1. DIO Regulatorni odnos između varijacije kvaliteta i okoliša Cistanche Deserticola u tri ekotipa na osnovu analize mikrobioma tla

Okoliš utiče na sastav i funkciju mikrobioma tla, što indirektno utiče na kvalitet biljaka. U ovoj studiji korišćeno je sekvenciranje 16S amplikona da bi se otkrile razlike usastav mikrobne zajednice tlaCistanche deserticolau tri ekotipa (zaslanjeno-alkalno zemljište, travnjak i pješčano zemljište). kroz analizu korelacije brojnosti mikrobne zajednice, sadržaja feniletanoidnih glikozida i ekoloških faktora, regulatorni odnos između mikrobne zajednice i varijacije kvalitetaC. deserticolaje izloženo. profil metaboličke funkcije mikrobioma tla je predviđen korištenjem Tax4Fun. Podaci su pokazali da se mikrobne zajednice tla tri ekotipa značajno razlikuju (AMOVA, P < 0.001),="" a="" alfa="" diverzitet="" mikrobne="" zajednice="" pašnjačkog="" tla="" je="" najveći.="" osnovna="" analiza="" mikrobioma="" je="" pokazala="" da="" mikrobne="" zajednice="">C. deserticolauglavnom su imali sušu, otpornost na sol, otpornost na alkalije i otpornost na stres, kao što su Micrococcales i Bacillales. Biomarkeri, naime, oceanospirillales (slano-alkalno zemljište), Sphingomonadales (travnjak) i propionibacteriales (pješčano zemljište), mogu razlikovati tri ekotipske mikrobne zajednice, iskopani su kroz LEfSe i slučajnu šumu. Rezultati korelacione analize su pokazali da je 2′-acetilakteozid u pozitivnoj korelaciji sa oceanospirilama u zaslanjeno-alkalnom tlu. Profili metaboličke funkcije pokazali su visoko obogaćen metabolizam (metabolizam ugljikohidrata i aminokiselina) i puteve obrade informacija o okolišu (membranski transport i transdukcija signala). Sve u svemu, utvrđeno je da su sastav i funkcija mikrobioma tla važni faktori za varijaciju kvalitetaC. deserticolau različitim ekotipovima. Ovaj rad je pružio novi uvid u regulatorni odnos između okoliša, mikrobne zajednice u tlu i varijacija kvaliteta biljaka.

Za više informacija kontaktirajte:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola ima mnogo efekata, kliknite ovde da saznate više

Cistanche deserticolaje nefotosintetička parazitska biljka koja može rasti na suhim staništima, kao što su pješčano zemljište i suvi riječni jarak, kao i pod stresnim uvjetima, kao što je slano-alkalno zemljište1. Ova biljka parazitirala je na korijenu psammophyte Haloxylon ammodendron, koji pokazuje jaku otpornost na oštre uslove okoline2. Biljke se oslanjaju na korisnu interakciju između korijena i mikroorganizama kako bi dobile hranjive tvari, potaknule rast i oduprle se vanjskom stresu3. U međuvremenu, mikrobiom tla upravlja biogeohemijskim kruženjem makronutrijenata, mikronutrijenata i drugih elemenata koji su vitalni za rast biljaka4. Međutim, odnos izmeđuC. deserticolai mikroorganizmi tla rizosfere ostaje nejasan. Posljedično, predstavljanje mikrobioma tla rizosfereC. deserticolaje neophodno.

