Kvantifikacija degeneracije neurita s povećanom preciznošću i efikasnošću u in vitro modelu Parkinsonove bolesti, 1. dio

Abstract

Degeneracija neurita povezana je sa ranim stadijumima neurodegenerativnih poremećaja kao što su Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest (PD) i amiotrofična lateralna skleroza. Jedna metoda koja se obično koristi za analizu degeneracije neurita uključuje izračunavanje indeksa degeneracije (DI) nakon upotrebe alata za analizu čestica ImageJ za otkrivanje fragmenata neurita na mikrografijama kultiviranih ćelija. Međutim, DI analize su sklone nekoliko vrsta grešaka mjerenja, mogu biti dugotrajne za izvođenje i ograničene su u primjeni.

Neurodegeneracija se odnosi na promjene koje se javljaju u ili oko neurona, a koje mogu utjecati na ljudske kognitivne funkcije, inteligenciju, emocije, ponašanje itd. Mnogi ljudi misle da je neurodegeneracija usko povezana s pogoršanjem pamćenja, ali to možda nije slučaj.

Prvo, neurodegeneracija ne znači nužno da pamćenje opada s godinama. Neki ljudi mogu zadržati dobro pamćenje, pa čak i biti u stanju razumjeti ispravnost. To je zato što na pamćenje osobe utiče kombinacija faktora kao što su vježbanje, prehrana i način života.

Drugo, ljudski mozak može ponovo uspostaviti nove neuronske veze i formirati nova sjećanja, što se naziva plastičnost. Bez obzira na godine, mozak neprestano uči i stvara nova sjećanja. Stoga je neurodegeneracija jednostavno prirodna promjena u mozgu i ne znači nužno da će se pamćenje pogoršati.

Konačno, održavanje optimističkog stava također može poboljšati pamćenje osobe. Briga i stres mogu imati štetne posljedice na mozak, što dovodi do gubitka pamćenja. Pozitivan stav može unaprijediti zdravlje mozga i poboljšati pamćenje i kognitivne sposobnosti.

Ukratko, neurodegeneracija ne dovodi nužno do gubitka pamćenja, a optimističan stav prema životu može nam pomoći da održimo dobro pamćenje i kognitivne sposobnosti. Stoga bismo trebali zadržati optimističan stav i ojačati vježbanje, dijetu i upravljanje životnim stilom kako bismo održali zdravlje mozga i pamćenje. Vidi se da moramo poboljšati svoje pamćenje. Cistanche može značajno poboljšati pamćenje, jer Cistanche može regulisati i ravnotežu neurotransmitera, kao što je povećanje nivoa acetilholina i faktora rasta. Ove supstance su veoma važne za pamćenje i učenje. Osim toga, meso također može poboljšati protok krvi i potaknuti isporuku kisika, što može osigurati da mozak dobije dovoljno hrane i energije, čime se poboljšava vitalnost i izdržljivost mozga.

increase brain power

Kliknite saznajte načine za poboljšanje funkcije mozga

Ovdje opisujemo poboljšanu metodu za izvođenje DI analiza. Preciznost mjerenja je poboljšana modifikacijom kriterija odabira za detekciju fragmenata neurita, uklanjanjem artefakata slike i ne-neuritnih materijala sa slika, te optimizacijom kontrasta slike. Takva poboljšanja su implementirana u ImageJ makro koji omogućava brzu i potpuno automatiziranu DI analizu više slika. Makro karakteriše operacije za automatsko uklanjanje ćelijskih tela sa mikrofotografija, čime se proširuje primena DI analiza za upotrebu u eksperimentima koji uključuju disocirane kulture.

Predstavljamo eksperimentalne nalaze koji potvrđuju da, u poređenju sa konvencionalnom metodom, metoda poboljšane analize daje mjerenja s povećanom preciznošću i zahtijeva znatno manje vremena za izvođenje.

Nadalje, demonstriramo korisnost metode za istraživanje degeneracije neurita u modelu stanične kulture PD provođenjem eksperimenta koji otkriva efekte c-Jun N-terminalne kinaze (JNK) na degeneraciju neurita izazvanu oksidativnim stresom u ljudskim mezencefalnim stanicama. Ova poboljšana metoda analize može se koristiti za sticanje novog uvida u faktore koji leže u osnovi degeneracije neurita i progresije neurodegenerativnih poremećaja.

Ključne riječi:

Aksonalna degeneracija; indeks degeneracije; degeneracija neurita; neurodegeneracija; oksidativni stres; Parkinsonova bolest.

