Kvantitativna procjena upalnih infiltrata u biopsijama za transplantaciju bubrega korištenjem multipleksnog pojačanja tiramidnog signala i dubokog učenja

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Meyke Hermsen¹Valery Volk²Jan Hinrich Bräsen²et al

Abstract

Odgođena funkcija grafta (DGF) je snažan faktor rizika za razvoj intersticijske fibroze i tubularne atrofije (IFTA) kod transplantacija bubrega. Kvantitativna procjena upalnih infiltrata u biopsijama bubrega DGF pacijenata može otkriti prediktivne markere za razvoj IFTA. U ovoj studiji, kombinovali smo multipleksnu amplifikaciju tiramidnog signala (mTSA) i konvolucione neuronske mreže (CNN) kako bismo procijenili inflamatorno mikrookruženje u biopsijama bubrega DGF pacijenata (n=22) uzetih 6 sedmica nakon transplantacije. Pacijenti su stratificirani za razvoj IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

Cistanche deserticola sprječava bolest bubrega, kliknite ovdje za uzorak

Uvod

Odgođena funkcija grafta (DGF) nakon transplantacije bubrega je multifaktorska i uglavnom se odnosi na karakteristike donora i vrijeme ishemije. DGF se općenito opisuje kao potreba za dijalizom unutar 7 dana nakon transplantacije i predstavlja snažan faktor rizika za kroničnu ozljedu bubrežnog transplantata [1–3]. Klasična komponenta hronične povrede bubrega je prisustvo intersticijske fibroze i tubularne atrofije (IFTA). Međutim, ne napreduju svi pacijenti sa DGF do razvoja IFTA, a složeni odnos između DGF i IFTA je još uvijek slabo shvaćen. Ovo je prvo zbog vremena kašnjenja između potencijalno uzročnih događaja i funkcionalnog opadanja, a drugo zbog varijabilnih i složenih efekata potencijalnih induktora kao što su odbacivanje i nuspojave lijekova [1, 4]. Opšte prisustvo upale i specifičnih makrofaga opisano je u brojnim studijama kao prediktor gubitka transplantata [5–8]. Međutim, osnovni patološki procesi nisu u potpunosti shvaćeni, a visoki nivoi upale ne dovode uvijek do dugoročnog gubitka transplantata. Kao rezultat podražaja iz okoline, makrofagi dobivaju specijalizirane funkcije i polariziraju se u različite fenotipove. Brojne studije sugeriraju da su specifični podtipovi makrofaga (alternativno aktivirani makrofagi) uključeni u remodeliranje tkiva izazivanjem popravke tkiva ili fibroze. Poznato je da polarizacija prema fenotipu remodeliranja tkiva (ponekad profibrotičnom) zavisi od širokog spektra stimulansa iz okoline, između ostalih koje pružaju podtipovi limfocita T-pomoćnika [9-11]. Procjena populacija T-helper ćelija u transplantatu u vrijeme DGF-a otkrila je preovlađujući podtip T-helpera 1, ali korelacije sa ishodom transplantata ili progresijom do IFTA do sada nisu istraživane [12]. Sveobuhvatna procjena upalnog mikrookruženja posebno fokusirana na makrofage i podskupine T-pomoćnih ćelija u pažljivo odabranim grupama pacijenata može pružiti uvid u to zašto neki, ali ne svi DGF pacijenti napreduju do razvoja IFTA.

Međutim, sveobuhvatno istraživanje upalnih infiltrata ometa nekoliko (tehničkih) ograničenja. Tradicionalna imunohistohemija (IHC) i tehnike imunofluorescencije podržavaju vizualizaciju samo ograničenog broja ćelijskih markera u jednom dijelu tkiva. Serijsko sečenje malih, vrijednih fragmenata tkiva kao što su biopsije bubrega nije poželjno i tumačenje odnosa između stanica u različitim dijelovima je teško. Osim toga, kvantitativna procjena upalnih infiltrata vizualnom procjenom dolazi sa značajnim nivoom varijabilnosti među posmatračima [13]. Tradicionalne tehnike obrade slike, kao što su granična vrijednost piksela, razvodnica i segmentacija zasnovana na morfologiji, oslanjaju se na prethodno poznavanje svih morfoloških reprezentacija ćelija i intenziteta mrlja tkiva kroz skup podataka [14–16]. Stoga, ovim metodama često nedostaje robusnost za biološke i tehničke varijacije slike i loše se prevode u nove ili vanjske skupove podataka. Porast digitalne patologije ubrzao je razvoj alternativnih metoda za procjenu slika cijelog slajda (WSI) [17, 18]. Modeli dubokog učenja, konkretno, konvolucione neuronske mreže (CNN) su se pokazale sposobnim da segmentiraju i detektuju relevantne biološke strukture u histopatološkim slajdovima [19–23]. Ove tehnike imaju potencijal da pređu sa subjektivne vizuelne procjene i tradicionalne obrade slike do preciznog, objektivnog i ponovljivog otkrivanja ćelija.

Cilj ove studije je razviti metodu za objektivnu, kvantitativnu procjenu višestrukih inflamatornih ćelijskih markera, zaobilazeći potrebu za opsežnim serijskim sekcijama dijapozitiva. Da bismo to učinili, kombiniramo multipleks IHC, multispektralno snimanje i modele dubokog učenja. Da bismo demonstrirali primjenjivost ovih tehnika, proučavamo korelacije upalnog mikrookruženja, kvantificirane modelima dubokog učenja, s razvojem IFTA-e u nadzornim biopsijama transplantata DGF pacijenata.

ekstrakt cistanche za liječenje bolesti bubrega

materijali i metode

Da bismo procijenili inflamatorno mikrookruženje u biopsijama bubrega pacijenata sa DGF, izvršili smo multipleks IHC na nadzornim biopsijama uzetim 6 sedmica nakon transplantacije. Pacijenti su stratificirani za razvoj IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

