Kvantitativna proteomska studija razotkriva put fibrinogena kod policistične bolesti jetre

sažetak:(1) Pozadina: Policistična bolest jetre (PLD) je heterogena grupa kongenitalnih poremećaja karakteriziranih proširenjem žučnih vodova i razvojem cista nastalih iz holangiocita. Ipak, mehanizam cistogeneze je trenutno nepoznat i PLD tretman je ograničen na transplantaciju jetre. Potrebni su nam novi i efikasni terapijski pristupi. U tom kontekstu, ovaj rad ima glavni cilj pronalaženje novih molekularnih puteva, kao i novih terapijskih ciljeva, uključenih u proces cistogeneze jetre. (2) Metode: Kvantitativna proteomika zasnovana na SWATH–MS tehnologiji je urađena upoređivanjem jetrenih proteomaWild Typei mutantna/policistična jetra u apolicistična bolest bubrega(PKD) mišji model (Pkd1kond/kond; Tam-Cre−/+). (3) Rezultati: Identifikovali smo nekoliko proteina izmenjenih u izobilju, sa dvostruko isključenom regulacijom naviše ili naniže i prilagođenimp-vrijednost značajno povezana sa cistogenezom jetre. Zatim smo izvršili obogaćivanje i protein-proteinsku analizu identificirajući klaster fokusiran na jetrene fibrinogene. Konačno, potvrdili smo izbor ciljeva pomoću RT-qPCR,Western blotting,i imunohistohemiju, pronalazeći visoku korelaciju sa kvantitativnim proteomskim podacima i validirajući kompleks fibrinogena. (4) Zaključci: Ovaj rad je identificirao novi molekularni put u cističnoj bolesti jetre, naglašavajući kompleks fibrinogena kao mogući novi terapeutski cilj za PLD.

Ključne riječi:PLD; SWATH; kvantitativna proteomika; terapijski ciljevi

1. Uvod

Policistične bolesti jetre(PLD) je heterogena grupa kongenitalnih poremećaja karakteriziranih proširenjem žučnih kanala i razvojem cista koje potiču od holangiocita (epitelnih stanica iz žučnih kanala). Brojne ciste se šire i napreduju kroz parenhim jetre ugrožavajući njegovu funkciju [1]. PLD se nasljeđuju u dominantnom ili recesivnom obliku i mogu se javiti izolovano (izolirana policistična bolest jetreiliPLD) ili, češće, kaoekstrarenalna manifestacijaautozomnihdominantna bolest policističnih bubrega odraslih(PKD) [2]. Uautosomno dominantna policistična bolest bubrega(ADPKD), ~85% pacijenata razvija ciste jetre u cijelom jetrenom parenhima i njihova težina može varirati od nekoliko cista do teške jetrene cistogeneze [3,4]. U međuvremenu, uautosomno recesivna policistična bolest bubrega(ARPKD), ciste jetre mogu se razviti, ali glavna komplikacija jetre je defektno remodeliranje duktalne ploče s kongenitalnom fibrozom jetre [5,6]. Za oboje, PLD je glavna ekstrarenalna manifestacija i zahtijeva kliničko liječenje i liječenje [2,5]. Glavni klinički pristup za pacijente s PLD je smanjenje njihovih kliničkih simptoma. Liječenje komplikacija žučnih kanala je glavna klinička karakteristika koju treba kontrolirati, a konačna strategija liječenja je obično transplantacija jetre [7], budući da ne postoji efikasan farmakološki tretman za PLD [2,5]. Višestruki molekularni putevi su povezani sa bolešću [8], kao što su povećano lučenje tečnosti [9,10], proliferacija [11], fibroza [12,13], cilijarni defekti [14] i drugi [7,8]; ali glavni mehanizam koji prolazi kroz cistogenezu ostaje da se razjasni. Hitno je potrebna identifikacija novih potencijalnih terapijskih ciljeva. Sve ove studije bile su zasnovane na molekularnim studijama koristeći različite klasične molekularne alate: 3D ćelijska kultura [7,8], imunohistohemija [7–9,11,12], ELISA [9,11], transmisiona elektronska mikroskopija (TEM) [12] , imunocitohemija [11], RT-qPCR (kvantitativni PCR u realnom vremenu) [7,8,10,11] i Western blot [7,8,10–12]. Pristup proučavanju bolesti iz novih perspektiva, dobro uspostavljenih pretkliničkih životinjskih modela i iskorištavanje prednosti novih tehnologija može biti od koristi u otkrivanju novih molekularnih mehanizama bolesti za prevođenje molekularnih otkrića u nove terapije.

