Kontakt:jerry.he@wecistanche.com

Lin Bai|Gui-ying Shi|Ya-jun Yang|Wei Chen|Lian‐feng Zhang|Chuan Qin

Cistanche ima efekat protiv starenja

Abstract

Pozadina: Vremenski vezan pad regenerativnog kapaciteta i homeostaze organa je glavna karakteristikastarenje. Rehmannia glutinosa i Astragalus membranaceus koriste se kao tradicionalni kineski biljni lijekovi za jačanje imuniteta i produženi život. Međutim, mehanizam kojim ovaj biljni lijek usporava starenje je nepoznat. U ovoj studiji smo istraživali mehanizam biljnog porijeklaefekat protiv starenja.

Metode: Miševi su 10 mjeseci hranjeni hranom s dodacima R. glutinosa ili A. membranaceus; kontrolna grupa je hranjena standardnom ishranom. Fenotipovi su procijenjeni korištenjem sistema ocjena i analize preživljavanja. Procenti fenotipova starenja hematopoetskih matičnih ćelija (HSC) određeni su analizom sortiranja ćelija aktiviranom fluorescencijom. Funkcija i mehanizam HSC-a analizirani su klonogenim testom i lančanom reakcijom polimeraze u realnom vremenu.

Rezultati: Theefekat protiv starenjaR. glutinosa je zbog poboljšane funkcije HSC. Miševi hranjeni R. glutinosa pokazali su karakteristike usporenogstarenjeproces, uključujući smanjeno starenje i povećanu stopu preživljavanja. Analiza protočne citometrije pokazala je smanjen broj Lin–Sca1 plus c-kit– (LSK) ćelija, dugotrajnih HSC (LT‐HSC) i kratkoročnih HSC (ST‐HSC) u grupi R. glutinosa. In vitro, klonogeni testovi su pokazali povećanu sposobnost samoobnavljanja LT-HSC iz grupe R. glutinosa, kao i održavanje LSK mirovanja kroz pojačanu ekspresiju p18. Grupa R. glutinosa je takođe pokazala smanjene nivoe reaktivnih vrsta kiseonika i procenat ‐gal plus ćelija kroz smanjenje proteina p53 i p16 povezanog sa ćelijskim starenjem.

Zaključak: Rehmannia glutinosa djelujeprotiv starenjaefekte održavanjem mirovanja i smanjenjem starenja HSC-a.

KLJUČNE REČI: anti-aging, hematopoetske matične ćelije, mirovanje, Rehmannia glutinosa

1|UVOD

Starenje je definirano kao vremenski ovisan funkcionalni pad koji pogađa većinu živih organizama.1 Dugovječnost organizama uglavnom održavaju matične ćelije.2 Matične ćelije specifične za tkivo imaju sposobnost samoobnavljanja i diferenciranja u različite efektorske ćelije. 3 Međutim, tokom procesa starenja, ovaj kapacitet samoobnavljanja opada, što na kraju dovodi do akumulacije nepopravljenih, oštećenih tkiva u ostarjelim organizmima.4 Gubitak sposobnosti održavanja ravnoteže između mirovanja i diferencijacije u matičnoj/progenitorskoj ćeliji. Kompartment može dovesti do smrti ili bolesti povezanih sa starenjem.2 Nadalje, nedavne studije sugeriraju da podmlađivanje matičnih ćelija može preokrenuti fenotip starenja.5,6 U hematopoetskom sistemu, hematopoetske matične ćelije (HSC) su odgovorne za proizvodnju krvnih stanica. Kod starijih miševa, hematopoetski sistem pokazuje oštećenje T- i B-limfoidnih ćelija, a broj mijeloidnih ćelija je povećan. Ostarjeli HSC su pokazali smanjenu aktivnost samoobnavljanja i smanjenu rekonstruktivnu sposobnost hematopoeze. Značajno je da se promjene vezane za starenje u HSC kompartmentu manifestiraju kod starenja domaćina kao anemija, povećana sklonost mijeloproliferativnim neoplazmama, smanjena imunološka funkcija i povećana incidencija raka.{11}} Međutim, mehanizam starenja HSC i efekti biljnih lijekova na starenje HSC nisu poznati.10

Ljudi su od davnina brinuli o odlaganju procesa starenja i očuvanju mladostiprotiv starenjatrenutno je fokus istraživanja. Tradicionalnoj kineskoj medicini sve se više pažnje posvećuje liječenju raznih bolesti povezanih sa starenjem. Poznato je da mnoge biljke koje se koriste u tradicionalnoj kineskoj medicini pružaju pozitivne efekte protiv starenja kroz različite mehanizme. Rehmannia glutinosa i Astragalus membranaceus naširoko se koriste na ovaj način hiljadama godina.