C. deserticolase često koristi u istočnoj Aziji, centralnoj Aziji, sjevernoj Africi i drugim zemljama kao vrsta hrane i lijeka za zdravstvenu njegu za poboljšanje pamćenja, poboljšanje seksualne funkcije i zaštitu jetre5,6. Glavni aktivni sastojciC. deserticolasu feniletanoidni glikozidi (PhG), iridoidi, lignani i polisaharidi. Među ovim komponentama, PhG su aktivne komponente7. Prethodna studija je pokazala da je sadržaj PhG u različitim ekotipovimaC. deserticolaznatno se razlikuju, među kojima se 2'-acetilakteozid može koristiti kao hemijski marker za razlikovanjeC. deserticolaproizvedeno u Xinjiangu i Unutrašnjoj Mongoliji1. Studije o mikrobnim zajednicama pokazale su da mikrobne zajednice mogu regulirati metabolizam svojih domaćina8,9. Stoga, usporedba odnosa između mikrobne zajednice i metabolita u tlu rizosfereC. deserticolahitno je potrebno u različitim ekotipovima. 16S sekvencioniranje amplikona uzoraka tla iz rizosfere biljaka izvršeno je kako bi se istražila raznolikost mikrobnih zajednica, pružajući novi uvid u odnos između biljaka i mikrobnih zajednica tla10,11. Na primjer, povezanost distribucije i dinamike endofitskih gljivica s C. songaricum i N. tangutorum istražena je u studijama mikrobioma korištenjem sekvenciranja visoke propusnosti11. U ovoj studiji izvršili smo sekvenciranje 16S rRNA amplikona kako bismo dobili mikrobiome tlaC. deserticolau različitim ekotipovima. Također su uspoređene razlike u mikrobnoj zajednici tla u različitim ekotipovima, te su iskopani biomarkeri koji su mogli razlikovati tri ekotipa. Zatim je izračunata korelaciona analiza preko ključne zastupljenosti mikrobne zajednice, sadržaja PhGs i ekoloških faktora, te je istražen regulatorni odnos. Konačno, funkcija mikrobioma tlaC. deserticolau različitim ekotipovima.

Materijali i metode

Opis lokacije proučavanja i uzorkovanje.Prema terenskim istraživanjima,C. deserticolaima tri glavna ekotipa, uključujući slano-alkalno zemljište, travnjake i pješčano zemljište. U aprilu 2017. prikupili smo uzorke tla koji predstavljaju glavne ekotipoveC. deserticolau Kini. Uzorci tla slano-alkalnog zemljišta prikupljeni su iz jezera Ebinur (AB1, AB2, AB3) i plaže Baicheng (BJ1, BJ2, BJ3, BJ4, BJ5) u provinciji Xinjiang. Uzorci zemljišta travnjaka uzeti su iz sela Tula (TL1, TL2, TL3, TL4, TL5) u provinciji Xinjiang. Uzorci tla pješčanog zemljišta prikupljeni su iz Alxe (AL1, AL2, AL3, AL4, AL5, AL6) u provinciji Unutrašnja Mongolija i okruga Minqin (GS1, GS2), okruga Changcheng (GS3, GS4) u provinciji Gansu. Podaci o geografskoj dužini, geografskoj širini i nadmorskoj visini svih tačaka uzorkovanja prikazani su u tabeli 1 i slici 1. Na terenu smo koristili cilindričnu bušilicu od nerđajućeg čelika prečnika 5 cm da sakupimo tlo pored sočne stabljikeC. deserticolai njegovog domaćina, i odmah ga pohraniti u prenosivi frižider na –20 stepeni. Nakon transporta u laboratoriju, uzorci tla su propušteni kroz 2-mm sito da se uklone biljno tkivo, korijenje, kamenje itd. i pohranjeni na -20 stepeni u frižideru prije daljnjih eksperimenata.

Ekstrakcija DNK i sekvenciranje 16S rRNA.DNK tla je ekstrahirana korištenjem PowerSoil DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA) slijedeći priručnik12. Čistoća i kvalitet genomske DNK provjereni su elektroforezom 0.8 posto agaroznih gelova i nanodrop.