Uzorci tkiva

Koristili smo nadzorne biopsije od primaoca transplantacije bubrega na medicinskom fakultetu u Hanoveru (Hannover, Njemačka), dobijene u kontekstu prospektivnog programa nadzorne biopsije. Kriterijumi za uključivanje su bili: pojava DGF-a (definisano kao<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

IFTA procjena

Opseg intersticijalne fibroze (ci) i tubularne atrofije (ct) (IFTA) nakon 6 sedmica i 6 mjeseci, izražen koristeći Banffov sistem ocjenjivanja lezija [24], dobijen je iz izvještaja o patologiji. Da bi se detaljnije procijenio odnos između ranih upalnih infiltrata i razvoja IFTA-e, svi dijapozitivi obojeni PAS-om su digitalizirani za ponovno ispitivanje korištenjem Pannoramic 25{9}} Flash II digitalnog skenera slajdova (3DHistech, Mađarska) sa 20 × objektiv pri rezoluciji od 0,24 μm/piksel. PAS WSI za obje vremenske tačke (6 sedmica i 6 mjeseci) su ocijenjena za opseg IFTA (procenat površine, sa intervalima od 10 posto) od strane tri patologa bubrega. Prosječni IFTA rezultati patologa korišteni su kao konačni rezultat za izračunavanje promjene IFTA između 6 sedmica i 6 mjeseci nakon transplantacije. Pacijenti su stratificirani apsolutnim povećanjem IFTA rezultata od 10 posto ili više (n=13) i bez ili<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

Pored toga, rezultati Banffovih lezija su upoređeni između vremenskih tačaka korištenjem Wilcoxonovog testa rangiranja. Ovo je otkrilo značajne razlike između biopsija od 6 sedmica i 6 mjeseci za Banff kategorije ti (p=0.017), ci (p=0.004) i ct (p=0.011) .

Multipleks TSA bojenje

Izveli smo multipleks IHC koristeći mTSA za vizualizaciju višestrukih ćelijskih markera u biopsijama od 6 sedmica. Nakon inkubacije s primarnim i sekundarnim antitijelima, tkivo je tretirano fluorescentno označenim tiramidom. Peroksidaza iz hrena iz sekundarnog antitijela katalizira stvaranje aktivnih tiramidnih radikala. Tiramidni radikali se kovalentno vezuju za ostatke tirozina na antigenu. Ovo trajno vezivanje je omogućilo toplotno-indukovano uklanjanje kompleksa primarno-sekundarnog antitijela uz očuvanje fluorescentnog depozita tiramida [25]. Ovo je omogućilo kasniju uzastopnu inkubaciju sa daljim antitelima iz iste vrste protiv ciljnih antigena.

mTSA je urađen na dva uzastopna dijapozitiva iz 6 sedmičnih nadzornih biopsija. Razvili smo dva mTSA panela za procjenu inflamatornog infiltrata i peritubularnih kapilara u našim grupama pacijenata. Panel I je postojao anti-CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 i CD34 antitela. Panel II je korišten za istraživanje T-pomoćnih stanica i polarizacije makrofaga korištenjem anti-CD4, Tbet, GATA3, CD68 i CD163 antitijela. Specifikacije antitela, razblaženja i redosled bojenja navedeni su u dodatnoj tabeli 1. Sva stakalca su deparafinizovana u ksilenu, dehidrirana u 95% etanolu, isprana u vodi iz slavine i prokuvana za dobijanje epitopa u 10x razblaženom tris-T boolu ED , 0658, VWR Life Sciences, US) pufer. Nakon hlađenja, stakalca su isprana u 3-postotnom rastvoru vodonik peroksidaze za blokiranje endogene peroksidaze i isprana puferom sa slanim rastvorom puferom tris sa 0,05 procenata Tween 20 (822184, Merck KGaA, Nemačka) (TBS-T). Blokiranje proteina je izvedeno upotrebom TBS-T sa 1 posto goveđeg serumskog albumina (BSA) (mTSA korak 1). Primarna antitijela su inkubirana 1 h na sobnoj temperaturi ili preko noći na četiri stepena Celzijusa (mTSA korak 2). Nakon ispiranja u TBS-T, stakalca su inkubirana sa HRP-konjugiranim sekundarnim antitelom (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, Holandija) 30 minuta na sobnoj temperaturi (mTSA korak 3). Zatim je TSA izveden korištenjem Opal TSA fluorofora iz Opal 7-color Manual IHC kompleta (NEL811001KT, Akoya Biosciences, SAD) (mTSA korak 4) (fluorofori i njihova odgovarajuća antitijela su navedeni u Dodatnoj tabeli 1). Kompleks antitijelo-TSA je uklonjen ciklusom ključanja u TBE puferu (mTSA korak 5). Koraci mTSA 1–5 su se ponavljali sve dok pločice nisu obojene svim antitelima sa dotične ploče. Stakalca su prekrivena fluoromount-G sa DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, SAD).

herba cistanche

Multipleks TSA validacija

Ponovljeni ciklusi ključanja mogu uticati na afinitet ciljnog epitopa. Neka antitijela pokazuju slabiji obrazac bojenja nakon što se tkivo prokuha više puta, drugim antitijelima je potrebno više ciklusa ključanja da bi postigla optimalni intenzitet bojenja, a na druga uopće ne utiče. Ovaj efekat smo procijenili za sva antitijela koristeći hromogeni IHC na FFPE kontrolnom tkivu krajnika. Za svako testirano antitijelo (n=9), izrezano je šest sekcija (debljine 4 μm). Sva stakalca su deparafinizovana u ksilenu, dehidrirana u 95-postotnom etanolu, isprana u vodi iz slavine i prokuvana za vađenje epitopa u 10x razblaženom TBE (prvi ciklus ključanja). Nakon hlađenja, jedno staklo po testiranom antitelu je pohranjeno u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS). Preostala stakalca su ponovo prokuvana. Ovaj ciklus je ponovljen pet puta. Sva stakalca su zatim isprana u 3 procentnom rastvoru vodonik peroksidaze i nakon toga isprana u PBS. Primarna antitijela (dodatna tabela 1) su inkubirana 1 h na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije, stakalca su isprana u PBS. Stakalca obojena anti-CD68, Tibet i GATA3 antitelima zahtevali su dodatnu inkubaciju sa blokadom nakon antitela (PAB) u trajanju od 15 minuta (blokiranje VWRKDPVB, Immunologic, Holandija). Nakon inkubacije, stakalca su isprana u PBS-u i inkubirana sa sekundarnim antitijelom konjugiranim s HRP (prateći PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, Nizozemska, za druge, vidi Dodatnu tabelu 1 sekundarnog antitijela). Vizualizacija je izvršena korišćenjem 3,3′-diaminobenzidina (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, Holandija). Rezultati su prikazani na dodatnoj slici 1. Na osnovu ovih rezultata, odredili smo optimalni redoslijed antitijela za mTSA eksperimente, kao što je navedeno u Dodatnoj tabeli 1.