Rehmannia glutinosa se koristi za liječenje raznih dijabetičkih poremećaja, pojačava metabolizam kostiju kod osteoporoze i inhibira upalu i fibrozu jetre. Osim toga, ova biljka ima i druge efekte, uključujućiprotiv umora, antidepresivna i neuroprotektivna svojstva. U posljednjih nekoliko godina, farmakološke studije o R. glutinosa i njenim aktivnim komponentama uglavnom su se fokusirale na njeno široko djelovanje na krv, endokrini, kardiovaskularni i nervni sistem.{1}} Tako se pokazalo da R. glutinosa posjeduje jak imunološki ‐aktivnost unapređenja, što je dalo teorijsku osnovu za dalja proučavanja.

Astragalus membranaceus ima tonik, hepatoprotektivna, diuretička i iskašljavajuća svojstva15 i pokazalo se da ispoljava imunomodulatorno,16protuupalno,iantioksidansefekti.17 Razjašnjavanje molekularnih mehanizama koji leže u osnovi efekata tradicionalnih kineskih lijekova u kliničkoj praksi je ključni korak ka njihovoj primjeni širom svijeta, a ova tema je trenutno predmet intenzivnog istraživačkog interesa.

Stoga smo u ovoj studiji 10 mjeseci hranili miševe ishranom s dodacima R. glutinosa i A. membranaceus kako bismo istražili mehanizam koji leži u osnovi sposobnosti R. glutinosa da produži životni vijek.

2|MATERIJALI I METODE

2.1|Grupiranje životinja i tretman

C57BL/6J ženke miševa su održavane u okruženju bez patogena i hranjene standardnom prehranom. Upotreba životinja u ovoj studiji odobrena je od strane odbora za brigu o životinjama i korištenje Instituta za laboratorijske nauke o životinjama Medicinskog fakulteta Peking Union. Miševi (stari 10 mjeseci) su nasumično podijeljeni u tri grupe (n=20/grupi). Kontrolna grupa je hranjena standardnom ishranom (Beijing HFK Biosicence, Peking, Kina). Dijeta druge dvije grupe je dopunjena mljevenim R. glutinosa i A. membranaceus (Beijing Tong Ren Tang Chinese Medicine, Peking, Kina), respektivno, u dozi od 200 mg/d tokom 10 mjeseci. Ova doza je odabrana metodom normalizacije površine tijela kako bi se potvrdile doze lijeka od studija na ljudima do studija na miševima. Telesna težina je određivana svaka 2 meseca, a preživljavanje se beležilo svakodnevno.

2.2|Procjena stepena starenja

Usvojen je sistem bodovanja za procjenu stepena starenja prema kriterijima definiranim od strane Takeda et al.18 Svaka kategorija navedena u protokolu odabrana je od kliničkih znakova povezanih s procesom starenja. Svaki miš je ocijenjen u dobi od 18 mjeseci i rezultat u svakoj kategoriji je zbrojen kako bi se odredio ukupni rezultat ocjenjivanja.