V3-V4 hipervarijabilna regija bakterijskog 16S rRNA gena je amplificirana sa prajmerima 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) i 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)13. Za svaki uzorak tla, sekvenca bar koda 10- cifara je dodana na 5′ kraj prednjeg i obrnutog prajmera (Allwegene Company, Peking)12. PCR je izveden na Mastercycler Gradijentu (Eppendorf, Njemačka) koristeći 25 ul reakcionih volumena koji sadrže 12,5 ul KAPA 2G Robust Hot Start Ready Mix, 1 µl prednjeg prajmera (5 µM), 1 µl reverznog prajmera (5 µM), 5 µl DNK (ukupna količina šablona je 30 ng) i 5,5 µl H2O. Parametri ciklusa su sljedeći: 95 stepeni u trajanju od 5 minuta, nakon čega slijedi 28 ciklusa od 95 stupnjeva u trajanju od 45 s, 55 stupnjeva u trajanju od 50 s i 72 stepena u trajanju od 45 s, sa završnim produženjem na 72 stepena u trajanju od 10 minuta. Tri PCR proizvoda po uzorku su objedinjena da bi se ublažile PCR pristranosti na nivou reakcije. PCR proizvodi su pročišćeni pomoću QIAquick kompleta za ekstrakciju gela (QIAGEN, Njemačka), a zatim su kvantitativni pomoću PCR14 u realnom vremenu.

Dubinsko sekvenciranje je izvedeno na MISeq platformi u kompaniji Allwegene (Peking). Nakon pokretanja, izvršena je analiza slike, pozivanje baze i procjena greške pomoću Illumina Analysis Pipeline verzije 2.614.

Cistanchetubulosa može protiv starenja

Analiza podataka.Sirovi podaci su prvo pregledani, a sekvence su uklonjene na osnovu sljedećih razmatranja: sekvence kraće od 200 bp sa niskim ocjenom kvaliteta (manje ili jednako 20) i sadržavale su dvosmislene baze ili se ne podudaraju sekvence prajmera i oznake bar koda15. Kvalificirana očitanja su razdvojena korištenjem sekvenci bar kodova specifičnih za uzorak i obrezana pomoću Illumina Analysis Pipeline verzije 2.6. Zatim su skupovi podataka analizirani pomoću QIIME. Sekvence su grupisane u operativne taksonomske jedinice (OTU) na nivou sličnosti od 97 procenata 16 da bi se generisale krive razrjeđivanja i izračunali indeksi bogatstva i raznolikosti. Alat Ribosomal Database Project Classifer je korišćen za klasifikaciju svih sekvenci u različite taksonomske grupe15. Analiza grupisanja obavljena je na osnovu OTU informacija iz svakog uzorka koristeći R da bi se ispitala sličnost između različitih uzoraka17. Matrica UniFracdistances između mikrobnih zajednica iz svakog uzorka izračunata je korištenjem Tayc koeficijenta i predstavljena kao neponderisana metoda par-grupe sa stablom grupiranja aritmetičke srednje vrijednosti, koje opisuje različitost (1-sličnost) među više uzoraka18. Ovom analizom je takođe generisano stablo u Newick formatu. Alfa raznovrsnost je primijenjena u analizi složenosti raznolikosti vrsta za uzorak koristeći četiri indeksa, uključujući Chao1, promatrane vrste, filogenetsku raznolikost (PD) cijelo drvo i Shanonov indeks diverziteta. Ovi indeksi su izračunati pomoću softvera QIIME (Boulder, CO, USA) u Pythonu (v.1.8.0) (La Jalla, CA, USA)19. Beta analiza diverziteta korištena je za procjenu razlika uzoraka u smislu složenosti vrsta. Beta raznovrsnost je izračunata korišćenjem analize glavnih koordinata (PCoA) i klaster analize u QIIME20. Analiza molekularne varijanse (AMOVA) izvršena je korištenjem mothura. EdgeR je korišten za izračunavanje OTU razlike između grupa. Heatmap.2 je korišten za crtanje mape topline, dok je Ggplot korišten za crtanje karte Manhattana.