Izjava o značaju

Degeneracija neurita je stanični događaj povezan s ranim fazama više vrsta neurodegenerativnih poremećaja. Molekularni faktori koji regulišu degeneraciju neurita ostaju slabo shvaćeni, a postojeće metode za proučavanje degeneracije neurita imaju ograničenu primenu i efikasnost. Ovdje identificiramo modifikacije široko korištene procedure za analizu degeneracije neurita koja smanjuje grešku mjerenja.

Takva metodološka poboljšanja su ugrađena u makro ImageJ, čime je omogućena brza i potpuno automatizirana analiza degeneracije neurita korištenjem velikih skupova mikrografija. Koristeći model ćelijske kulture Parkinsonove bolesti (PD), pokazujemo da makro omogućava preciznija i efikasnija mjerenja degeneracije neurita dok proširuje prikladnost metode analize za eksperimente koji uključuju disocirane kulture.

Uvod

Degeneracija neurita je stanični proces u kojem aksoni ili dendriti prolaze kroz progresivnu disfunkciju i morfološke promjene, što dovodi do gubitka integriteta neurita. Degeneracija neurita je evolucijski konzerviran proces koji je kritičan za pravilno uspostavljanje neuronskih mreža tokom razvoja centralnog nervnog sistema (Neukomm i Freeman, 2014).

Međutim, proces se također pokreće kao odgovor na različite oblike ozljeda kao što su mehanička oštećenja ili izloženost lijekovima koji se koriste za kemoterapiju (Salvadores et al., 2017.). Nadalje, degeneracija neurita je povezana s progresijom niza neurodegenerativnih poremećaja povezanih sa starenjem, uključujući Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest (PD), Huntingtonovu bolest i amiotrofičnu lateralnu sklerozu.

Zanimljivo je da za sve takve neurodegenerativne poremećaje, akumulirani dokazi sugeriraju da je degeneracija neurita ključni događaj u ranoj fazi koji prethodi smrti neurona ili pojavi kliničkih simptoma (Serrano-Pozo et al., 2011; Adalbert i Coleman, 2013; Marangoni et al. ., 2014; Suzuki et al., 2020). Stoga, studije koje istražuju faktore koji reguliraju ovaj ćelijski proces mogu otkriti nove ciljeve za liječenje različitih neurodegenerativnih stanja.

Istraživanje degeneracije neurita posebno je važno za razumijevanje PD, bolesti koju karakterizira nakupljanje proteinskih agregata koji sadrže a-sinuklein, progresivni gubitak dopaminergičkih neurona u substantia nigra pars compacta (SNpc) i razvoj različitih motoričkih i kognitivnih simptoma. (Aarsland et al., 2017).

Dokazi iz studija postmortemologije i snimanja ljudi pokazuju da su agregati a-sinukleina zastupljeniji u neuronskim vlaknima nego u ćelijskim tijelima, a degradacija dopaminergičkih aksona se događa u većoj mjeri nego gubitak dopaminergičkih neurona u SNpc tokom perioda koji dovodi do kliničkog početka. (Tagliaferro i Burke, 2016).

Dok molekularne interakcije koje doprinose progresivnom propadanju dopaminergičkih neurita ostaju nepotpuno shvaćene, nedavni dokazi pokazuju da degeneracija neurita može biti posredovana događajima neovisnim o signalnim kaskadama koje leže u osnovi neuronske smrti (Fukui, 2016; Geden i Deshmukh, 2016). Stoga su studije koje direktno procjenjuju fiziološku osnovu degeneracije neurita kritične za razvoj terapija koje ometaju ranu progresiju PD.

improve your memory

Kao odgovor na dokaze o centralnoj ulozi degeneracije neurita u progresiji neurodegenerativnih poremećaja, razvijene su različite metode za mjerenje degeneracije neurita korištenjem mikrofotografija kultiviranih neurona. Na primjer, ustanovljeno je više različitih metoda za mjerenje degeneracije neurita pomoću softvera za otkrivanje smanjenog broja ili dužine neurita (Ofengeim et al., 2012; Johnstone et al., 2018).

Međutim, budući da takve metode ne procjenjuju direktno fragmentaciju neurita, interpretacija rezultata za određivanje utjecaja varijable na degeneraciju neurita može biti zbunjena potencijalnim efektima varijable na rast neurita. Određene istraživačke grupe su također mjerile degeneraciju neurita subjektivnim bodovanjem slika neurita na osnovu morfoloških karakteristika i stepena prividne fragmentacije (Zhai et al., 2003; Nakamura et al., 2016; Krishtal et al., 2017). Međutim, ova alternativna metoda oduzima mnogo vremena i može dovesti do greške istraživača.