Ako su epitopi od interesa ko-lokalizirani, depoziti tiramida mogu interferirati jedni s drugima. Da bismo testirali ovu steričku inhibiciju, koristili smo stakalce tkiva za kontrolu krajnika i obojili ih našim mTSA panelima. Ekspresija antitela u mTSA upoređena je sa onom u jednobojnim predmetima, koji su prošli kroz isti broj ciklusa ključanja. Nismo uočili razlike u obrascima bojenja između jednostruko i višestruko obojenih stakalca (primjeri uključeni iz panela I, dodatne slike 2 i 3). Sva primarna antitijela u mTSA korištena su u istom razrjeđenju koje je korišteno za hromogeni IHC. Intenzitet fluorescentnog signala optimiziran je podešavanjem razrjeđenja otopine TSA.

Multipleks TSA snimanje

Multispektralno snimanje je izvedeno pomoću Vectra Polaris Imaging System (CLS143455, Akoya Biosciences, US) sa 20x objektivom, pri rezoluciji od 0,49 μm po pikselu, i korištenjem DAPI, FITC, CY3, Texas Red i Cy5 spektralne kocke. Vectra sistem omogućava ručni odabir regiona za multispektralnu akviziciju, koje sistem zatim deli na pločice (slika 1.1). Spektri autofluorescencije i svi Opal TSA fluorofori su prethodno snimljeni u spektralnoj "biblioteci" korištenjem Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6. (Akoya Biosciences, SAD). Spektralna biblioteka je omogućila dekomponovanje multipleksne pločice na više pojedinačnih pločica koje predstavljaju doprinos svakog fluorofora („razmiksanje“). Ovo je rezultiralo monohromiranim, višekanalnim pločicama, pri čemu je svaki kanal odgovarao jednom fluoroforu, a time i antitelu (slika 1.2).

Konverzija u IHC s umjetnim svijetlim poljem

Na osnovu pohranjenih koordinata, pločice su spojene kako bi se kreirao višekanalni WSI koristeći prilagođenu python skriptu (slika 1.3). Kanali koji predstavljaju DAPI signal (IDAPI) i kanali koji predstavljaju jedno od antitela (IIHC) su konvertovani u veštačko bojenje hematoksilinom i DAB bojenje, respektivno (slike 1.4 i 1.5). Na osnovu poznatih hromatskih hematoksilina i DAB Cx, Cy koordinata nakon transformacije nijansa-zasićenje-gustina (HSD), vektori bojenja su dobijeni u prethodnim studijama [26, 27]. Ovi vektori mrlja korišćeni su za izračunavanje crveno-zeleno-plavih vrednosti za veštačko svetlo polje IHC (slika 1.5), kao:

sa CR, st apsorpcija svjetlosti boje st u crvenom dijelu spektra. Vrijednosti za B i G izračunate su na sličan način.

Analiza slike

Regije od interesa (ROI)

Regije od interesa (ROI) su označene za svaki slučaj u kohorti pomoću softvera platforme za automatsku analizu slajdova (ASAP; verzija 1.9, dostupna kao softver otvorenog koda na GitHubu). Ovi ROI se sastoje od kortikalnog tubulointersticija, isključujući kapsulu, glomerule i arterije. Budući da se upala u subkapsularnim regijama bubrega smatra nespecifičnom u patologiji transplantacije, biopsije u ovoj studiji su prvenstveno analizirane isključujući subkapsularni region (definiran kao 400 µm ispod kapsule). Zatim smo ponovili analize uključujući subkapsularnu regiju. Vizuelni primjeri ROI uključeni su u dodatnu sliku 4.

Detekcija limfocita CNN I

IHC slike umjetnog svijetlog polja koje predstavljaju CD3, CD4, CD8 i CD20 bojenje analizirane su korištenjem postojećeg CNN-a s U-Net arhitekturom [22, 28]. Ova mreža je posebno dizajnirana za detekciju markera citoplazmatskih limfocita u IHC. CNN performanse se mogu izraziti preciznošću, prisjećanjem i F1- rezultatom, gdje:

CNN je postigao preciznost od {{0}},76, opoziv od 0,79 i F1-skor od 0,78 na testnom setu koji je korišten u originalnom radu, koji se sastoji od tradicionalnog IHC WSI. Detekcija pojedinačnih pozitivnih ćelija zahtijeva postavljanje praga CNN izlaza, nakon čega slijedi naknadna obrada. Budući da je bojenje CD3 na mTSA panelu bilo jače u poređenju sa CD4, CD8 i CD20, korišten je niži prag detekcije objekata za posljednja tri (0,4) i originalni prag detekcije objekata za CD3 (0,7). Za procjenu učinka CNN-a na IHC WSI s umjetnim svijetlim poljem u ovoj studiji, četiri IHC WSI s umjetnim svijetlim poljem (CD8 i CD20 od dva pacijenta) korištena su kao testni set u ovoj studiji. Tačkaste napomene (n=1115) su generirane korištenjem ASAP softvera. Nakon primjene mreže, preciznost, prisjećanje i F1- rezultat su izračunati za procjenu performansi CNN-a. Detekcije su se smatrale istinito pozitivnim ako su pronađene unutar 4 µm (prosječni prečnik limfocita) od temeljne napomene o istini. Kada su pronađene dvije detekcije unutar raspona od 4 µm, samo detekcija koje je bilo najbliže napomeni smatralo se istinito pozitivnim. Nakon toga, detekcija limfocita CNN I je korištena za analizu svih umjetnih IHC WSI svijetlog polja koji predstavljaju markere citoplazmatskih limfocita (CD3, CD4, CD8 i CD20).