Određivanje biomarkera i jezgra mikrobioma.Linearna diskriminantna analiza (LDA) i metode slučajne šume (RF) na web stranici Microbiome Analyst21 korištene su za određivanje mikrobioma biomarkera.

Web stranica prvo izvodi neparametarski faktorski Kruskal-Wallisov sum-rang test kako bi identificirao karakteristike sa značajnom diferencijalnom zastupljenošću s obzirom na eksperimentalni faktor ili klasu od interesa, a zatim slijedi LDA da izračuna veličinu efekta svake osobine s razlikom obilnosti21. Karakteristike se smatraju značajnim na osnovu njihove prilagođene p-vrijednosti. Zadana vrijednost adj.p-vrijednosti od=0.05. RF analiza se izvodi pomoću paketa randomForest5. RF je algoritam za učenje pod nadzorom koji je pogodan za analizu podataka visoke dimenzije. Ova metoda koristi ansambl klasifikacionih stabala, od kojih se svako uzgaja nasumičnim odabirom karakteristika iz uzorka za pokretanje na svakoj grani22. Analiza jezgre mikrobioma je preuzeta iz osnovne funkcije u R paketu mikrobiom od strane Microbiome Analyst-a

korelacione analize ključnih mikrobnih zajednica, sadržaja PhGs i ekoloških faktora.HPLC-om je određen sadržaj sedam feniletanoidnih glikozida (PhG) tri ekotipa C. deserticola, odnosno ehinakozida, cistanozida A, akteozida, izoakteozida, 2′-acetilakteozida, tubulozida A i cistanozida F. Kromatografski uslovi uključuju Waters C18 kolonu (150 mm × 3,9 mm, 4,6 μm), a mobilna faza sadrži acetonitril i 0,2 posto mravlje kiseline. Postavke kromatografije bile su sljedeće: 0–10 min, 10 posto →15 posto A; 10–30 min, 15 posto →40 posto A. Brzina protoka je bila 1 mL/min. Talasna dužina apsorpcije, zapremina ubrizgavanja i temperatura kolone bili su 330 nm, 10 μL i 27 stepeni, respektivno. Studija metodologije odnosi se na preliminarni eksperimentalni rad referentne grupe1.

Ovo istraživanje prikupilo je 16 meteoroloških stanica u blizini tri ekološka tipaC. deserticolaXinjiang Bole 51238, Tacheng 51133, Tori 51241, Karamay 51243, Buxail 51156, Yumin 51137, Emin

51145, Gansu Minqin 52681, Yongchang 52674, Wuwei 52679, Gulang 52784, Unutrašnja Mongolija, Suikou 53419, Hangjinhouqi 53420 i Wuhai 53512.

Redundancy analysis of diferential metabolites and bioclimatic factors was performed by using Canoco 5 software23. Pearson correlation coefcient was calculated for biomarker microbiome abundance, compound con- tent and ecological factor data integration. In this study, the log2 data conversion was uniformly performed before the analysis. SPSS was used to calculate the Pearson correlation coefcient of the six biomarkers, six core micro- biomes, seven main active components of C. deserticola and the ecological factors in the three habitats, and the screening standard was as follows: pearson correlation coefcient (r) >{{0}}.5 i p vrijednost < 0.05.="" odnosi="" između="" gore="" navedenih="" faktora="" vizualizirani="" su="" korištenjem="" cytoscape24="" (the="" cytoscape="" consortium,="" san="" diego,="" ca,="" usa,="" verzija="" 3.7.0)="" i="" pheatmap-a="" (r="">

Predviđanje mikrobnih funkcionalnih profila mikrobioma.Tax4Fun25 (R paket, http:// tax4fun.gobics.de/) je korišten za predviđanje mikrobnih funkcionalnih profila mikrobioma u uzorcima tla. OTU Biom tabela mikrobioma tla korištena je kao ulazna datoteka za imputaciju metagenoma uzoraka tla C. deserticola. Zatim su predviđene obilje genskih klasa analizirane na nivou KEGG Orthology (KO) grupe 3. Rezultati Tax4Fun-a analizirani su u doBy (R paket)26.