Jedna metoda koja olakšava objektivno i direktno mjerenje fragmentacije neurita uključuje korištenje algoritma za analizu čestica ImageJ za mjerenje površine fragmenata neurita na mikrografijama kultiviranih ćelija. Mjerenja se koriste za izračunavanje indeksa degeneracije (DI), skale između {{0}}.0 i 1.0 koja odražava stepen degeneracije neurita (Sasaki et al., 2009).

Dok se DI analize mogu koristiti za otkrivanje različitih stupnjeva fragmentacije neurita, preciznost mjerenja je obično ograničena nekoliko izvora greške, a primjena metode prvenstveno je ograničena na kulture eksplantata ili ćelije uzgajane u odvojenim mikrofluidnim uređajima. Štaviše, DI analize oduzimaju mnogo vremena kada se ekstrapoliraju na velike skupove slika. Stoga smo nastojali da prevaziđemo ova ograničenja modifikujući proceduru DI analize kako bismo omogućili veću tačnost i efikasnost, uz proširenje primenljivosti.

U ovoj studiji identifikujemo nekoliko izvora grešaka koji se obično povezuju sa DI analizama i izveštavamo o metodološkim revizijama koje smanjuju različite oblike greške. Uključujemo proceduralna poboljšanja u makro ImageJ koji se naziva indeks automatizovane degeneracije neurita (ANDI) da potpuno automatizujemo DI analize iz velikih skupova slika. Rad ANDI Macro-a zahtijeva samo softver i datoteke koji su otvorenog koda i slobodno dostupni. Mjerenja dobivena korištenjem ANDI imaju koristi od povećane preciznosti dok značajno smanjuju vrijeme potrebno za izvođenje analiza.

Štaviše, pokazujemo kako se nova metoda analize može primijeniti za izvođenje preciznog i brzog mjerenja degeneracije neurita u modelu ćelijske kulture PD koji uključuje disocirane ćelije uzgojene bez razdvajanja. Zajedno, ova metodološka poboljšanja mogu dovesti do novog uvida u faktore koji leže u osnovi važnog ćelijskog procesa povezanog s neurodegeneracijom.

Materijali i metode

Ćelijska kultura

Kulture lundskih humanih mezencefalnih (LUHMES) ćelija uspostavljene su u stakalcima Lab Tek II sa osam jažica obloženih poli-L-ornitinom (PLO) i fibronektinom, poli-D-lizinom (PDL) i lamininom, sva četiri supstrata ili bez podloge, kako je naznačeno. Za oblaganje PLO i fibronektinom, stakalca su inkubirana preko noći na sobnoj temperaturi sa rastvorom koji sadrži 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, katalog #P3655).

Nakon ispiranja sterilnom vodom (Avantor), stakalca su inkubirana sa 2 mg/ml fibronektina (Sigma-Aldrich, katalog #F0895) 3 h na 37 stepeni. Stakalca su zatim oprana sterilnim PBS (Corning Life Sciences, katalog #21-040-CV) i ostavljena da se osuše na vazduhu. Za oblaganje PDL-om i lamininom, stakalca su inkubirana na sobnoj temperaturi sa rastvorom koji sadrži 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, katalog #P7280) i 10 mg/ml laminina (Corning, kataloški #354232).

Nakon inkubacije preko noći, stakalca su isprana sterilnim PBS-om i ostavljena da se osuše na zraku. Za premazivanje sa sve četiri podloge, navedeni postupci su izvedeni uzastopno. LUHMES ćelije (ATCC, RRID: CVCL_B056) su postavljene u obložene staklene pločice na naznačenim gustinama u medijumu za diferencijaciju koji se sastoji od DMEM/F12 (Invitrogen, kataloški #11330057) dopunjenog sa 2 mM glutamina (VWR), 1% (v/v) N-2 dodatak, 1 mg/ml tetraciklina (Sigma-Aldrich, katalog #87128-25G), 1 mM N6,29-Odibutiriladenozin cAMP (db-cAMP Enzo Life Sciences, katalog #BML-CN125-0100), i neurotrofni faktor od 2 ng/ml glijalne ćelijske linije (GDNF; R&D Systems, katalog #212-GD-010).

Osim ako je drugačije naznačeno, sve kulture su postavljene u gustinu od 115,000 ćelija po jažici. Zamjena 50% volumena medija je vršena svakih 48 sati do tretmana. Kako bi se spriječio genetski drift, za sve eksperimente korištene su stanične zalihe koje su pasirane šest ili manje puta.