Detekcija limfocita CNN II

Analiza umjetnog IHC WSI svijetlog polja sa obrascima nuklearnog bojenja (kao što su predstavljeni T-bet i GATA3) kanali koji predstavljaju DAPI i CD4 odabrani su za kombinovanje u jednom WSI (4). Vektori za bojenje dobijeni u prethodnim studijama korišteni su za umjetno bojenje DAPI signala u plavo (hematoksilin) ​​i CD4 signala u smeđe (DAB), što je rezultiralo umjetnim svijetlim poljem IHC WSI (5).

potrebna obuka, validacija i testiranje novog CNN-a. U tu svrhu izrezano je devet stakalca iz kontrolnog tkiva bubrega, krajnika i slijepog crijeva. Ovi predmeti su obojeni IHC anti-Tibetom (klon 4B1{{10}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientifi, SAD) i anti-GATA3 (klon L50-823, CM -405B, Biocare Medical, Holandija) antitijela. Slajdovi su digitalizirani pomoću Pannoramic 250 Flash II digitalnog skenera slajdova u rezoluciji od 0,12 μm/piksel. Dva posmatrača su proizvela beleške od 5726 tačaka u različitim regionima koristeći ASAP softver. Napomene sa pet slajdova korištene su za obuku CNN arhitekture U-Net koristeći zakrpe od 256 × 256 piksela sa veličinom piksela od 0,49 μm/piksel. Dva WSI su korištena za validaciju CNN-a i za određivanje praga detekcije objekata (0,4). Performanse CNN-a na tradicionalnom IHC WSI procijenjene su na zadržanom skupu testova od dva IHC WSI. Učinak CNN-a na IHC WSI s umjetnim svijetlim poljem procijenjen je na sekundarnom testnom setu koji se sastoji od četiri IHC WSI sa umjetnim svijetlim poljem (Tibet i GATA3 od dva pacijenta) sa napomenama od 1082 tačke. Preciznost, prisjećanje i F1-skor su izračunati za procjenu performansi na oba testna seta. Detekcije su se smatrale istinito pozitivnim ako su pronađene unutar 4 µm od temeljne napomene o istini. Kada su pronađene dvije detekcije unutar raspona od 4 µm, samo detekcija koje je bilo najbliže napomeni smatralo se istinito pozitivnim. Nakon toga, detekcija limfocita CNN II je korištena za analizu svih vještačkih IHC WSIs svijetlog polja koji predstavljaju nuklearne (limfocitne) markere (Tibet i GATA3).

Detekcija makrofaga CNN

Za razliku od detekcije limfocita, identifikacija pojedinačnih makrofaga nije jednoznačna. Naročito u grupisanim scenama, može se očekivati ​​značajan nivo varijabilnosti posmatrača. Stoga je mnogo veći broj slučajeva i ljudskih napomena korišten za obuku posvećenog, trećeg CNN-a za detekciju CD68 plus i CD163 plus makrofaga. Sakupljena su stakalca obojena IHC (n=111) iz nativnog i transplantiranog bubrežnog tkiva. IHC bojenje je izvedeno korištenjem anti-CD68 (klon PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, Danska ili klon KP1, M0876, Dako, Danska) ili anti-CD163 (klon MRQ -26, ili 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, UK) antitijelo. IHC slajdovi su digitalizirani pomoću panoramskog 250 Flash II digitalnog skenera slajdova ili Aperio AT2 skenera slajdova (Leica Biosystems, Wetzlar, Njemačka) u rezoluciji od 0.24 ili 0 .25 μm/piksel, respektivno. Četiri posmatrača proizvela su 37.709 tačaka napomena u više ROI u WSI, koristeći protokol za označavanje makrofaga, što je dogovoreno nakon početnih pilot eksperimenata. Napomene sa 101 slajda korištene su za obuku CNN-a YoloV2 arhitekture [29]. Yolo je posebno prikladan za zadatke koji imaju za cilj zadatke otkrivanja. Mreža, koja se sastoji od sedam konvolucionih slojeva, obučena je na zakrpe od 256×256 piksela ekstrahovane u rezoluciji od 0,98 μm/piksel sa graničnim okvirima od 21 μm (na osnovu prosečne veličine makrofaga). Deset WSI korišteno je za validaciju CNN-a i za određivanje praga detekcije objekata (0,45) i nemaksimalnih parametara potiskivanja (0,05). Učinak CNN-a na tradicionalnom IHC WSI procijenjen je na zadržanom skupu testova od deset IHC WSI. Učinak CNN-a na IHC WSI s umjetnim svijetlim poljem procijenjen je na sekundarnom testnom setu koji se sastoji od četiri IHC WSI sa umjetnim svijetlim poljem (CD68 i CD163 od dva pacijenta) sa napomenama od 1033 tačke. Preciznost, pamćenje i F1 rezultati su izračunati kako bi se procijenile performanse na oba testna seta. Detekcije su se smatrale istinito pozitivnim ako su pronađene unutar 21 µm (prosječni prečnik makrofaga) od temeljne napomene o istini. Kada je pronađeno više detekcija unutar raspona od 21 µm, samo detekcija koje je bilo najbliže napomeni smatralo se istinito pozitivnim. Nakon toga, CNN za detekciju makrofaga je korišten za analizu svih IHC WSI umjetnog svijetlog polja koji predstavljaju markere makrofaga (CD68 i CD163).

cistanche tubolosa testosteron

Dvostruka pozitivnost

Pozitivnost ćelija za dva markera (dvostruka pozitivnost) procijenjena je određivanjem broja piksela između detekcije ćelija u različitim kanalima. Ako je udaljenost između dvije detekcije limfocita bila<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

Brojevi ćelija su izračunati unutar ROI, a gustine ćelija su zasnovane na broju ćelija i površini označenog ROI.