Tekuća kromatografija u kombinaciji s tandem masenom spektrometrijom (LC–MS/MS) je najčešće korištena tehnologija za karakterizaciju proteoma bolesti, kao i identifikaciju mogućih biomarkera bolesti ili skrining lijekova [15,16]. Strategija u nastajanju pod nazivom SWATH–MS (uzastopno prikupljanje svih teoretskih spektrometrija fragmenata jona–masene spektrometrije) omogućava reproducibilnu, pouzdanu, visokopropusnu kvantifikaciju sa do hiljadama proteina analiziranih po biološkom uzorku, i s mogućnošću istovremenog izvođenja veliki broj testova [16,17]. Za ovu tehnologiju, uzorci se digestiraju tripsinom i analiziraju tečnom hromatografijom u kombinaciji sa tandemom masovnom hromatografijom radi u tzv. Data-Independent Acquisition (DIA) modu [16] (vidi Materijal i metode). Proteomička tehnologija SWATH-MS nove generacije omogućava kvantifikaciju proteoma i identifikaciju razlika u obilju proteina u različitim uzorcima i uslovima.

U ovoj studiji izveli smo diferencijalnu proteomsku kvantitativnu analizu baziranu na SWATH-MS tehnologiji kod policistične bolesti jetre na mutantnim životinjskim modelima. Izvještavamo o listi proteina sa statističkom značajnošću diferencijalne zastupljenosti proteina, koje su okarakterizirale različite analize obogaćivanja i prikupljanje podataka. Konačno, potvrdili smo SWATH podatke identifikacijom i isticanjem kompleksa fibrinogena kao novog mehanizma bolesti i mogućeg novog terapeutskog cilja za PLD.

2. Materijali i metode

2.1. Murine Model

U ovoj studiji koristili smo mišji Pkd1 uslovno-nokaut životinjski model, C57/BL6 k Pkd1cond/cond; Tam-Cre [18,19]. Cremouse model je korišten kao Wild Types (WT), a Cre+ kao Mutant (KO). Genotipovi su potvrđeni standardnim PCR-om, prateći uslove i prajmere opisane [18]. Delecija Pkd1 je uvijek bila 10. i 11. postnatalnog dana (p10 i p11) jednom intraperitonealnom injekcijom tamoksifena (10 mg/40 g) (Sigma®, St. Louis, MO, SAD br. T5648), razrijeđenog u kukuruznom ulju (Sigma–Aldrich®, St. Louis, MO, SAD br. C8267), oba dana u matici legla koje treba inducirati. Životinje su eutanazirane 30. dana nakon rođenja (p30). Grupe su formirane od strane različitih pojedinaca i organizovane nasumično (randomizacija) držeći omjer 1:1 između muškaraca i žena u svim grupama. Za identifikaciju spola životinja korištene su anatomske karakteristike. Miševi su bili smješteni u objektu bez patogena (SPF) prema utvrđenim uvjetima Univerziteta u Santiagu.