Rezultati

Sastav mikrobne zajednice. The 16S rRNA sequencing resulted in 834,323 raw reads, amongst which 522,929 passed the quality and length fltering. The data set comprised 20,511–48,337 (mean: 33,994) sequences per sample. The high-quality reads were clustered using >97 posto sekvence identiteta u 3541 mikrobnih OTU (Tabela 1).

Mikrobna zajednica je generalno klasifikovana u 19 tipova, 46 klasa i 87 redova (sl. 2a,b i S1-S3). Na nivou tipa, Actinobacteria (35 posto), Proteobacteria (31 posto) i Firmicutes (15 posto) su dominirale u zaslanjeno-alkalnom zemljištu. Na travnjacima su dominirale Actinobacteria (37 posto), Proteobacteria (29 posto) i Bacteroidetes (9 posto). U pjeskovitom zemljištu dominirale su Actinobacteria (42 posto), Proteobacteria (33 posto) i Firmicutes (6 posto). Na nivou klase, aktinobakterije (25 posto), gamaproteobakterije (21 posto) i bacili (15 posto) su dominirale u slano-alkalnom zemljištu, dok su aktinobakterije (22 posto), alfaproteobakterije (16 posto) i bacili (8 posto) bile dominantne u travnjak. U pjeskovitom zemljištu dominirale su aktinobakterije (23 posto), alfaproteobakterije (20 posto) i gamaproteobakterije (9 posto). Na nivou reda (sl. 2c–e), Micrococcales (22 posto), Oceanospirillales (15 posto) i Bacillales (15 posto) su dominirali u slano-alkalnom zemljištu. Micrococcales (11 posto) i Bacillales (8 posto) dominiraju na travnjacima. Tako su najdominantniji bakterijski redovi bili Micrococcales (10 posto) i Acidimicrobiales (7 posto).

Raznolikost bakterija u tlu u tri ekotipa C. deserticola.Mjere raznolikosti unutar uzorka (-diversity) otkrile su gradijent raznolikosti između tri staništa (slika 2f i tabela S1). Alfa raznovrsnost bakterijske mikrobne zajednice u tlu svakog uzorka procijenjena je korištenjem bogatstva zajednice (Chao 1, koji je izražen kao projektovani ukupan broj OTU u svakom uzorku), promatranih vrsta, PD cijelog stabla i Shannonovog indeksa raznolikosti. Posmatrane vrste, Chao 1 i PD indeks cijelog stabla sugeriraju da su zajednice travnjaka imale najveću -diverzitet, dok je -diverzitet slano-alkalnih i pješčanih tla sličan. Rezultati krivulja refakcije (slika S1) slični su gornjim rezultatima.

Acteosideincistancheimaju dobre efekte nabubreg

Rezultati AMOVA (Tabela S2) su pokazali da je p < 0.001,="" što="" ukazuje="" na="" značajnu="" razliku="" između="" tri="" staništa.="" rezultati="" grupiranja="" stabala="" raznolikosti="" na="" udaljenosti="" od="" bray="" (sl.="" s2)="" za="" tri="" uzorka="" tla="" staništa="" pokazali="" su="" da="" su="" uzorci="" slano-alkalnog="" tla="" bili="" blisko="" grupirani,="" a="" udaljenost="" između="" uzoraka="" travnjaka="" i="" pješčanog="" tla="" bila="" je="" bliska.="" rezultati="" neograničenih="" pcoas="" neponderisanih="" 2d="" dijagrama="" unifrac="" udaljenosti="" (slika="" 2g)="" pokazali="" su="" da="" su="" različiti="" uzorci="" tla="" bakterijske="" mikrobne="" zajednice="" iz="" različitih="" staništa="" bili="" dobro="">