Prostorni odnosi

Automatsko otkrivanje ćelija u WSI omogućava istraživanje prostornih odnosa između ćelija. Određena je srednja najkraća udaljenost (u regijama isključujući subkapsularnu regiju) za CD68 plus ćelije i CD3 plus, CD3 plus CD8 plus i CD20 plus ćelije u WSI panela I za obje grupe pacijenata, te između CD163 plus ćelija i CD4 plus , CD4 plus Tbet plus i CD4 plus GATA3 plus u WSI za obje grupe pacijenata.

Peritubularni opseg kapilara

Kako bi se procijenila peritubularna kapilara, na Fidžiju su analizirani nepomiješani WSI koji predstavljaju CD34 kanal (ImageJ verzija 2.0.0, SAD, makroi i dodaci: "Otvori i dupliciraj", "ASAP" ROI Reader") [30]. Pozitivni pikseli su određeni putem automatskog postavljanja praga i naknadno izraženi kao postotak ukupnog broja piksela unutar ROI.

Statistička analiza

Gustoće sljedećih staničnih populacija izračunate su u 6 sedmičnih biopsija: T-limfociti (CD3 plus), citotoksični T-limfociti (CD3 plus CD8 plus), B-limfociti (CD20 plus), makrofagi (CD68 plus, paneli I i II), polarizovani makrofagi (CD68 plus CD163 plus, CD163 plus), limfociti T-pomoćnika 1 (CD4 plus Tbet plus) i limfociti T-pomoćnika 2 (CD4 plus GATA3 plus). Spearmanovi koeficijenti korelacije su izračunati kako bi se procijenilo da li je prisutna korelacija između gustine limfocita T-pomoćnika 1 i T-pomoćnika 2 (CD4 plus Tbet plus, CD4 plus GATA3 plus) i gustine polariziranih makrofaga (ili CD68 plus CD163 plus ili polarizirani). Posmatrali smo CD68 signal (fluorofor 540 nm) u veštačkim CD4 (fluorofor 520 nm) IHC panela I. Stoga dodatno izveštavamo o gustini ćelija za CD3 plus CD8− ćelije. Da bismo procijenili razlike između grupa pacijenata s različitim IFTA ishodima, izvještavamo medijanu, minimalnu i maksimalnu gustinu ćelija po grupi. Značajne razlike u gustini ćelija i opsegu peritubularnih kapilara (definiran kao procenat CD{35}}pozitivnih piksela) između grupa procijenjene su korištenjem Mann-Whitneyjevog U testa za nezavisne uzorke. Da li pacijenti sa različitim IFTA ishodima pokazuju značajno različite omjere CD3 plus CD8-/CD3 plus CD8 plus ćelija, procijenjeno je korištenjem t-testa za nezavisne uzorke. Razlike između grupa pacijenata u prostornim odnosima CD68 plus i CD163 plus ćelija sa drugim imunim ćelijama procenjene su na značaj korišćenjem Mann-Whitneyjevog U testa za nezavisne uzorke.

Rezultati

CNN-bazirana detekcija IHC pozitivnih ćelija

U cilju primjene postojećih CNN-a, koji su prvobitno razvijeni za mikroskopiju svijetlog polja, mTSA fluorescentne slike su transformirane u umjetne slike svijetlog polja. Primjeri mTSA obojenih regija sa njihovim odgovarajućim IHC slikama umjetnog svijetlog polja uključeni su na Slici 2. Primjer IHC WSI s umjetnim svijetlim poljem prikazan je na Dodatnoj slici 4. WSI u više rezolucija mogu se otvoriti i pogledati u digitalnom prikazu slajdova softver kao što je ASAP i Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. Kao što je prikazano na slici 2, IHC WSI sa umjetnim svijetlim poljem bio je pogodan za automatsku analizu od strane CNN-a koji su prvobitno razvijeni za tradicionalni IHC WSI.

Tri CNN-a su korištena za kvantitativnu procjenu inflamatornih ćelija u 6-tjednim transplantacijskim biopsijama obojenim mTSA: za detekciju limfocita citoplazmatskim (CNN I) i nuklearnim (CNN II) IHC bojenjem i za detekciju makrofaga. Tabela 2 pokazuje performanse CNN-a (preciznost, opoziv i F1-rezultati) za setove za zadržavanje i DAB obojenih IHC WSI i IHC WSI sa umjetnim svijetlim poljem. CNN performanse su obično bile jednako dobre ili bolje od prethodno opisanog osnovnog CNN-a (sa F1-skorom od 0.78), za koji se pokazalo da ima performanse uporedive sa iskusnim ručnim posmatračima [22] . Dok je detekcija limfocita CNN II pokazala donekle smanjene performanse na slikama virtuelnog svijetlog polja u poređenju sa stvarnim DAB slikama (na kojima je CNN bio obučen), suprotno je uočeno za CNN za detekciju makrofaga.

Primjer uspješne automatske procjene dvostruke pozitivnosti uključen je na Sl. 3.

Korelacija različitih tipova ćelija

Najjača korelacija je uočena između CD4 plus GATA3 plus gustine ćelija i CD163 plus gustine ćelija (Spearmanov koeficijent 0.75, p < 0.001)="" u="" biopsija="" 6="" nedelja="" (dodatna="" slika="" 5a).="" ova="" korelacija="" je="" bila="" slabija="" između="" cd4="" plus="" tbet="" plus="" gustine="" ćelija="" i="" cd163="" plus="" gustine="" ćelija="" (spearmanov="" koeficijent="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (dopunska="" slika="" 5b)="" .="" kada="" se="" populacija="" ćelija="" ograniči="" na="" dvostruko="" pozitivne="" makrofage="" (cd68="" plus="" cd163="" plus),="" spearmanov="" koeficijent="" korelacije="" je="" bio="" 0,65="" (p="">< 0,01)="" sa="" cd4="" plus="" gata3="" plus="" ćelijama="" i="" 0,66="" (p="">< 0,01)="" sa="" cd4="" plus="" tbet="" plus="" ćelije="" (dodatna="" slika="" 5c,="" d).="" uključivanje="" subkapsularne="" regije="" u="" analize="" nije="" promijenilo="">