2.2. Ekstrakcija i probava proteina

Na p30 tački žrtvovanja, secirane jetre su pohranjene na -80 ◦C. Cela jetra je mlevena u tečnom azotu korišćenjem maltera hlađenog tečnim azotom (DD Biolab®, Barselona, ​​Španija br. 088763), pri čemu je polovina tkiva dodeljena za ekstrakciju proteina, a druga polovina za ekstrakciju RNK. Ekstrakti proteina pripremljeni su sa RIPA puferom za lizu (10 Mm TRIS, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% TRITON X-100 i 1% natrijum deoksiholat). Dodati su i 1% inhibitori proteaze i fosfataze (Sigma® br. P8340 y br. P0044). Ovaj lizat tkiva je podvrgnut procesu centrifugiranja (30 min na 4 ◦C i 14,{18}} o/min). Supernatant je zatim sakupljen i kvantifikovan Bradfordovim proteinskim testom (Bio-Rad® br. 5000001). Alikvoti proteina (100 µg) koncentrirani su u jednoj vrpci u 10% natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezi (SDSPAGE), isječeni i predati na ručnu digestiju kao što je prethodno opisano [20]. Konačno, ekstrahovani peptidi su rastvoreni u 0,1% mravlje kiseline za dalju analizu.

2.3. Proteomika

2.3.1. DDA-Podaci

Zavisna analiza 4 µL svakog uzorka (preko 4 µg proteina) analizirano je pristupom akvizicije ovisno o podacima (DDA) pomoću mikro-LC-MS/MS. Uzorci su razdvojeni Ekspert nLC425 mikro-LC sistemom (Eksigen®, Dublin, Kalifornija, SAD) koristeći YMC-TRIART C18 trap kolonu sa veličinom čestica od 3 mm i veličinom pora 120 Å (YMC Technologies, Teknokroma, Barcelona, ​​Španija) i kolona Chrom XP C{{10}} mm × 0.30 mm, veličina čestica 3 mm i veličina pora od 120 Å (Eksigen® ) pri brzini protoka od 10 µL/min. Korišteni rastvarači su rastvarač A (voda, 0,1% mravlje kiseline) i rastvarač B (ACN, 0,1% mravlja kiselina). Gradijent je bio od 5% do 95% B tokom 30 minuta, 5 minuta na 90% B i, konačno, još 5 minuta na 5% B za ekvilibraciju kolone, za ukupno vreme od 40 minuta. Spojeni maseni spektrometar bio je hibridni kvadrupol-TOF maseni spektrometar, 6600 (SCIEX®, Framingham, MA, SAD) koji radi sa sistemom za akviziciju ovisno o podacima u modu pozitivnih jona. Koristeći maseni spektrometar, izvršeno je skeniranje od 250 ms pri 400 do 1250 m/z, nakon čega su uslijedili MS/MS eksperimenti na 100 do 1500 m/z (25 ms vremena akvizicije) za ukupno vrijeme ciklusa od 2,8 s. Fragmentirani prekursori su dodani na listu dinamičkih isključenja na 15 s, svaki ion sa nabojem +1 je isključen iz MS/MS analize. MS sirove pretrage datoteka i baze podataka su kombinovane i izvedene pomoću softvera ProteinPilot v.5.0.1. (SCIEX®, Framingham, MA, SAD) koristeći UniProt Swiss-Prot bazu podataka specifičnu za miš. Potrebno je navesti jodoacetamid cistein alkilaciju kao fiksnu modifikaciju i digestiju tripsina. Stopa lažnog otkrića (FDR) postavljena je na 1 za peptide i proteine ​​sa skorom pouzdanosti većim od 99% [21].

2.3.2. Generisanje referenci

Spektralna biblioteka Spektralna biblioteka je izvedena pomoću DDA metode kao što je gore opisano, ali umjesto svakog nezavisnog uzorka, skup svake grupe je izveden sa 4 µL svakog uzorka (preko 4 µg proteina) kako bi se dobio reprezentativniji protein identifikacija u spektralnoj biblioteci. Svi neobrađeni fajlovi su zajedno lansirani u Uniprot bazu podataka kako bi se dobila spektralna biblioteka koristeći uslove za pilot proteine ​​pomenute u prethodnom odeljku.