2.3|Protočna citometrija

Ćelije su sakupljene iz timusa, slezene, periferne krvi (PB) i koštane srži (BM). Slezena i timus su odmah izrezani, isprani fiziološkim rastvorom i izmereni. Slezine i timusi su blago homogenizovani u staklenom homogenizatoru, a ćelije su suspendovane u sterilnom fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS). Ćelije iz PB su primijenjene na lizu crvenih krvnih zrnaca (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Ćelije iz BM su izolovane ispiranjem i tibije i femura sa sterilnim PBS. Sve ćelije su izolovane filtracijom preko sterilne najlonske mreže i obojene 30 minuta na 4 stepena sa sledećim antitelima konjugovanim fluoroforom: fikoeritrin (PE)-konjugovani anti-CD3 (G4.18), alofikocijanin (APC)-konjugovani anti-CD3 ‐ CD4 (OX35) i PE‐Cy7‐konjugirani anti‐CD8a (OX8). Za BM ćelije, markeri loze su obojeni korišćenjem biotinom konjugovanog antimišjeg CD4 (RM4‐5), CD5 (53‐7,3), CD8a (53‐6,7), CD11b (M1/70), B220 (RA3‐6B2), TER119 (TER‐ 119) i Gr1 (RB6‐8C5), praćeno bojenjem sa streptavidinom konjugiranim antitelom APC‐eFluor 780-, takođe je dobijen od eBioscience (San Diego, CA, SAD). Za površinsko bojenje korišćena su sledeća antitela: APC imunoglobulin (Ig)M (II/41), fluorescein izotiocijanat (FITC) IgD (11‐26), PE‐Cy7 Sca‐ 1 (D7), PE Flt3 ( A2F10), FITC B220 (RA3‐6B2), FITC CD34 (RAM34), PerCP‐Cy5.5 CD127 (A7R34), PE CD16/CD32 (93) i PerCP‐Cy5.5 CD3e (145‐2C11). Sva antitijela su dobijena od eBiosciences (San Diego, CA, USA). Podaci su prikupljeni od strane FACS-a

Aria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, SAD) i analizirana pomoću softvera FlowJo (Three Star, Ashland, OR, SAD).

2.4|Analiza ćelijskog ciklusa

Za analizu ćelijskog ciklusa, ukupne BM ćelije su obojene na površinske markere matičnih ćelija (Lin–Sca‐1 plus c‐KitHigh; LSTKs), zatim fiksirane i permeabilizovane (00‐5123‐43; Becton Dickinson ) prije bojenja sa FITC Ki‐

67 antitijela i 7-aminoaktinomicina D (7-AAD). Prikupljanje podataka obavljeno je na FACS Aria II (Becton Dickinson). Podaci su analizirani pomoću softvera FlowJo.

2.5|‐gal bojenje povezano sa starenjem

Aktivnost povezana sa starenjem (SA)--gal je također analizirana protočnom citometrijom korištenjem C12FDG kako je opisano od strane proizvođača (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Ukratko, matične ćelije su prvo obojene na markere ćelijske površine, a zatim inkubirane sa 100 nmol L-1 bafilomicina A1 tokom 1 sata na 37 stepeni da bi se indukovala lizozomalna alkalizacija. Nakon ispiranja sa PBS, ćelije su inkubirane sa 2 mmol L-1 C12FDG tokom 1-2 sata na 37 stepeni i zatim analizirane korišćenjem FACS Aria I (Becton Dickinson).

2.6|Određivanje proizvodnje reaktivnih vrsta kiseonika (ROS).

Ćelije su inkubirane sa dihloro-dihidro-fluorescein diacetatom (DCFH-DA; Beyotime, Šangaj, Kina) na 37 stepeni tokom 20 minuta. DCFH‐DA pasivno difundira u ćelije, gdje se deacetilira esterazama da bi se formirao nefluorescentni 2′,7′‐dihlorofluorescein (DCFH). Količina emitovane fluorescencije korelira sa količinom ROS-a u ćeliji. Podaci su dobijeni na FACS Aria I (Becton Dickinson) i analizirani pomoću softvera FlowJo.

2.7|Analiza lančane reakcije polimeraze (PCR) u realnom vremenu

Ukupna RNK je ekstrahirana iz ćelija pomoću TRIzol reagensa (Invitrogen, San Diego, CA, USA) prema uputama proizvođača. Geni od interesa su amplificirani iz ukupnih RNK ​​tretiranih Dnazom I korištenjem M-MLV reverzne transkriptaze (Promega, Madison, WI, SAD)