Poređenje upalnih infiltrata izmeđupacijenti koji napreduju do IFTA u odnosu na ne-IFTA

Pacijenti koji su napredovali do IFTA nakon 6 mjeseci pokazali su značajno veću gustinu CD163 plus ćelija u biopsijama uzetim 6 sedmica nakon transplantacije (medijan 505 ćelija/mm2) u odnosu na pacijente koji nisu napredovali do IFTA (medijan 370 ćelija/mm2; p=0 .043) (Tabela 3). Uključivanje subkapsularne regije rezultiralo je blagim smanjenjem ovog efekta (p=0.051). CD68 i CD4 su korišteni u oba panela. Stakalca obojena mTSA panelom I pokazala su više CD68 pozitivnosti nego stakalca obojena mTSA panelom II. Gustina CD4 ćelija veća je u mTSA panelu II u poređenju sa mTSA panelom I (tabela 3).

Peritubularni opseg kapilara bio je sličan u 6 sedmica biopsija DGF pacijenata sa različitim IFTA ishodima (Tabela 3), i kada se isključi (p=0.74) i kada se uključi (p=0},90) subkapsularna regija iz/u analizi.

Procjena omjera CD3 plus CD8−/CD3 plus CD8 plus ćelija pokazala je značajno veći omjer kod pacijenata sa<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

Srednja najkraća udaljenost od CD68 plus ćelija do CD3 plus , CD3 plus CD8 plus i CD20 plus ćelija (panel I) i od CD163 plus ćelija do CD4 plus, CD4 plus Tbet plus i CD4 plus GATA3 plus ćelija (panel II) jeste ne razlikuju se značajno između grupa pacijenata. Rezultati su prikazani na slici 4.

ekstrakt cistanche: poboljšava funkciju bubrega i fizičku snagu

Diskusija

U ovoj studiji razvili smo metodu za tačnu i objektivnu kvantifikaciju inflamatornih ćelijskih infiltrata u biopsijama grafta pacijenata sa transplantiranim bubregom sa DGF-om koji zaobilazi opsežno serijsko rezanje materijala za biopsiju bubrega. U tu svrhu, kombinovali smo multipleks IHC, pojačanje tiramidnog signala, multispektralno snimanje i kvantifikaciju pomoću CNN-a. Bili smo prvi koji je konvertovao popločane multispektralne podatke u jednu veštačku hromogenu sliku po ćelijskom markeru, olakšavajući WSI analizu i primenu CNN-a dizajniranih za IHC svetlih polja. Dizajnirali smo dva nova CNN-a za detekciju nuklearno obojenih limfocita i makrofaga i demonstrirali generalizaciju CNN-a razvijenih na tradicionalnom IHC WSI na IHC WSI s umjetnim svijetlim poljem. Primjenjivost naše metode je demonstrirana korištenjem kvantitativnih rezultata dobivenih od strane CNN-a za proučavanje korelacije inflamatornog mikrookruženja u 6 sedmica biopsija DGF pacijenata s razvojem IFTA 6 mjeseci nakon transplantacije.

Koristili smo komercijalno dostupan komplet za ručno bojenje za multipleks IHC za vizualizaciju imunoloških ćelija i peritubularnih kapilara u nadzornim biopsijama dobijenim 6 sedmica nakon transplantacije. Postupak multipleksnog bojenja sastojao se od više koraka ispiranja, inkubacije i ključanja tkiva i uključuje nekoliko otopina reagensa. Opsežne validacije metoda i kontrole kvaliteta su stoga od velike važnosti, te se preporučuje upotreba specifičnih antitijela koja daju dosljedan intenzitet bojenja. Uprkos izvršenim koracima validacije, obrasci bojenja nalik na makrofage uočeni su u CD4 kanalima stakalca sa mTSA panela I i II. Ciklusi bojenja CD4 i CD68 nisu izvedeni uzastopno, tako da ovaj fenomen nije mogao biti uzrokovan nepotpunim uklanjanjem CD68 antitijela (dodatna tabela 1). Iako su opisane rijetke pojave dvostruke pozitivnosti makrofaga s CD4 [31], vjerojatnije objašnjenje leži u blizini emisionih spektra fluorofora koji su korišteni za vizualizaciju CD4 (520 nm) i CD68 (540 nm), oba pokrivena pomoću FITC filter kocke fluorescentnog mikroskopa. Ovo može uzrokovati "krvarenje" jakog CD68 signala u CD4 kanal. Veliki dio ovog signala je isključen iz analize u panelu I jer su samo CD4 plus ćelije koje su bile dvostruko pozitivne na CD3 korištene za opću analizu T-pomoćnih ćelija. Ipak, odlučili smo da indirektno procenimo i opšte T-pomoćne ćelije, koristeći CD3 plus CD8− kao zamenu. Na panelu II, CD4 je korišćen isključivo u kombinaciji sa Tibetom i GATA3, ograničavajući rizik za upotrebu lažno pozitivnih detekcija.

Niža CD68 pozitivnost je uočena na panelu II u poređenju sa panelom I. Pretpostavljamo da je to rezultat sterične inhibicije tiramidnim depozitom koji pripada CD163 („efekat kišobrana“) [32]. Zamijetili smo značajno više CD163- pozitivnih ćelija u proučavanoj kohorti nego u tkivu krajnika koje je korišteno za provjeru sterične inhibicije, što možda objašnjava zašto ovaj efekat nije otkriven tokom validacije.