Eksperimenti koji uključuju primarne kulture simpatičkih neurona odobreni su od strane Komiteta za brigu o životinjama na Univerzitetu Eastern Kentucky ili Univerziteta Virginia. Gornji cervikalni gangliji su secirani od postnatalnog dana 0–6 C56Bl/6 miševa, inkubirani na 37 stepeni u enzimskom disocijacijskom puferu i isprani medijumom za rast da se uklone proteolitički enzimi i triturirani.

Suspenzije ćelija su postavljene na pločice sa gustinom od 7000 ćelija po jažici u pločicama sa osam komora Lab Tek II. Mediji su se mijenjali na dan in vitro (DIV) 1, nakon čega je slijedila zamjena medija svaki drugi dan. Mediji su dopunjeni citozin arabinofuranozidom (Ara-C, Millipore-Sigma) na DIV1–DIV3 kako bi se spriječio rast ne-neuronskih ćelija, nakon čega je uslijedilo uklanjanje Ara-C iz medija najmanje 24 h prije tretmana kako je indicirano. Za eksperimente sprovedene na Univerzitetu Eastern Kentucky koji su uključivali tretman vodonik peroksidom, stakalca komore su obložena sa 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, katalog #P3655), 2 mg/ml fibronektina, 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, katalog #P7280) i 10 mg/ml laminina (Corning, kataloški #354232) prije upotrebe, a disocijacija je izvršena putem 30-min inkubacije u puferu koji se sastoji od DMEM (ThermoFisher, katalog br.11960- 044) koji sadrži 0,025% tripsin (Corning Life Sciences, katalog #25-053-CI) i 0,3% kolagenaza (Worthington Biochemical, katalog #LS004176).

Medij za rast za takve eksperimente sastojao se od DMEM dopunjenog sa 10% fetalnog goveđeg seruma (Invitrogen, katalog #26140-079), 2 mM L-glutamina (Corning, katalog #25-005-CI) i 40 ng/ml faktor rasta nerava (Fisher Scientific, katalog #13-257-019); 5 mM Ara-C (Sigma-Aldrich) je korišten za uklanjanje ne-neuronskih ćelija.

Za eksperimente provedene na Univerzitetu Virginia koji su uključivali povlačenje NGF-a, ćelije su postavljene na pločice komore obložene sa 100 ng/ml PDL (Millipore Sigma) i 10 mg/ml laminina (Invitrogen), a disocijacija je izvedena kroz 20-min inkubacija u puferu koji se sastoji od DMEM/F12 koji sadrži BSA (10 mg/ml, Sigma-Aldrich), kolagenazu tipa 2 (4 mg/ml, Worthington Biochemical), deoksiribonukleazu 1 (Millipore Sigma) i hijaluronidazu (Sigma-Aldrich). Medij za rast za takve eksperimente sastojao se od DMEM dopunjenog 10% fetalnog goveđeg seruma (Invitrogen), 1 U/ml penicilina/streptomicina (Invitrogen) i 45 ng/ml NGF-a (pročišćenog iz pljuvačnih žlijezda); 10 mM Ara-C je korišten za uklanjanje ne-neuronskih ćelija.

Ćelijski tretmani

Diferencirane LUHMES ćelije su bile izložene naznačenim koncentracijama {{0}}hidroksidopamina (6-OHDA; Sigma-Aldrich, kataloški #162957) ili rastvora nosača petog dana u mediju za diferencijaciju. Zalihe 6- OHDA pripremljene su u ohlađenom PBS-u koji sadrži 0,02% askorbata (Sigma-Aldrich, katalog #A5960), a alikvoti su pohranjeni u bočicama zaštićenim svjetlom pod inertnim plinom na 80 stepeni. Nakon 24 h tretmana, ćelije su fiksirane inkubacijom u PBS-u koji sadrži 4% paraformaldehida (PFA) tokom 25 minuta na sobnoj temperaturi.

Da bi se odredila uloga c-Jun N-terminalne kinaze (JNK) u degeneraciji neurita izazvanoj oksidativnim stresom, kulture su prethodno tretirane 1 h sa 10 mM SP600125 (Sigma-Aldrich, kataloški #S5567) ili otopinom nosača prije potpune zamjene medija sa medijumom koji sadrži 7,5 mM 6-OHDA, 7,5 mM 6-OHDA i 10 mM SP600125, ili rastvorima u vozilu. Zalihe SP600125 su pripremljene rastvaranjem inhibitora u sterilnom dimetilsulfoksidu (DMSO), a smrznuti alikvoti su pohranjeni u bočicama zaštićenim od svjetlosti napunjenim inertnim gasom na 20 stepeni. Tretmani su izvedeni tako da ćelije nisu bile izložene više od 0,1% DMSO.