i poli-dT prajmeri. Prajmeri korišćeni za PCR su bili sledeći: p21 (5′‐TCCAGACATTAGAGCCACA‐3′ i 5′‐CGAAGAGACAACGG-CACACT‐3′, Tm=60 stepen, 30 ciklusa), p53 (5′‐CATGAACTACGTC‐CCGACC- 3′ i 5′‐TCCCGGAACATCTCGAGGC‐3′, Tm=62 stepen , 35 ciklusa), p16 (5′‐CGAACTCTTTCGGTCGTACCC‐3′ i 5′‐ CGAATCTGCACCGTAGTTGAGC,‐3′,T‐3′,T‐3′ ciklusa), p57 (5′‐ AGGAGCAGGACGAGAATCAA‐3′ i 5′‐ TTCTCCTGCGCAGTTCTC TT‐3′, Tm=61 stepen , 30 ciklusa), p19 (5′‐ATGGGTCGCAG‐GTTCTTGGTT′‐ATGGGTCGCAG‐GTTCTTGGTT i 5′‐ATGGGTCGCAG‐GTTCTTGGT′G‐GTTCTTGGTT′CG‐GTTCTTGGT′ ′, Tm=61 stepen, 35 ciklusa), p18 (5′‐GGGACCTAGAGCAACTTACT‐3′ i 5′‐TGACAGCAAAAC- CAGTTCCA‐3′, Tm=61 stepen, 30 ciklusa), gliceraldefat-3‐ dehidrogenaza (5′‐GAGCGAGACCCCACTAACAT‐3′ i 5′‐TTCACACCCATCACAAACAT‐3′, Tm=60 stepen, 25 ciklusa). Real-time (RT)‐ PCR je sproveden korišćenjem SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Shuzo, Kjoto, Japan) na ABI StepOne™ sistemu za detekciju (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija, SAD).

2.8|Klonogeni testovi

Dugotrajni (LT)-HSC su sortirani fluorescentno aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS), a zatim kultivisani u ćelijskim pločama sa 96 jažica koristeći medijum na bazi metilceluloze (HSC007; R&D Systems, Minneapolis, MN, SAD) . Za svaki uzorak pripremljeno je deset repliciranih jažica. Koristili smo ploču za kulturu ćelija sa 96 jažica, tri ćelije po jažici. Dvije sedmice nakon postavljanja, broj i veličina kolonija su izbrojani pod mikroskopom.

2.9|Statistička analiza

Podaci su analizirani jednosmjernom ANOVA-om korištenjem softvera Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, SAD) i GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornija, SAD). Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD. Smatra se da P < 0.05="" ukazuje="" na="" statističku="">

3|REZULTATI

3.1|R. glutinosa i A. membranaceus su ispoljile efekte protiv starenja

Za potvrduefekti protiv starenjaR. glutinosa i A. membranaceus, istraživali smo efekte primjene kao dodatka ishrani (200 mg/d). Nakon toga, bilježili smo tjelesnu težinu, stepen starenja i stopu preživljavanja miševa. Tjelesna težina miševa koji su se hranili R. glutinosa ili A. membranaceus bila je normalna u poređenju sa onima u kontrolnoj grupi, iako je došlo do smanjenja tjelesne težine R. glutinosa i A. membranaceus grupe nakon 20 mjeseci (Slika 1A). Analiza stepena starenja otkrila je postojano i nepovratno povećanje skora za ocjenjivanje s napredovanjem u grupama R. glutinosa i A. membranaceus u poređenju sa onim u kontrolnoj grupi, iako je povećanje bilo izraženije kod A. membranaceus grupa (slika 1B). Visoka ocjena je rezultat ranijeg početka gubitka pasivnosti i reaktivnosti, gubitka sjaja kože i povećane grubosti, gubitka kose, perioftalmoloških lezija, povećane lordokifoze kralježnice i izraženijeg povećanja njihove težine.18 Miševi u A membranaceus grupa miševa pokazala je izraženije karakteristike fenotipa starenja, uključujući gubitak sjaja kože i gubitak kose. Krivulje preživljavanja su pokazale da je životni vek miševa u grupama R. glutinosa i A. membranaceus bio nešto duži od onog u kontrolnoj grupi (Slika 1C). Ovi podaci su potvrdiliefekti protiv starenjai R. glutinosa i A. membranaceus, iako je utvrđeno da je R. glutinosa efikasnija u usporavanju procesa starenja.