poređenje bakterijskih zajednica tla tri ekotipa c. deserticola.Različite toplotne karte obilja OTU i mapa vulkana (sl. 3b,e,d,h i tabela S3) pokazuju da je u poređenju sa uzorcima pješčanog zemljišta, 24 i 17 OTU obogaćeno i osiromašeno slano-alkalnim zemljištem na nivou reda. Osim toga, u poređenju sa uzorcima pješčanog zemljišta, 8 i 11 OTU je obogaćeno i osiromašeno u travnjaku. Vennov dijagram (slika 3c,f) ilustruje da je 216 OTU-a iscrpljeno u pješčanom zemljištu, 8 je iscrpljeno u slano-alkalnom

zemljište i 1 OTU preklapaju se između slano-alkalnih i pješčanih zemljišta. Nadalje, 3 OTU-a su obogaćena travnjakom, dok je 161 obogaćena pješčanim zemljištem, uključujući 6 OTU-a koji su se preklapali između travnjaka i pješčanog zemljišta. Ploče na Manhattanu (Sl. 3a) su pokazale da su Xanthomonadales više obogaćene i osiromašene u zaslanjenom zemljištu od onih u pješčanom zemljištu, dok su bakterija Xanthomonadaceae WWH73, WD2101 grupa tla, Vibrionales i Verrucomicrobiales bile značajno iscrpljene na nivou reda. Upoređujući travnjak sa pješčanim zemljištem, Xanthomonadales, WD2101 grupa tla, Vibrionales i Verrucomicrobiales su značajno osiromašeni.

Cistanchedeserticola ima mnogo efekata na lečenjedijabetesa

Određivanje biomarkera i jezgra mikrobioma u tri ekotipa C. deserticola.Metode LEfSe i RF (sl. 4a,b,d) korištene su za identifikaciju karakteristika sa značajnom različitom zastupljenošću u uzorcima tla, izračunavanje efektne veličine svake različito bogate karakteristike i određivanje biomarkera bakterijskog mikrobioma u tri staništa na nivou reda. . Rezultati predstavljeni u Tabeli S4 otkrili su da je LDA skor Oceanospirillales, Bacillales i Flavobacteriales bio najviši među onima u slano-alkalnom zemljištu, dok je Sphingomonadales, Gaiellales, Rubrobacterales, Burkholderiales i Sphingobacteriales bio najviši među onima na travnjacima. LDA skor za Propionibacteriales, Rhodospirillales, Solirubrobacterales, Rhizobiales, Xanthomonadales i Pseudonocardiales bio je dominantan u pješčanom zemljištu. Uz isključenje nedefinisanih i dupliciranih redova, ovi OTU-ovi su klasifikovani u šest redova, a njihova zastupljenost je ucrtana u toplotnu mapu (slika 4c).

Metoda perzistentnosti je usvojena iz osnovne funkcije u mikrobiomu R paketa kako bi se identificirao ključni mikrobiom u tri ekotipa C. deserticola. Ovaj osnovni bakterijski mikrobiom sadržavao je šest redova, uključujući Micrococcales, Bacillales, Rhizobiales, Acidimicrobiales, Streptomycetales i Sphingomonadales. Uz isključenje nedefinisanih i dupliciranih naloga, ovi OTU-ovi su klasifikovani u šest redova, a njihova zastupljenost je ucrtana u toplotnu mapu (slika 2h).

Metoda perzistentnosti je usvojena iz osnovne funkcije u mikrobiomu R paketa kako bi se identificirao ključni mikrobiom u tri ekotipa C. deserticola. Ovaj osnovni bakterijski mikrobiom sadržavao je šest redova, uključujući Micrococcales, Bacillales, Rhizobiales, Acidimicrobiales, Streptomycetales i Sphingomonadales. Uz isključenje nedefinisanih i dupliciranih naloga, ovi OTU-ovi su klasifikovani u šest redova, a njihova zastupljenost je ucrtana u toplotnu mapu (slika 2h).