Primarne kulture simpatičkih neurona tretirane su na DIV5. Za eksperimente koji uključuju degeneraciju neurita izazvanu vodikovim peroksidom, kulture su bile izložene 500 mM vodikovom peroksidu (Sigma-Aldrich, katalog #H1009-100ML) ili otopini nosača koja se sastoji od sterilne vode (Cytiva, katalog #SH30529.02) za 24 h.

Za eksperimente koji su uključivali povlačenje NGF-a, SCG kulture su ili dobile zamenu medijuma sa medijumom za rast ili su bile podvrgnute deprivaciji NGF-a. Kulture SCG koje su bile lišene NGF-a su tri puta isprane sa podlogom za rast bez NGF-a, a zatim inkubirane u medijumu za rast bez NGF-a 80 h bez promene medija. Nakon tretmana, ćelije su fiksirane inkubacijom u 4% PFA u PBS u trajanju od 30 minuta, nakon čega je uslijedilo uklanjanje PFA ispiranjem sa PBS.

Bojenje i fluorescentna mikroskopija

Za eksperimente sa LUHMES ćelijama, kao i eksperimente koji uključuju simpatičke neurone tretirane vodonik peroksidom, dijapozitivi sa osam jažica koji sadrže fiksne ćelije su permeabilizovani sa 0.1% Triton X-100 u PBS-u i blokirani za 1 h sa 10% normalnog kozjeg seruma u PBS-u koji sadrži 0,1% Triton X-100. Stakalca su zatim inkubirana sa primarnim antitelom specifičnim za b I tubulin (Covance; 1:1000, RRID: AB_2313773) u rastvoru za blokiranje na 4 stepena preko noći. Nakon toga, stakalca su isprana PBS-om, inkubirana sa sekundarnim antitijelom spojenim na Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_142495) tokom 90 minuta na sobnoj temperaturi i podvrgnuta dodatnim ispiranjima.

Za eksperimente koji uključuju bojenje tirozin hidroksilazom (TH), stakalca su podvrgnuta dodatnoj inkubaciji u PBS-u koji sadrži 10% normalnog kozjeg seruma, 0,1% Triton X-100, antitijelo specifično za TH (Sigma- Aldrich, 1:400, AB152) na 4 stepena preko noći. Stakalca su zatim isprana PBS-om, inkubirana sa sekundarnim antitijelom spojenim na Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_1500889) i podvrgnuta dodatnim ispiranjem PBS-om.

Nakon završetka imunoobilježavanja za b III-tubulin ili TH, stakalca su inkubirana sa 5 mg/ml 49,69-diamidino-2-fenilindola (DAPI; katalog #D9542) u PBS-u 5 minuta. Stakalca su zatim isprana PBS-om, a pokrovna stakalca su postavljena pomoću medija za montažu Fluoromount G (Southern Biotech, katalog #0100-01).

Za eksperimente koji uključuju simpatičke neurone podvrgnute povlačenju NGF-a, stakalca su blokirana 1 h inkubacijom na sobnoj temperaturi u puferu koji se sastoji od 5% normalnog kozjeg seruma (Life Technologies) i 0.0005% Triton X-100 u PBS-u, nakon čega slijedi inkubacija u rastvoru primarnog antitijela koji sadrži mišji anti-miš Tuj1 (1:1000, Covance) preko noći na 4 stepena. Nakon toga, stakalca su isprana PBS-om, inkubirana 1 h u kozjem anti-mišjem IgG Alexa Fluor 488 (1:800, Invitrogen) i 0,1 mg/ml Hoechst 33342 (Invitrogen) u puferu za blokiranje, podvrgnuta i dodatnom ispiranju PBS-om. osusiti. Stakalca su montirana sa Fluoromount-G (Southern Biotech, katalog #0100-01) i čuvana na sobnoj temperaturi.

Slajdovi koji sadrže LUHMES ćelije su vizualizirani pomoću 20 objektiva Nikon Eclipse II Ti-U sistema invertnog mikroskopa sa Lumencor Mira 4-Channel LED izvorom svjetlosti. 1280 1024-slike u pikselima su snimljene pomoću Nikon DSQi1Mc 5 MP CCD kamere i NIS Elements 3.22.15 (Build 738). Osim ako je drugačije naznačeno, sve slike s faznim kontrastom su snimljene korištenjem postavki intenziteta svjetlosti i vremena ekspozicije koje su proizvele prosječni intenzitet pozadine od 165 u 8-bitnim slikama.