SLIKA 1 Rehmannia glutinosa i Astragalus membranaceus su imaliefekti protiv starenja. Miševi su hranjeni hranom sa dodatkom mljevene R. glutinosa ili A. membranaceus (200 mg/d); kontrolna grupa je hranjena standardnom ishranom. A, Promjene tjelesne težine miševa mjerene svaka 2 mjeseca. B, Promjene u ocjenjivanju starenja miševa s godinama. C, Krive preživljavanja. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SD; n=20 miševa/grupa. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SD; n=5 miševi/grupa.*P < 0,05,="" ***p=""><>

3.2|R. glutinosa je smanjila broj hematopoetskih matičnih ćelija

Smatra se da je iscrpljenost matičnih ćelija integrativna posledica više vrsta oštećenja povezanih sa starenjem i jedan od glavnih uzroka starenja tkiva i organizma.1 Nedavne studije sugerišu da podmlađivanje matičnih ćelija može preokrenuti fenotip starenja na nivou organizma.5 Mi pretpostavio da jeefekti protiv starenjaR. glutinosa posredovane su poboljšanjem funkcije matičnih ćelija. Zbog toga smo izvršili protočnu citometrijsku analizu broja hematopoetskih matičnih/progenitornih ćelija izolovanih od miševa (starih 20 meseci) hranjenih hranom sa R. glutinosa ili A. membranaceus (200 mg/d) tokom 10 meseci (Slika 2A) . Procenat LSK je smanjen u grupama R. glutinosa i A. membranaceus (Slika 2B). Broj LT- i kratkoročnih (ST)- HSC smanjen je za približno dva puta u grupi R. glutinosa u poređenju sa brojem u kontrolnoj grupi (Slika 2C-D). Veći broj običnih limfoidnih progenitora (CLP) otkriven je u grupi koja je primala R. glutinosa u poređenju sa brojem u kontrolnoj grupi (Slika 2I). Nije bilo razlika u broju multipotentnih progenitora (MPP), zajedničkih mijeloidnih progenitora (CMP), granulocitno-makrofagnih progenitora (GMP) i megakariocitno-eritroidnih progenitora (MEP) u grupi R. glutinosa u poređenju sa brojem u grupi kontrolnu grupu. U grupi A. membranaceus nije bilo značajne razlike u broju LT- i ST- HSC u poređenju sa brojem u kontrolnoj grupi (Slika 2C- D). Nadalje, nije bilo razlike u broju MPP, CMP, MEP i CLP ćelija u poređenju sa brojem u kontrolnoj grupi (Slike 2E, 2F, 2H i 2I); međutim, broj GMP je smanjen u grupi A. membranaceus. Prema tome, miševi hranjeni hranom sa dodatkom R. glutinosa pokazali su smanjen broj hematopoetskih matičnih i progenitornih ćelija.

3.3|R. glutinosa je poboljšala funkciju i održala mirovanje HSC-a

Da bi se procijenila funkcija HSC-a, klonogeni potencijal LT-HSC-a je ispitan in vitro. Sortirali smo LT-HSC ćelije u medij na bazi metilceluloze koristeći FACS i izbrojali broj i veličinu kolonija nakon 14 dana. U poređenju sa brojem i veličinom kolonija koje su proizvele ćelije miševa u kontrolnoj grupi, ćelije miševa iz grupe R. glutinosa pokazale su povećanje broja kolonija, posebno za malu veličinu (P=0.0241 ) i klon velike veličine (P=0.0418), dok nije bilo razlike u broju od miševa iz grupe A. membranaceus (Slika 3). Povećana veličina i broj kolonija u grupi R. glutinosa sugerira da ova biljka povećava potencijal samoobnavljanja LT-HSC.

Većina HSC-a kod odraslih miševa ostaje mirna;19 stoga je održavanje stanične mirovanja suštinski mehanizam za samoobnavljanje matičnih ćelija.20,21 Uočeno smanjenje HSC-a ukazuje na smanjenu ćelijsku proliferaciju u R. glutinosa i A. membranaceus grupe; stoga smo ispitali status ćelijskog ciklusa HSC kroz analizu proliferativnog ćelijskog markera Ki-67 u kombinaciji sa određivanjem sadržaja DNK 7-AAD u LSK populaciji. Uočili smo povećan broj LSK ćelija u G0 fazi u grupama R. glutinosa i A. membranaceus u poređenju sa onim u kontrolnoj grupi (Slika 4A). Ovi rezultati su pokazali da R. glutinosa i A. membranaceus održavaju mirovanje HSC.