2.3.3. Kvantifikacija pomoću SWATH i analize podataka

SWATH–MS akvizicija je izvedena korištenjem DIA metode. Koristili smo 4 grupe sa 4 biološke replike po grupi i 3 tehničke replike po uzorku (vidi Tabelu S1 za više detalja). Tkiva su analizirana i, u svim slučajevima, upoređena u uslovima divljeg tipa (od Pkd1cond/cond; Tam-Cre− miš) i mutanta (iz Pkd1cond/cond; Tam-Cre+ miš). 4 µg proteina po uzorku i tehničke replike su izvedene korištenjem SWATH metode. Za svaki skup uzoraka, širina 100 varijabilnih prozora je optimizirana prema ionskoj gustini pronađenoj u biblioteci DDA rada koristeći Sciex SWATH tabelu s promjenjivim prozorima. Stoga se SWATH metoda temeljila na ciklusu ponavljanja koji se sastojao od akvizicije 100TOF MS/MS skeniranja (400 do 1500 m/z, način visoke osjetljivosti, 50 ms vrijeme akvizicije) izolacijskih prozora sekvencijalnih preklapajućih prekursorskih varijabli sa širinama (1 m/z preklapanje) pokriva raspon mase od 400 do 1250 m/z s prethodnim TOF MS skeniranjem (400 do 1500 m/z, 50 ms vrijeme akvizicije) za svaki ciklus. Ukupno vrijeme ciklusa je 6,3 s.

2.3.4. Analiza podataka

Svi proteini u biblioteci jona koje je identifikovao ProteinPilot sa FDR ispod 1% kvantifikovani su SWATH metodom. Nakon što su pojedinačni uzorci dobijeni, spektralno poravnanje i ciljana ekstrakcija podataka izvedeni su pomoću PeakView v.2.2. (SCIEX®, Framingham, MA, SAD) koji odgovara referentnoj spektralnoj biblioteci kao što je opisano u nastavku [22–26]. Vremena retencije peptida koji su odabrani za svaki protein su u svakom ciklusu ponovo poređana u skladu sa iRT peptidima prisutnim u svakom uzorku i eluirani su duž ose cijelog vremena. Izvučeni ionski kromatogrami su zatim generirani za svaki ion odabranog fragmenta; površine pikova za peptide su dobijene dodavanjem površina pikova jona odgovarajućih fragmenata. PeakView je izračunao FDR i rezultat za svaki dodeljeni peptid prema komponentama hromatografije i spektra; samo peptidi sa FDR ispod 5% korišteni su za kvantitaciju proteina. Slično, da bi se dobila područja za kvantifikaciju proteina u funkciji intenziteta signala, odabrano je do 10 peptida po proteinu i sedam fragmenata po peptidu. Svi zajednički i modificirani peptidi isključeni su iz obrade. Prozori od pet minuta i širine od 30 ppm korišteni su za ekstrakciju ionskih hromatograma.

2.3.5. Analiza puteva signalizacije

Različite funkcionalne analize izvedene su korištenjem različito eksprimiranih proteina za procjenu najrelevantnijih interakcijskih mreža, srodnih puteva ili ćelijskih komponenti i drugih povezanih proteina ili puteva. Korišteni su pristupni brojevi UniProt proteina (https://www.uniprot.org/, 28. avgust 2021.). Proteini s razlikama u obilju proteina podvrgnuti su: String® (https://string-db.org/, 25. oktobar 2021.) korištenjem termina Gene Ontology (GO) i FunRich® (http://funrich.org/index.html , 21. oktobar 2021.) za proučavanje proteinskih mreža i biološke povezanosti između proteina; i Reactome® (https://reactome.org/, 25. oktobar 2021.) za proučavanje puteva uključenih u odnos ili interakciju sa značajno izraženim proteinima.

2.4. Histologija i mjerenje cističnog indeksa

Najveći režanj jetre životinja je uvijek fiksiran u paraformaldehidu (4% puferirana otopina paraformaldehida, pH=7, Labbox br. FORM-D0P-10K) preko noći u 4 ◦C. Jetra su zatim dehidrirane ksilenom i etanolom i na kraju stavljene u parafin. Sakupljeni su poprečni presjeci od 4,5 µm. Za hematoksilin-eozin (HE) i Masson trihrom bojenje korišteni su standardni protokoli.