Da bi se smanjilo zasjenjenje pozadine ili druge nedosljednosti, prije svake sesije mikroskopije, slika prazne jažice je snimljena i korištena za korekciju pozadine tokom snimanja LUHMES ćelija. Slajdovi koji sadrže simpatičke neurone uzgajane na Univerzitetu Eastern Kentucky ili Univerzitetu Virginia snimljeni su pomoću Zeiss LSM 800 mikroskopskog sistema ili Zeiss LSM 980 mikroskopskog sistema, respektivno. Slike su snimljene pri uvećanju od 20 i rezoluciji 1024 1024 korištenjem Zen softvera (Carl Zeiss Microscopy).

improving brain function

Analiza vitalnosti ćelija

Diferencirane LUHMES ćelijske kulture su uspostavljene na pločicama Lab Tek II sa osam jažica koje su premazane različitim supstratima kako je naznačeno. Promena medija od 50% izvršena je svakih 48 sati, a ćelije su fiksirane sa 4% PFA u PBS šestog dana diferencijacije. Stakalca koja sadrže fiksirane ćelije podvrgnuta su bojenju DAPI, a slike nuklearnog bojenja snimljene su Nikon Eclipse II Ti-U sistemom invertnog mikroskopa i Nikon DS-Fi1 5 MP CCD kamerom.

Ćelije su ocijenjene kao zdrave ili nezdrave od strane slijepog istraživača na osnovu izgleda jezgara. Ćelije sa smanjenom nuklearnom površinom ili nuklearnom fragmentacijom ocijenjene su kao nezdrave. Broj zdravih ćelija po slici je ocijenjen za najmanje pet vidnih polja po stanju u svakom eksperimentu.

DI mjerenja

Tradicionalna DI mjerenja izvedena su korištenjem paketa Fiji Is Just ImageJ (FIJI) koji sadrži ImageJ 1.52p metodom koja uključuje široko citirane parametre za DI analizu (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al., 2020; Shin i Cho, 2020). Osmobitne slike diferenciranih LUHMES ćelija sa dobro razdvojenim aksonskim traktovima podvrgnute su binarizaciji korišćenjem podrazumevanog algoritma za binarizaciju, sa binarnim opcijama konfigurisanim za proizvodnju slike sa crnim ćelijama u prvom planu i belom pozadinom.

Alat za crtanje slobodnom rukom korišćen je za ručno praćenje svih regiona slike koji sadrže tela ćelija, a svi crni pikseli su konvertovani u bele u praćenim regionima. Alat za mjerenje ImageJ primijenjen je za mjerenje ukupne crne površine binariziranih slika koje isključivo sadrže neurite. Alat za analizu čestica je zatim primijenjen korištenjem postavke veličine od 20–10,000 piksela i postavke kružnosti od 0,2–1,0 za otkrivanje fragmenata neurita. Zbirna površina svih fragmenata neurita je zatim podijeljena s ukupnom crnom površinom da bi se izračunao DI slike.

Za eksperimente koji se odnose na optimizaciju parametara veličine za identifikaciju fragmenata neurita, za sva mjerenja čestica korišteni su kriteriji kružnosti {{0}}.2–1.00. Dodatak Particle Remover (verzija 20{{10}}4/02/09), koji je razvio Wayne Rasband, je nabavljen sa https:// imagej.nih.gov/. Gdje je naznačeno, primjena dodatka Particle Remover korištenjem parametara veličine od 0-9 piksela i parametara kružnosti od 0.0-1.0 izvedena je kako bi se uklonili mali, ne-neuritni objekti iz binariziranih slika dobivenih iz mikrografa s faznim kontrastom.

Slično, parametri veličine {{0}}–4 piksela i parametri kružnosti od 0–1.0 korišćeni su za uklanjanje malih objekata sa binarizovanih slika dobijenih fluorescentnim mikrografijama koje predstavljaju b III-tubulin imunobojenje. Osim ako nije drugačije naznačeno, prije DI analize sve slike s faznim kontrastom bile su podvrgnute poboljšanju kontrasta korištenjem ImageJ za primjenu Lookup Table (LUT) s minimalno 90 i maksimalno 205.