PCR analiza regulatora ćelijskog ciklusa u LSK ćelijama u realnom vremenu otkrila je da su p18, p19 i p57 igrali kritičnu ulogu u održavanju mirovanja HSC.22-24 Nije bilo očiglednih promjena uočenih za p57 i p19 (Slika 4C‐ D), a p18 je povećan u grupi koja je primala R. glutinosa u poređenju sa onom u kontrolnoj grupi, i blago povećana u grupi sa A. membranaceus (Slika 4B).

SLIKA 2 Rehmannia glutinosa i Astragalus membranaceus su uticali na broj hematopoetskih matičnih/progenitornih ćelija. Miševi (stari

20 mjeseca) hranjeni su dijetama sa dodatkom R. glutinosa ili A. membranaceus (200 mg/d) tokom 10 mjeseci (n=5/grupi); kontrolna grupa je hranjena standardnom ishranom. Svježe izolirane ćelije koštane srži (BM) obojene su navedenim antitijelima i analizirane protočnom citometrijom. A, Reprezentativni profili bojenja BM hematopoetskih matičnih ćelija i populacija progenitornih ćelija. B, Procenat Lin–Sca1 plus c-kit– ćelija (LSK) u BM ćelijama. C‐I, Broj ćelija (C) dugoročnih (LT; Lin–, Sca‐ 1 plus, c‐Kit, CD34 plus – , Flt3–); D, kratkoročni (ST; Lin–, Sca‐ 1 plus, c‐ Kit, CD34 plus plus, Flt3–); E, multipotentni progenitor (MPP; Lin–, Sca‐ 1 plus, c‐ Kit plus, Flt3 plus); F, zajednički mijeloidni progenitor (CMP; Lin– ​​, Sca‐ 1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/ CD32–); G, progenitor granulocita-makrofaga (GMP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐Kit–, CD34 plus, CD16/CD32 plus); H, megakariocitni-eritroidni progenitor (MEP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit– , CD34–, CD16/CD32–); i I, zajednički limfoidni progenitor (CLP; Lin–, Sca‐1low, c‐Kitlow, CD127 plus). Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SD; n=5 miševa/grupa. *P < 0,05,="" **p=""><>

3.4|R. glutinosa je odgodila starenje HSC

Dugotrajni dodatak ishrani sa R. glutinosa može produžiti životni vek miševa. Ćelijsko starenje se povećava sa godinama; stoga smo istraživali starenje HSC kod starijih miševa protočnom citometrijskom analizom SA‐gal obojenih HSC koristeći fluorescentni ‐gal supstrat (C12FDG).25 Procenat SA‐‐gal‐pozitivnih ćelija je smanjen u R. glutinosa grupa, što ukazuje da R. glutinosa odlaže starenje LSK ćelija (Slika 5A).

Reaktivne vrste kiseonika igraju glavnu ulogu u starenju HSC, a gubitak mirovanja HSC je često u korelaciji sa povećanim ćelijskim ROS.26 Analiza intracelularnog ROS u LSKs pokazala je da su nivoi smanjeni u grupi R. glutinosa u poređenju sa onima u kontrolnoj grupi. grupa (Slika 5B). Ovi podaci su pokazali da R. glutinosa može održati mirovanje HSC i poboljšati funkciju HSC smanjenjem nivoa ROS.

Zatim smo istražili ekspresiju nekoliko gena uključenih u ćelijsko starenje pomoću RT-PCR analize LSK ćelija. U poređenju

SLIKA 3 Funkcija hematopoetskih matičnih ćelija poboljšana suplementacijom Rehmannia glutinosa u ishrani. In vitro klonogeni potencijal dugotrajnih zvijezdastih ćelija jetre miševa (n=3)

kod kontrolne grupe, ekspresija proteina p53 i p16 povezanih sa ćelijskom starenjem je smanjena u grupi koja je primala R. glutinosa (Slika 5D-E). Ali ekspresija p53 i p16 nije značajno smanjena između grupe A. membranaceus i kontrolne grupe (Slika 5D-E). Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da nekoliko ključnih gena vezanih za ćelijski ciklus i ćelijsko starenje reguliše funkciju HSC-a kod miševa koji su hranjeni hranom koja je suplementirana R. glutinosa.