Multiplex IHC je kombinovan sa multispektralnim snimanjem za ispitivanje mikrookruženja tumora u nekoliko onkoloških studija, a nedavno i za analizu odbacivanja alografta bubrega [33–35]. Da bi se izdvojio doprinos svih markera u mTSA slajdovima, sekcije se snimaju Vectra sistemom ili sličnim fluorescentnim mikroskopom sa multispektralnom postavom. Nakon snimanja pregledne slike sa malim uvećanjem, Vectra sistem dijeli tkivo na pločice i automatski skenira pločice multispektralno. Ovo rezultira pločicama slike sa višestrukim spektrima koji doprinose. Budući da su spektri pojedinačnih fluorofora poznati iz prethodno snimljene spektralne "biblioteke", moguće je razložiti multipleksne pločice na više pojedinačnih pločica koje predstavljaju doprinos svakog fluorofora ("razmiješanje"). U većini studija, nepomešane slike se naknadno analiziraju komercijalnim softverom. U mnogim slučajevima, ovi programi ne podržavaju WSI analizu, imaju poteškoća u analizi grupisanih ćelija i često nisu otporni na artefakte i varijacije bojenja. Pretvaranje nepomešanih pločica u veštačke IHC WSI sa svetlim poljem, omogućilo nam je da primenimo postojeći CNN posebno dizajniran za detekciju limfocita u IHC [22] (koji se naziva CNN I za detekciju limfocita). Ova mreža može detektovati pojedinačne i grupisane limfocite sa visokom preciznošću dok je otporna na pozadinsko bojenje (slika 2, CD3). Osim toga, obučili smo dva nova CNN-a za detekciju ćelija sa obrascima nuklearnog bojenja (Tibet, GATA3) (detekcija limfocita CNN II) i za detekciju makrofaga. Poznato je da je makrofage teško otkriti zbog njihovog raspršenog uzorka bojenja. CNN za detekciju makrofaga je stoga obučen korištenjem napomena četiri različita stručnjaka. Prije izrade anotacija planirano je više sastanaka na kojima su razmatrani i ocijenjeni kriterijumi za označavanje makrofaga. To je rezultiralo mrežom koja može detektirati makrofage na reproducibilan način, a istovremeno je robusna za nespecifično bojenje (tablica 2, slika 2 i dodatna slika 6). Prema našim saznanjima, ovo je prvi algoritam za detekciju makrofaga u skeniranim histopatološkim rezovima. Testirali smo performanse sve tri mreže na test setu koji se sastojao od tradicionalnog IHC WSI (slično onima koji se koriste tokom treninga) i na sekundarnom testnom setu koji se sastojao od vještačkog IHC WSI svijetlog polja, generiranog iz multispektralno snimljenih slika. Svi CNN-ovi pokazuju vrlo dobre performanse na primarnim testnim setovima i slične F1-rezultate na sekundarnim test setovima. metrika performansi detekcije limfocita CNN I izračunata je na normalnom tkivu, artefaktima i klasterima ćelija. IHC vještačkog svijetlog polja drugog testnog seta nije sadržavao artefakte tkiva i manje klastera ćelija. Ovo može objasniti sveukupno bolje performanse ove mreže na drugom testnom setu. CNN za detekciju makrofaga je obučen i testiran na anotacijama četiri različita anotatora. Iako su posebno razmatrani kriterijumi za napomene, ipak su uočene varijacije u stilu anotacije. CNN-ova osjetljivost je stoga vjerovatno negdje u sredini krajnosti stila napomena. Napomene za drugi skup testova generirao je jedan anotator, koji se naizgled poklapa sa osjetljivošću CNN-a.

Korištenje opisanih CNN-a omogućilo nam je da istražimo upalni infiltrat s neviđenom preciznošću u jedinstvenoj seriji rigorozno odabranih ranih nadzornih biopsija transplantiranih pacijenata sa DGF-om.

Nažalost, više uzoraka je moralo biti isključeno iz analize, uglavnom zbog nedovoljnog rezidualnog tkiva nakon dijagnostičke obrade. Čak i uz ograničenu veličinu skupa podataka, pronašli smo značajno veću gustoću CD163 plus ćelija u biopsijama DGF pacijenata koji su napredovali do razvoja IFTA, što je u skladu s potencijalno profibrotskom ulogom ovih ćelija [11]. Iako je uočeni trend bio u skladu s objavljenim podacima, nismo mogli potvrditi štetan učinak ranog prisustva CD68 plus makrofaga koji je ranije zabilježen za druge grupe pacijenata sa transplantacijom bubrega [7, 36, 37]. Pronašli smo pozitivnu korelaciju između gustine CD4 plus GATA3 plus ćelija i CD163 plus ćelija, što bi moglo potvrditi doprinos T-helper 2 limfocita prema profibrotičnom mikro okruženju. Iako u ovoj studiji nisu otkriveni novi prediktivni biomarkeri za razvoj IFTA kod pacijenata sa DGF, uspješno smo razvili metode za preciznu, ponovljivu i skalabilnu procjenu inflamatornog infiltrata u rijetkom tkivu kao što su transplantacijske biopsije. Ove metode su vrijedne za buduće kvantitativne studije upale u histopatološkom tkivu.

Za ublažavanje zamora nadbubrežne žlijezde pomoću cistanchea, kliknite ovdje za više detalja

Dostupnost podataka

Zahtjevi za saradnju koji uključuju korištenje podataka predstavljenih u ovoj studiji mogu se uputiti odgovarajućem autoru (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) ili FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).

Priznanja

Zahvaljujemo Marku Gorrisu i Kieku Verrijp na njihovim savjetima o mTSA bojenju i slikanju, Merijn van Erp za razvoj prilagođene ImageJ funkcionalnosti i Sophie van den Broek, Milly van de Warenburg i Martijn Otten za stvaranje temeljne istine za mrežu detekcije makrofaga. Osim toga, zahvaljujemo Irini Scheffner na pomoći u prikupljanju kliničkih podataka.