Za kvantifikaciju, dijapozitivi uzdužnih presjeka najvećeg režnja jetre su uvijek uzimani kao reprezentativne slike, a najmanje šest različitih sekcija po životinji, vizualiziranih pod Olympus BX51 mikroskopom povezanim s Olympus kamerom DP70, korišteno je za kvantifikaciju cistični indeks i niz cista. Kvantifikacija oba parametra izračunata je pomoću softverskog alata za automatsko prepoznavanje cista pod nazivom CystAnalyser (https://citius.usc.es/transferencia/software/cystanalyser, 1. srpnja 2020.) kao što je prethodno opisano [35].

2.5. Clinical Chemistry

Krv je uzeta prije eutanazije, a serum je dobiven korištenjem BD Vacutainer SST II Advance epruveta. Serumska alanin transaminaza (ALT) i alkalna fosfataza (ALP) mjerene su korištenjem ADVIA 2400 Chemistry System (Siemens Healthineers, Erlangen, Njemačka).

2.6. Ekstrakcija RNK

RNK je izolirana kako je prethodno opisano [36] korištenjem TRIzol protokola (TRI Reagent, Sigma®, St. Louis, MO, USA, br. T9424), u kojem je kloroform (Sigma® br. C2432) služio kao denaturirajući agens za stanice a izopropanol (Sigma® br. 650447) je bio precipitator za RNK. Precipitat je razrijeđen u DEPC vodi (Ambion®, Austin, TX, SAD, br. AM9920), koja također sadrži 1% inhibitora SUPERaseIn RNase (Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, br. AM2694).

2.7. Kvantitativni PCR u realnom vremenu

Jedan mikrogram ukupne RNK jetre tretiran je DNazom I (Invitrogen®, Carlsbad, CA, SAD, br. 18068015). Zatim je obavljena reverzna transkripcija sa kompletom SuperScript® III First-Strand Synthesis System (Invitrogen®, br. 18080051) i analiza genske ekspresije kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu koristeći FastStart Universal SYBR GREEN Master (ROX) (Roche® br. 049113914 ) u sistemu Mx3005P (Agilent Technologies®, Santa Clara, Kalifornija, SAD). Prajmeri korišćeni za ovu studiju dizajnirani su sa Primer 3 Plus (http://tiny.cc/pf928y, 11. mart 2020) i zasnovani su na referentnim sekvencama cDNK objavljenim u pretraživaču genoma Ensembl (http://www.ensembl.org /index.html, 11. mart 2020.). Pune sekvence svih prajmera korišćenih u studiji nalaze se u tabeli S2. Sledeći program je korišćen za sve kompletne PCR reakcije: korak denaturacije sa 30 s na 95 ◦C; 45 ciklusa od 30 s na 95 ◦C, 1 min na 60 ◦C i 30 s na 72 ◦C; nakon čega slijedi korak hlađenja. Kao što smo prethodno izveli [36], svaki uzorak (n=6 za svaku grupu) je rađen u tri primjerka u svakom eksperimentu. Rezultati su analizirani metodom apsolutne kvantifikacije. Posljedično, standardna kriva sa poznatim koncentracijama je korištena u testu i, osim toga, svaki uzorak je normaliziran na gen konstantne ekspresije. U ovoj studiji, Gapdh gen (gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza) je korišten kao gen za održavanje kućanstva.