3.5|R. glutinosa pojačava imunitet na B-ćelije

B i T limfociti su važni za imunološki odgovor. T limfociti igraju ključnu ulogu u ćelijskom imunitetu i njegovoj regulaciji, dok B limfociti učestvuju uglavnom u humoralnom imunitetu. Proliferacija limfocita je najneposredniji indeks koji odražava organski imunitet. Da bi se ispitala uloga u imunološkom poboljšanju, ispitivani su efekti R. glutinosa i A. membranaceus na proliferaciju limfocita.

Miševi u grupi R. glutinosa pokazali su smanjen broj HSC i povećan broj CLP. Protočna citometrijska analiza je pokazala povećan broj zrelih B ćelija (B220 plus) u PB, BM i slezeni miševa u grupi R. glutinosa u poređenju sa brojevima otkrivenim u kontrolnoj grupi (Slika 6A); međutim, nije bilo značajnih razlika u broju T ćelija (CD4 plus i CD8 plus), monocita i granulocita (CD11b plus) između dve grupe (Slika 6B‐D). Dakle, ovi rezultati ukazuju na to da R. glutinosa hranom povećava imunitet B-ćelija.

SLIKA 4 Dodaci ishrani Rehmannia glutinosa i Astragalus membranaceus održavali su mirovanje hematopoetskih matičnih ćelija. A, Procenat ćelija u svakoj fazi ćelijskog ciklusa. Protočna citometrijska analiza 7-aminoaktinomicina D (7-AAD) i Ki-67 bojenja Lin-Sca1 plus c-kit- ćelija (LSK). B, Analiza lančane reakcije polimeraze u realnom vremenu ekspresije gena sortiranih LSK ćelija; GAPDH je korišten za normalizaciju. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SD za tri eksperimenta. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>

SLIKA 5 Dijetalna suplementacija Rehmannia glutinosa smanjila je starenje zvjezdanih stanica jetre (HSC). Miševi (u dobi od 20 mjeseca) su hranjeni hranom s dodacima Rehmannia glutinosa ili Astragalus membranaceus (200 mg/d) tokom 10 mjeseci (n {{4 }}/grupa); kontrolna grupa je hranjena standardnom ishranom. A, Protočna citometrijska analiza SA‐gal‐pozitivnih ćelija Lin–Sca1 plus c‐kit– (LSK) koristeći fluorescentni ‐galaktozidazni supstrat (C12FDG). B, Procenat reaktivnih vrsta kiseonika (ROS)-pozitivnih ćelija u LSK. Protočna citometrijska analiza ROS-pozitivnih LSK-a. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju (SD). *P < 0.05,="" ***p="">< 0,001.="" c,="" obrazac="" ekspresije="" gena="" povezanih="" sa="" ćelijskom="" starenjem="" u="" lsk;="" gapdh="" je="" korišten="" za="" normalizaciju.="" podaci="" predstavljaju="" srednju="" vrijednost="" ±="" sd="" za="" tri="" eksperimenta.="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

4|DISKUSIJA

U ovoj studiji istraživali smo mehanizamefekti protiv starenjaR. glutinosa ili A. membranaceus dopunjavanjem ishrane miševa biljkama u dozi od 200 mg/d tokom 10 meseci. Utvrđeno je da R. glutinosa ispoljava efekte protiv starenja, uključujući smanjeno starenje i povećano preživljavanje HSC-a, kao i

pojačan imunitet na B-ćelije. U smislu mehanizmaefekti protiv starenja, otkrili smo da je R. glutinosa smanjila broj HSC, dok je povećan kapacitet proliferacije. Nadalje, R. glutinosa održava mirovanje HSC i smanjuje broj SA‐gal‐pozitivnih ćelija i nivoe ROS kroz regulaciju p18, p53 i p16. U kombinaciji, naši rezultati su potvrdili daefekti protiv starenjaR. glutinosa kod miševa se liječe održavanjem mirovanja i poboljšanjem funkcije HSC.

