NGF modulira metabolizam holesterola i stimuliše lučenje ApoE u glijalnim ćelijama pružajući neuroprotekciju protiv oksidativnog stresa 1. deo
Aug 31, 2023
sažetak:
Kolesterol igra ključnu ulogu u mozgu, gdje aktivnost astrocita posebno regulira metabolizam. Zaista, odrasli neuroni potiskuju svoju biosintezu holesterola i uvoze ovaj sterol kroz čestice bogate ApoE izlučenim iz astrocita. Nedavni dokazi sugeriraju da faktor rasta nerava (NGF) može ispoljavati neurotrofičnu aktivnost utječući na metabolizam stanica.
Neuroni su osnovne jedinice koje čine ljudski mozak. Kroz veze između neurona, oni formiraju naš cerebralni korteks, koji nosi sva naša znanja i sjećanja. Stoga su neuroni usko povezani sa sposobnošću pamćenja.
Glavna funkcija neurona je prijenos informacija. Svaki neuron ima sinapsu, koja povezuje dendrite i aksone drugih neurona. Kada neuron primi signal, on ga prosljeđuje neuronima s kojima je povezan. Ova signalizacija, nazvana neuronski prijenos, jedan je od ključnih procesa u formiranju, skladištenju i pronalaženju memorije.
U održavanju zdravlja našeg mozga, vježbanjem možemo promovirati pravilno funkcioniranje naših neurona. Fizičke vježbe poboljšavaju cirkulaciju krvi i opskrbu mozga kisikom, čime se povećava broj i veze neurona. U isto vrijeme, različite društvene aktivnosti i aktivnosti učenja mogu formirati nove neurone u novim područjima mozga i povećati plastičnost mozga.
Kada imamo više, aktivnijih neurona, naše pamćenje postaje jače. Sinhronizacija između neurona u moždanoj kori postaje ravnomjernija, što nam olakšava pohranjivanje i dohvaćanje informacija, poboljšavajući naše kognitivne sposobnosti. Osim toga, veliki broj neurona i veza između neurona također će poboljšati našu brzinu reakcije i sposobnost donošenja odluka.
Stoga održavanje zdravih neurona i poboljšanje pamćenja idu ruku pod ruku. Možemo poboljšati svoje pamćenje promicanjem zdravih neurona fokusiranjem na fizičku vježbu, razne društvene aktivnosti i aktivnosti učenja te prehrambene navike. Radimo zajedno da podržimo zdravlje našeg mozga! Vidi se da moramo poboljšati svoje pamćenje. Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje jer je cistanche deserticola tradicionalni kineski ljekoviti materijal s mnogim jedinstvenim efektima, od kojih je jedno poboljšanje pamćenja. Djelotvornost mljevenog mesa proizlazi iz raznih aktivnih sastojaka koje sadrži, uključujući karboksilnu kiselinu, polisaharide, flavonoide, itd. Ovi sastojci mogu promovirati zdravlje mozga kroz različite kanale.
Kliknite znati načine za poboljšanje funkcije mozga
Ipak, efekat NGF-a na homeostazu glijalnog holesterola još uvek nije razjašnjen. Ovaj projekat ima za cilj da proceni da li NGF može uticati na metabolizam holesterola u glijalnim ćelijama. U373 ćelijska linija izvedena iz astrocita korištena je kao eksperimentalni model za postizanje ovog cilja. Imunoblot i ELISA analiza su pokazale da su proteini i enzimi koji pripadaju mreži metabolizma holesterola povećani nakon tretmana NGF u glijalnim ćelijama. Nadalje, NGF značajno povećava sekreciju ApoE i količinu ekstracelularnog holesterola u mediju kulture.