Mjerenje umjetne fragmentacije

Kulture koje sadrže zdrave LUHMES ćelije su fiksirane sa 4% PFA na njihov šesti dan diferencijacije i imuno obeležene za b III-tubulin. Koristeći objektiv od 20, 1280 1024-mikrografi s faznim kontrastom piksela i fluorescentni mikrografi, od kojih svaki prikazuje identična vidna polja, snimljeni su iz nasumično uzorkovanih regija. Ukupno je snimljeno deset setova slika iz devet različitih kultura.

ImageJ je korišten za generiranje binariziranih kopija originalnih fazno-kontrastnih i fluorescentnih mikrografa, kao i kopija fazno-kontrastnih mikrografija koje su binarizirane nakon poboljšanja kontrasta primjenom LUT-a s minimalno 90 i maksimalno 205. Za svaki set slika, zaslijepljeni istraživač je identificirao malu, 150 150-pikselnu regiju originalnog fazno-kontrastnog mikrografa koji sadrži isključivo zdrave i netaknute neurite.

Veličina regiona i koordinate su zatim uskladištene u menadžeru regiona od interesa (ROI) ImageJ i korišćene za izvođenje DI merenja u analognim regionima binarizovanih slika iz istog skupa slika. DI mjerenja su obavljena tradicionalnom metodom sa parametrima veličine fragmenta od 20 -10,000 piksela. Budući da su sve mjerene regije sadržavale isključivo intaktne neurone, svi otkriveni fragmenti smatrani su umjetnim fragmentima.

ANDI Macro

ANDI makro je napisan koristeći ImageJ Macro jezik. Makro sadrži niz operacija koje omogućavaju korisniku da odabere staze za tri direktorija, jedan direktorij koji sadrži slike neurona imuno označenih za neuronski marker kao što je b III-tubulin, drugi direktorij koji sadrži odgovarajuće slike koje prikazuju nuklearno bojenje i treći direktorij namijenjen za spremanje datoteka rezultata. Površine fragmenata i ukupne površine neurita slika u odabranim direktorijima se zatim izračunavaju nizom ImageJ operacija. Ukratko, otvara se slika koja prikazuje nuklearno označavanje, podvrgava se poboljšanju kontrasta i binarizira. Dodatak za uklanjanje čestica koristi se za uklanjanje malih, nenuklearnih artefakata iz binarizirane slike, a binarizirana slika je podvrgnuta nizu proširenja i erozija.

Otvara se odgovarajuća slika ćelija imunoobilježenih za b III-tubulin (ili drugi neuronski marker) i podvrgava se kontrastnom poboljšanju. Binarizovana slika koja prikazuje uvećana ćelijska jezgra se zatim oduzima od slike na kojoj su ćelije imuno obeležene za b III-tubulin, čime se generiše slika koja sadrži isključivo neurite. Slika neurita se zatim binarizira i podvrgava uklanjanju čestica između 0 i 4 piksela. Površina fragmenta neurita se izračunava primjenom algoritma za analizu čestica za mjerenje čestica s kružnošću između 0.2 i 1.0 i veličinom između 5 i 10,0000 piksela. Ukupna površina neurita se izračunava primjenom alata za mjerenje za izračunavanje ukupne crne površine. Slika koja prikazuje binarizovanu oblast neurita sa istaknutim fragmentima se pohranjuje u direktorijum koji je odredio korisnik, zajedno sa .csv fajlovima koji izveštavaju o fragmentiranom neuritu i ukupnim merenjima neurita.

Pored gore navedenih operacija, nekoliko dodatnih operacija je uključeno u makro kako bi se podržala jednostavnost korištenja i ograničila greška korisnika. To uključuje funkcije koje uklanjaju informacije o mjerilu sa slika i osiguravaju da se mjerenja dobijaju u jedinicama piksela; konfigurirajte ImageJ postavke boja i binarne opcije za odgovarajuće oduzimanje i binarizaciju slike; provjeriti da odabrani direktoriji za slike bojenja b III-tubulinom i DAPI bojenja sadrže jednak broj slika; zatvorite prethodno korištene slike kako biste povećali vrijeme obrade; jasni rezultati prethodnih analiza prije izvođenja novih analiza; i spriječiti greške povezane s kreiranjem .ini datoteke od strane Windows 10.

Za eksperimente koji uključuju analizu simpatičkih neurona, ANDI makro je revidiran kako bi uključio operaciju koja predstavlja okvir za dijalog koji omogućava korisniku da kontrolira koliko puta će binarizirane slike jezgara biti proširene. Verzija ANDI-ja koja sadrži ovu reviziju nazvana je ANDI v1.1. Promjena vrijednosti u dijaloškom okviru na veći broj povećava veličinu uklanjanja some, dok promjena vrijednosti na niži broj smanjuje veličinu uklanjanja some. Zadana vrijednost je 12, što je broj proširenja korištenih za sve eksperimente koji uključuju LUHMES ćelije. Vrijednost od 16 korištena je za uklanjanje većih dijelova tijela ćelije tokom analiza simpatičkih neurona.