2.8. Western blotting

Western blot testovi su izvedeni na lizatima cijele jetre. Ukupni sadržaj proteina određen je Bradfordovim testom proteina (Bio-Rad®, Hercules, CA, USA, br. 5000001) i ista količina svakog proteina (20-30 µg) je određena kuvano na 95 ◦C 5 min i odvojeno u 10% SDS-PAGE pod uslovima redukcije. PageRulerTM Prestained Protein Ladder (Thermo Fisher®, Waltham, MA, SAD, br. 26616) je korišten kao standard molekularne težine proteina. Nakon toga, proteini su prebačeni na nitrocelulozne membrane (Bio-Rad® br. 1620115). Da bi se izbjeglo nespecifično vezivanje, membrane su blokirane 1 h na sobnoj temperaturi korištenjem 2,5% otopine BSA (NZYTech®, Lisboa, Portugal, br. MB046) za fosforilirane proteine ​​ili SuperBlock pufera za blokiranje (Thermo Fisher®, Waltham, MA, SAD, br. 37515). Nakon toga, membrane su inkubirane preko noći na 4◦C sa primarnim antitelima i zatim isprane u 0,3% Tween-20 u PBS. Konačno, nitrocelulozne membrane su inkubirane 1 h na sobnoj temperaturi sa sekundarnim antitijelima vezanim za HRP. Signali su razvijeni sa SuperSignal™ West Pico PLUS hemiluminiscentnim supstratnim kompletom (Thermo Fisher®, Waltham, MA, SAD, br. 34580) ili PierceTM ECL Western Blotting supstratom kitom (Thermo Fisher®, Waltham, MA, SAD br. 32109) prije za vizualizaciju u ChemiDoc™ Imaging System (Bio-Rad®, Hercules, CA, SAD). Proteinske trake su kvantificirane pomoću softvera ImageJ® Lab (v 4.0.1, https://imagej. nih.gov/ij/, 26. mart 2021.). Nivoi denzitometrije proteina su normalizovani na proteine ​​za održavanje GAPDH ili -ACTIN. Za svaku grupu. N=6 je korišten u svim eksperimentima.

Sljedeća primarna antitijela su korištena za Western blotting: anti-ANXA2 (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, SAD #sc-28385), anti -SAMP (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, SAD, br. sc-393948), anti-FIBB (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, SAD, br. sc-271035), anti-FIBA (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, SAD, br. sc-398806), anti-FIBG (1:500 , Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, SAD, br. sc-133157), anti-HAO2 (1:1000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, SAD, br. 113442), anti-GAPDH (1:1000, Cusabio®, Houston, TX, SAD, br. CSB-RA009232A0HU) i anti- -ACTIN (1:1000, Cell Signaling Technology®, Danvers, MA, SAD, br. 8457), kao kao i sekundarno antitijelo kozjeg anti-zečjeg IgG HRP (1:5000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, SAD, br. 31460) ili kozjeg anti-mišjeg IgG HRP (1:5000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, SAD, br. 31430).

2.9. Imunohistohemija i kvantifikacija

Za imunohistohemiju, natrijum citratni pufer pH=6 (Agilent Dako®, Glostrup, Danska br. S2369) korišćen je za izvlačenje antigena, a tkivo je blokirano razblaživačem antitela (Agilent Dako® br. K8006). Antitelo korišćeno za imunohistohemijsku analizu je fibrinogen (Agilent Dako® br. A0080), a HPR-konjugovani detekcioni sistem za imunodetekciju. Konačno, kvantifikacija imunohistohemije izvršena je pomoću funkcije "Split channels" (zeleni kanal) iz softvera Fiji-ImageJ® (https: //imagej.net/software/fiji/, 13. listopada 2021.). Za svaki uzorak korišteno je n veće ili jednako 6 slika.

2.10. Statistics Analysis

Data are presented as means ± SEM for all cases (bar or point plots). First, normal distribution was confirmed using the Kolmogorov–Smirnov test. A two-tailed t-test was used to determine the significance of differences between two groups. p < 0.05 was considered statistically significant. Furthermore, ** corresponds to p-values < 0.01 and *** to p-values < 0.001. All datasets were analyzed using GraphPad Prism software (version 9, https://www.graphpad.com/, 13 October 2021). For proteomic studies, a Student's t-test (using MarkerView software, 22 December 2017) was performed to compare the groups in pairs to identify proteins, which were significantly differentially represented using adjusted p-value < 0.05 (multiple correction FDR method) and fold change >2 kao granična vrijednost. Izvršena je multivarijantna statistička analiza bez nadzora korištenjem analize glavnih komponenti (PCA) kako bi se uporedili podaci u uzorcima.

Wecistanche usluga podrške - najveći izvoznik cistanchea u Kini:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Kupite za više detalja o specifikacijama:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

NABAVITE PRIRODNI ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE SA 25% EHINAKOZIDA I 9% AKTEOZIDA ZA INFEKCIJU BUBREGA