Eksperimenti sa zajedničkom kulturom i U373-kondicioniranim podlogama pokazali su da tretman NGF efikasno djeluje protiv citotoksičnosti posredovane rotenonom u N1E{4}} neuronskim ćelijama. Suprotno tome, neuroprotekcija posredovana tretmanom NGF je potisnuta kada su N1E-115 zajedno kultivisane sa ApoE-utišanim U373 ćelijama. Ovi podaci sugeriraju da NGF kontrolira homeostazu kolesterola u glijalnim stanicama. Što je još važnije, NGF ima neuroprotekciju protiv oksidativnog stresa, vjerovatno povezanog s indukcijom glijalne sekrecije ApoE.
Ključne riječi:
ApoE; astrocit; kolesterol; diferencijacija; faktor rasta nerava; metabolizam; neuron; reaktivne vrste kiseonika; rotenon.
1. Uvod
Mozak karakterizira najveća količina kolesterola u cijelom tijelu [1]. Izuzetna koncentracija ovog sterola u centralnom nervnom sistemu (CNS) opravdana je činjenicom da je holesterol uključen u nekoliko osnovnih bioloških procesa. Treba napomenuti da je značajna količina holesterola integrisana u plazma membrane astrocita i neurona, gde definiše odgovarajuću ćelijsku morfologiju i pravilno funkcionisanje membranskih receptora i sinaptičku neurotransmisiju [2].
Kolesterol je također neophodan za formiranje novih membrana potrebnih za izrastanje neurita, sinaptogenezu i oslobađanje neurotransmitera, što je ključno u neuronskoj diferencijaciji i sazrijevanju [3-7].
U suštini, sav holesterol u mozgu potiče iz de novo biosinteze in situ. Konkretno, krvno-moždana barijera (BBB) sprečava unos holesterola koji potiče od lipoproteina koji se transportuju kroz sistemsku cirkulaciju [8]. Iz tog razloga, nervne ćelije razvijaju uzornu regulatornu mrežu kako bi samostalno upravljale vlastitom potražnjom za ovim lipidima. Dobro prihvaćen model utvrđuje da nakon embriogeneze, tokom postnatalnog perioda, biosinteza holesterola dramatično opada u neuronima, sa pokušajem da se uštedi energija koja se koristi za stvaranje akcionih potencijala.
Shodno tome, astrociti su zadovoljili zahtjevne neuronske potrebe za holesterolom, čija sinteza postaje posebno izražena [1,9,10]. Isporuka kolesterola koji proizvode astrociti neuronima podrazumijeva elegantan mehanizam horizontalnog transporta, koji uključuje kritične proteine i čestice. Konkretno, izvoz holesterola počinje u astrocitima, gdje se neosintetizirani kolesterol učitava u čestice lipoproteina u nastajanju koje sadrže apolipoprotein E (ApoE). Nagomilani dokazi pokazuju da je lipidacija čestica bogatih ApoE posredovana transporterskom ATP-vezujućom kasetom A1 (ABCA1) [11]. Nakon toga, kada se jednom otpusti u ekstracelularni prostor, neuroni preuzimaju lipoproteine koji sadrže ApoE preko receptora posredovane endocitozom lipoproteinskog receptora niske gustine (LDLr) i LDLr-srodnog proteina 1 (LRP1) [12].
Prema ključnoj ulozi holesterola izvedenog iz astrocita u neuronskoj homeostazi, eksperimentalni nalazi su pokazali da holesterol sadržan u lipoproteinima bogatim ApoE značajno poboljšava diferencijaciju dendrita i sinaptičku funkciju [13,14]. Kondicionirani medij astrocita Huntingtonove bolesti (HD), koji luče samo skromnu količinu kolesterola vezanog za ApoE-lipoprotein, ozbiljno utiče na rast neurita i sinaptičku aktivnost u HD neuronima [15].
Neurotrofičko djelovanje čestica koje sadrže ApoE izvedene iz astrocita dodatno je podržano utjecajem nedostatka ApoE, koji značajno ometa neurogenezu odraslih u hipokampusu [16]. Preslušavanje astrocita i neurona holesterola je takođe kritično u neuroprotekciji od oksidativnog stresa. Na primjer, neki izvještaji pokazuju da ApoE ometa oksidativno oštećenje i apoptozu izazvanu izlaganjem vodikovom peroksidu [17,18].