Doprinosi autoraMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH i JAWML

dizajnirao studiju. Materijal za pacijente i kliničke podatke prikupili su i dostavili JS, WG i FF. FF je koordinirao napore u MHH. JHB, EJS i JK postigli su PAS slajd za IFTA procenat. MH je izvršio mTSA bojenje, validacije panela I i II, te snimanje i razmješavanje panela I. VV snimljeni i nepomiješani panel II. DJG je razvio metode za pretvaranje mTSA pločica u vještačko svijetlo polje WSI. MH je izvršio konverzije. ZS-C je razvio CNN za detekciju limfocita i napisao skripte za kvantifikaciju limfocita. JL je razvio CNN za detekciju makrofaga i napisao skripte za kvantifikaciju makrofaga. MH je izvršio kvantifikaciju ćelija i kapilara. NSS je izračunao udaljenosti ćelija. MH, BS, LBH i JAWML analizirali su podatke. MH je napravio brojke i izradio rad. Konačna verzija rukopisa je revidirana i odobrena od strane svih autora.

FinansiranjeOvaj rad je podržala inicijativa ERACoSysMed (projekat SysMIFTA) kao dio okvirnog programa Evropske unije Horizont 2020 koji nudi ZonMw (br. granta 9003035004), uz sufinansiranje njemačkog Ministarstva za istraživanje i obrazovanje (BMBF), grant br. . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) i FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). JAWML je primio konsultantske naknade od Philipsa (Holandija) i grantove od

ContextVision, Philips (Holandija) i Sectra (Švedska), izvan poslatog rada. JK je dobio finansijsku podršku od Holandske fondacije za bubrege (projekat DEEPGRAFT, Grant br. 17OKG23).

Usklađenost sa etičkim standardima

Sukob interesaAutori izjavljuju da nema suprotstavljenih interesa.

Etičko odobrenje i saglasnost za učešćePrikupljanje i analiza podataka obavljeni su uz informirani pristanak pacijenata i uz odobrenje etičkog odbora (br. 2765) Medicinskog fakulteta u Hanoveru.

Napomena izdavačaSpringer Nature ostaje neutralan u pogledu jurisdikcijskih zahtjeva u objavljenim mapama i institucionalnim vezama.

Otvorite pristupOvaj članak je licenciran pod Creative Commons Attribution 4.0 međunarodnom licencom, koja dozvoljava korištenje, dijeljenje, adaptaciju, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju ili formatu, pod uslovom da date odgovarajuće priznanje originalnom(ima) autoru(ima) ) i izvor, navedite vezu do Creative Commons licence i naznačite da li su promjene napravljene. Slike ili drugi materijal treće strane u ovom članku uključeni su u Creative Commons licencu za članak osim ako nije drugačije naznačeno u kreditnoj liniji za materijal. Ako materijal nije uključen u Creative Commons licencu za članak i vaša namjeravana upotreba nije dozvoljena zakonskim propisima ili premašuje dozvoljenu upotrebu, morat ćete dobiti dozvolu direktno od nositelja autorskih prava.

Reference

1. Siedlecki A, Irish W, Brennan DC. Odgođena funkcija grafta u transplantaciji bubrega. Am J Transplant. 2011;11:2279–96.

2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. Faktori rizika za dugotrajni gubitak transplantata kod primatelja bubrežnog transplanta sa hroničnom disfunkcijom alografta. Exp Clin Transplant. 2010;8:277–82.

3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh CR. Povezanost između odgođene funkcije grafta i alografta i preživljavanja pacijenata: sistematski pregled i meta-analiza. Transplantacija Nephrol Dial. 2009;24:1039–47.

4. Schröppel B, Legendre C. Odgođena funkcija transplantata bubrega: od mehanizma do translacije. Kidney Int. 2014;86:251–8.

5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B, et al. Bodovanje ukupne upale je superiornije od trenutnog Banffovog skora upale u predviđanju ishoda i stepena molekularnog poremećaja u bubrežnim alograftima. Am J Transplant. 2009;9:1859–67.

6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall

MD. Predviđanje naknadnog pada funkcije alografta bubrega iz ranih nadzornih biopsija. Am J Transplant. 2005;5:2464–72.

7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z, et al. Uloga makrofaga u razvoju fibroze humanog alografta bubrega u prvoj godini nakon transplantacije. Am J Transplant. 2014;14:2126–36.

8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M, et al. Alternativno aktivirani makrofagi u patogenezi kronične ozljede bubrežnog alografta. Pediatr Nephrol. 2015;30:1007–17.

9. Biswas SK, Mantovani A. Plastičnost makrofaga i interakcija sa podskupovima limfocita: rak kao paradigma. Nat Immunol. 2010;11:889–96.

10. Anders HJ, Ryu M. Bubrežno mikrookruženje i fenotipovi makrofaga određuju progresiju ili rješavanje bubrežne upale i fibroze. Kidney Int. 2011;80:915–25.

11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Makrofagi u transplantaciji organa. Frontiers Immunol. 2020;11:582939.

12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M, et al. Podskupine T pomoćnih 1, 2 i 17 ćelija kod pacijenata sa transplantacijom bubrega sa odgođenom funkcijom grafta. Transpl Int. 2011;24:233–42.

13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P, et al. Bodovanje limfocita koji infiltriraju tumor: od vizualne procjene do mašinskog učenja. Seminar Cancer Biol. 2018;52:151–7.

14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. Metoda zasnovana na analizi slike za kvantifikaciju parametara indeksa hroničnog oštećenja alografta. AMPS. 2006;114:440–8.

15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM, et al. Primjena algoritama vododjelnice na segmentaciju grupisanih jezgara. Citometrija. 1997;28:289–97.

16. Lai YK, Rosin PL. Efikasno kružno postavljanje praga. IEEE Trans Med Imaging. 2014;23:992–1001.

17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M, et al. Anketa o dubokom učenju u analizi medicinske slike. Med Image Anal. 2017;42:60–88.

18. Madabhushi A, Lee G. Analiza slike i mašinsko učenje u digitalnoj patologiji: izazovi i mogućnosti. Med Image Anal. 2016;33:170–5.

19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G, et al. Dijagnostička procjena algoritama dubokog učenja za otkrivanje metastaza u limfnim čvorovima kod žena s karcinomom dojke. JAMA. 2017;318:2199–210.

20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S, et al. Histopatološka procjena bubrežnog tkiva zasnovana na dubokom učenju. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1968–79.