130-141. [7] Hernaez R., Thrift AP, Visoka negativna prediktivna vrijednost, niska prevalencija i efekat spektra: oprez u tumačenju, Clin. Gastroenterol. Hepatol., 2017, 15(9), 1355-1358.

[8] Liang J., Chen Y., Ren G., Dong W., Shi M., Xiong L., Li J., Dong J., Li F., Yuan J., Skrining hepatotoksičnih komponenti u Euodia rutaecarpa od UHPLC-QTOF/MS na osnovu odnosa spektra i toksičnosti, Molecules., 2017, 22(8). PII: E1264.

[9] Li W., Sun X., Liu B., Zhang L., Fan Z., Ji Y., Skrining i identifikacija hepatotoksične komponente u Evodia rutaecarpa na osnovu odnosa spektra i efekta i UPLC-Q-TOFMS, Biomed . Chromatogr., 2016, 30(12), 1975-1983.

[10] Chopard G., Puyraveau M., Binetruy M., Meyer A., ​​Vandel P., Magnin E., Berger E., Galmiche J., Mauny F., Efekat spektra i pristranost spektra u performansama skrining testa za Amnestičko blago kognitivno oštećenje: koje su kliničke implikacije?, J. Alzheimers. Dis., 2015, 48(2), 385-393.

[11] Xu GL, Xie M., Yang XY, Song Y., Yan C., Yang Y., Zhang X., Liu ZZ, Tian YX, Wang Y., Jiang R., Liu WR, Wang XH, She GM, Odnosi spektra i efekta kao sistematski pristup istraživanju tradicionalne kineske medicine: trenutni status i buduće perspektive, Molecules., 2014, 19(11), 17897-17925.

[12] Zheng Q., Zhao Y., Wang J., Liu T., Zhang B., Gong M., Li J., Liu H., Han B., Zhang Y., Song X., Li Y. , Xiao X., Odnosi spektra i efekta između UPLC otisaka prstiju i bioaktivnosti sirovih sekundarnih korijena Aconitum carmichaelii Debeaux (Fuzi) i njegova tri prerađena proizvoda na rast mitohondrija u kombinaciji s kanonskom korelacijskom analizom, J. Ethnopharmacol., 2014.,1 , 615-623.

[13] Shi Z., Liu Z., Liu C., Wu M., Su H., Ma X., Zang Y., Wang J., Zhao Y., Xiao X., Odnosi spektra i efekta između hemijskih otisaka prstiju i antibakterijski efekti Lonicerae Japonicae Flos i Lonicerae Flos baze na UPLC i mikrokalorimetriji, Front. Pharmacol., 2016, 7, 12.

[14] Usher-Smith JA, Sharp SJ, Griffin SJ, Efekat spektra u testovima za predviđanje rizika, skrining i dijagnozu, BMJ, 2016, 353, i3139.

[15] Chen Y., Yu H., Wu H., Pan Y., Wang K., Liu L., Jin Y., Zhang C., Praćenje novih hemostatskih jedinjenja iz proizvoda zagrijavanja ukupnih flavonoida u Flos Sophorae po spektru -efekt odnosi i kolonska hromatografija, J. Sep. Sci., 2015, 38(10), 1691-1699.

[16] Liu X., Wang XL, Wu L., Li H., Qin KM, Cai H., Pei K., Liu T., Cai BC, Istraživanje odnosa spektra i efekta Da-Huang-Fu- Zi-Tang kod pacova metodom UHPLC-ESI-Q-TOF-MS, J. Ethnopharmacol., 2014, 154(3), 606-612.

[17] Xie RF, Zhou X., Shi ZN, Li YM, Li ZC, Studija o odnosu spektra efekata rizoma Rhei, cortex Magnoliae Officinalis, Fructus Aurantii Immaturus i njihova formula, J. Chromatogr. Sci., 2013, 51(6), 524-532. [18] Li F., Yang X., Yang Y., Guo C., Zhang C., Yang Z., Li P., Antiosteoporotska aktivnost ehinakozida kod štakora sa ovariektomijom, Phytomedicine., 2013, 20(6), { {9}}.