Rehmannia glutinosa, koja se hiljadama godina koristi kao tradicionalni kineski biljni lijek, može se koristiti za liječenje hipoglikemije kod različitih dijabetičkih poremećaja.27,28 Također je objavljeno da ekstrakt R. glutinosa pospješuje metabolizam kostiju.29 Nadalje, R. glutinosa inhibira upalne odgovore i sindrome,30,31 i štiti od oštećenja ćelija uklanjanjem slobodnih radikala.14,32 U ovoj studiji smo otkrili da je dodatak ishrani kod miševa sa R. glutinosaefekti protiv starenjai poboljšan imunitet B-ćelija povećanjem proliferativnog kapaciteta LT-HSC i smanjenjem broja SA-gal-pozitivnih ćelija i nivoa ROS-a.

Utvrđeno je da se stepen oksidativnog oštećenja povećava sa godinama u različitim ćelijama i tkivima. Oksidativni stres je kritična determinanta samoobnavljanja HSC. Gubitak mirovanja LT‐HSC često korelira sa povećanim ćelijskim ROS, što je negativno povezano sa samoobnavljanjem HSC.26 Catalpol je iridoidni glukozid, koji je pronađen u korijenu R. glutinosa. Catalpol je pokazao inhibiciju oksidativnog stresa, oštećenja DNK i skraćivanja telomera putem PGC‐1/TERT puta u prethodnoj studiji.33 U našoj studiji, nivo ROS je smanjen u LSK ćelijama iz grupe R. glutinosa u poređenju sa kontrolnom grupom. Tako R. glutinosa produžava preživljavanje miševa inhibirajući oksidativni stres u HSC.

SLIKA 6 Protočna citometrijska analiza procenta zrelih imunih ćelija u perifernoj krvi (PB), koštanoj srži (BM), slezeni i timusu. Miševi (u dobi od 20 mjeseca) su hranjeni hranom sa dodatkom Rehmannia glutinosa ili Astragalus membranaceus (200 mg/d) tokom 10 mjeseci (n=5/grupi); kontrolna grupa je hranjena standardnom ishranom. A, Protočna citometrijska analiza procenta B ćelija (B220 plus) u PB, BM i slezeni. B, Protočna citometrijska analiza procenta ćelija monocita i granulocita (CD11b plus) u PB i BM. C i D, Protočna citometrijska analiza procenta CD4 plus i CD8 plus ćelija u PB, slezeni i timusu. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SD. *P <>

Astragalus membranaceus se također koristi u tradicionalnoj kineskoj medicini za jačanje imuniteta, smanjenje šećera u krvi i promicanje apoptoze tumorskih stanica, a također imaantioksidacijaiprotiv starenjasvojstva. U ovoj studiji smo otkrili da dodatak ishrani sa A. memranaceus tokom 10 meseci nije imao očigledne efekte u poređenju sa onima uočenim kod kontrolnih miševa, dok je težina miševa smanjena za 20 meseci. Stoga, A. membranaceus može biti neprikladan za LT tretman za hranjenje miševa.

Zaključno, naši rezultati pokazuju da R. glutinosa može produžiti životni vijek miševa održavanjem mirovanja i poboljšanjem funkcije HSC. Nadalje, R. glutinosa može smanjiti međućelijske nivoe ROS i broj SA‐gal‐pozitivnih ćelija i poboljšati imunitet B‐ćelija.

ZAHVALNICA

Ovu studiju su djelimično podržali Nacionalna naučna fondacija za Kinu (31672374), CAMS Inovacioni fond za medicinske nauke (CIFMS) (2016‐ 12M‐ 1‐012) i PUMC Youth Fund (2017310018).

SUKOB INTERESA

Nema.

DOPRINOSI AUTORA

Svi navedeni autori ispunjavaju uslove za autorstvo. CQ i LFZ su osmislili i dizajnirali eksperimente. LB je izvršio eksperimente i napisao glavni test rukopisa. GYS je izvršio i analizirao podatke FACS-a. YJY je osmislio eksperiment o kineskoj tradicionalnoj medicini. WC je upravljao miševima. Svi autori su pročitali i odobrili rukopis.