ANDI makro je otvorenog koda i slobodno dostupan za korištenje ili modifikaciju putem sljedeće URL adrese: https://github. com/kraemerb/kraemerlab. Tačan rad ANDI-ja je verifikovan korišćenjem više personalnih računara koji imaju Windows 10 operativni sistem. Skup slika s LUHMES ćelijskim kulturama koje pokazuju različite stupnjeve degeneracije neurita je također dostupan na gore pomenutoj web adresi i može se koristiti za istraživanje tačnog izvršavanja makroa od strane drugih tipova računara. Web adresa takođe omogućava pristup protokolu koji opisuje kako se koristi makro.

Procjene vremena

Za procjenu vremena potrebnog za ručno izvođenje DI mjerenja, mikrografije faznog kontrasta koje prikazuju LUHMES ćelije koje su tretirane otopinom nosača, 2,5 mM 6-OHDA, 5.0 mM 6-OHDA, ili 7,5 mM 6-OHDA je podvrgnuto DI bodovanju koristeći prethodno uspostavljene metode (Kraemer et al., 2014). Svaka slika je podvrgnuta poboljšanju kontrasta i binarizaciji. Alatka za ruku od ImageJ je zatim korištena za digitalno uklanjanje svih prikazanih ćelijskih tijela iz binariziranih slika. Alat za analizu čestica korišten je za mjerenje fragmenata s kružnošću između 0.2 i 1.0 i veličine između 20 i 10,000 piksela, a alat za mjerenje je korišten za određivanje ukupne površine neurita.

Vrijednosti o fragmentiranoj površini neurita i ukupnoj površini neurita prebačene su u proračunsku tabelu u Microsoft Excel-u, a matematička operacija u Excelu je korištena za izračunavanje DI rezultata. Nakon što je slika otvorena pomoću ImageJ, izmjereno je vrijeme potrebno za ručno izvođenje svake od ovih procedura. Prosječno vrijeme analize izračunato je iz ukupno 36 slika. Slike su dobijene iz devet nezavisnih preparata ćelijske kulture, a analize su obavljene korišćenjem jedne slike po uslovu tretmana iz svakog preparata ćelijske kulture. Da bi se odredila brzina DI mjerenja izvršenih korištenjem ANDI makroa, isti skupovi slika su korišteni za određivanje vremena potrebnog za otvaranje makroa u ImageJ-u, pokretanje makro operacija, prijenos podataka u Excel tabelu i izračunavanje DI.

Statistika

Kvantitativna poređenja su predstavljena kao dijagrami kutija i brkova, gdje srednja linija predstavlja medijanu, kutije se protežu do 25. i 75. percentila, a brkovi prikazuju 5. i 95. percentile. Srednje vrijednosti su statistički upoređene u GraphPad Prism 9.1.2 ponovljenim mjerenjima ANOVA sa post hoc poređenjima korištenjem Sidák korekcije. Normalnost kvantitativnih podataka testirana je pomoću Shapiro-Wilkovog testa u IBM SPSS 26.

Kada je pretpostavka normalnosti bila narušena (sl. 1C, 3D), grupna poređenja su sprovedena preko neparametarskog Friedmanovog testa sa Dunnovim testom za post hoc poređenja. Korelacijske analize su prikazane kao dijagrami raspršenja i uključuju linije koje najbolje odgovaraju. Takvi odnosi su analizirani korištenjem korelacije Pearson-ov proizvod-moment ili Spearmanovog r kada je pretpostavka normalnosti bila narušena. Normalnost reziduala za korelacione analize procenjena je vizuelnom inspekcijom odgovarajućih QQ dijagrama.

Pearsonovi koeficijenti korelacije produkt-moment su međusobno upoređeni korištenjem Steigerovog asimptotičkog z-testa (Steiger, 1980; Lee i Preacher, 2013). Nisu isključeni nikakvi izvanredni faktori. Statistička značajnost je prihvaćena na p, 0,05. P-vrijednosti su zaokružene na četiri decimale i prikazane u glavnom tekstu. Veličine efekata i intervali pouzdanosti od 95% su takođe prijavljeni za parametarske analize, sa veličinama efekata opisanim u glavnom tekstu i intervalima poverenja navedenim u tabeli 1.

supplements to boost memory