[19] Xiong WT, Gu L., Wang C., Sun HX, Liu X., Antihiperglikemijski i hipolipidemijski efekti Cistanche tubulosa kod dijabetičkih DB/DB miševa tipa 2, J. Ethnopharmacol., 2013, 150(3) , 935- 945.

[20] Morikawa T., Ninomiya K., Imamura M., Akaki J., Fujikura S., Pan Y., Yuan D., Yoshikawa M., Jia X., Li Z., Muraoka O., Acilirani feniletanoidni glikozidi , ehinakozid i akteozid iz Cistanche tubulosa, poboljšavaju toleranciju na glukozu kod miševa, J. Nat. Med., 2014, 68(3), 561-566.

[21] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, Feniletanoidni glikozidi s protuupalnim djelovanjem iz stabljika Cistanche deserticola uzgajanih u pustinji Tarim, Fitoterapia., 2013, 89, {{4 }}.

[22] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Kvantitativna analiza Cistanches Herba koristeći tečnu hromatografiju visokih performansi u kombinaciji sa detekcijom diodnog niza i visoko- rezoluciona masena spektrometrija u kombinaciji sa kemometrijskim metodama, J. Sep. Sci., 2013, 36(12), 1945-1952.

[23] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Strukturna karakterizacija i identifikacija feniletanoidnih glikozida iz Cistanches deserticola YC Ma od UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochem. Anal., 2012, 23(6), 668-676.

[24] Xiang Y., Jing Z., Haixia W., Ruitao Y., Huaixiu W., Zenggen L., Lijuan M., Yiping W., Yanduo T., Antiproliferativna aktivnost fenilpropanoida izolovanih iz Lagotis brevituba Maxim, Phytother . Res., 2017, 31(10), 1509-1520.

[25] Yan Y., Song Q., Chen X., Li J., Li P., Wang Y., Liu T., Song Y., Tu P., Simultano određivanje komponenti sa širokim rasponom polariteta i sadržaja u Cistanche tubulosa koristeći serijski spregnutu hromatografiju reverzne faze-hidrofilne interakcije-tandem masenu spektrometriju, J. Chromatogr. A., 2017, 1501, 39-50.

[26] Zou P., Song Y., Lei W., Li J., Tu P., Jiang Y., Primjena metabolomike zasnovane na 1H NMR za razlikovanje različitih dijelova i razvoj novog procesa obrade za Cistanche deserticola, Acta. Pharm. Sin. B., 2017, 7(6), 647-656.

[27] Pan YN, Studije o sastojcima i bioaktivnosti svježe Cistanche tubulosa, Ph.D. teza, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Kina, 2011.

[28] Cui Q., ​​Pan Y., Xu X., Zhang W., Wu X., Qu S., Liu X., Metabolički profil akteozida koji proizvode crijevne bakterije ljudi ili štakora ili crijevni enzim in vitro korišten UPLC Q-TOF–MS, Fitoterapia., 2016, 109, 67-74.

[29] Cui Q., ​​Pan Y., Bai X., Zhang W., Chen L., Liu X., Sistematska karakterizacija metabolita ehinakozida i akteozida iz Cistanche tubulosa u plazmi, žuči, urinu i fecesu štakora na osnovu UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr., 2016(9), 1406-1415.

[30] Cui Q., ​​Pan Y., Yan X., Qu B., Liu X., Xiao W., Metabolički način za istraživanje povezanih prepreka koje uzrokuju lošu bioraspoloživost pri oralnoj primjeni izoakteozida kod pacova koji koriste tečnu hromatografiju ultravisokih performansi/ quadrupole time-of-flight tandem masena spektrometrija, Rapid. Commun. Mass. Spectrom., 2017(4), 371-380.