Prema ovim zapažanjima, održavanje homeostaze holesterola u mozgu je neophodno da bi se garantovalo funkcionisanje nervnih ćelija, a metaboličke puteve koji su u osnovi regulacije ovog lipida trebalo bi fino kontrolisati kako bi se očuvala pojava nekoliko neurofizioloških procesa.
Posljednjih godina neurotrofini su se pojavili kao bitni igrači u ćelijskom metabolizmu [2,19–22]. Neurotrofini pripadaju maloj porodici faktora rasta koji imaju nepobitnu ulogu u neuronskom razvoju, preživljavanju i plastičnosti [23]. U novije vreme, ovi signalni molekuli su takođe prepoznati kao ključni modulatori ćelijskog metabolizma, uključujući metabolizam holesterola [2,22].
Eksperimentalni dokazi naglašavaju da faktor rasta nerava (NGF), prototipni član porodice neurotrofina, stimuliše biosintezu holesterola u neuronskim ćelijama i hepatocitima [24,25]. Zanimljivo je da ovi događaji uključuju, barem djelomično, neurotrofinski receptor niskog afiniteta p75NTR, koji izaziva aktivaciju proteina 2 koji vezuje sterol regulatorni element (SREBP-2) i, zauzvrat, inducira transkripciju povezanih s holesterolom. geni [25]. Aktivnost NGF-a na metabolizam holesterola nije ograničena na biosintezu, jer takođe promoviše unos holesterola povećanjem ekspresije LDLr u neuronima [26].
Uprkos ovim informacijama, znanje o mogućem doprinosu NGF-a u regulaciji homeostaze holesterola i dalje se čini posebno ograničenim. Značajno je da nedostaje sistematskih studija koje procjenjuju ulogu NGF-a u regulaciji metabolizma holesterola u astrocitnim ćelijama. S obzirom na to da je holesterol koji proizvode astrociti neophodan za garantovanje neuronske fiziologije, važno je razumeti da li može uticati na metabolizam holesterola u glijalnim ćelijama, kao i na međućelijski transport holesterola, čija je posebna regulacija imperativ za osiguranje zdravlja mozga.
Na osnovu ovog rada, cilj je istražiti prospektivno učešće NGF-a u modulaciji metabolizma holesterola u glijalnim ćelijama, kao i njegov uticaj na diferencijaciju neurona i preživljavanje neurona u uslovima oksidativnog stresa.
2. Rezultati
2.1. U373 Express Oba NGF receptora TrkA i p75NTR
NGF je prvobitno identifikovan kao faktor rasta sa specifičnim tropizmom za neuronske ćelije. Međutim, akumulirani dokazi pokazuju da ovaj neurotrofin također izaziva biološke efekte u nekoliko ne-neuronskih stanica i tkiva [22]. Aktivnost NGF-a je osigurana njegovim vezivanjem za receptor visokog afiniteta TrkAd za receptor niskog afiniteta p75NTR [2].
Stoga smo u početku utvrdili da li ćelije U373 eksprimiraju NGF receptore. Značajno je da je U373 ćelijska linija astrocitoma koja se široko koristi kao model ćelijske kulture astrocita, jer nekoliko izvještaja ukazuje da oni reprozoriraju morfološka, metabolička i funkcionalna svojstva astrocita [27–29]. Prema objavljenim podacima [30], imunofluorescentna analiza je pokazala da ćelije U373 eksprimiraju i TrkA i p75NTR na značajnim nivoima (slika S1A). Ovi rezultati su također potvrđeni Western blot analizom, sugerirajući da ćelije U373 imaju potencijal da u potpunosti reagiraju na NGF.
Pošto primena NGF-a može uticati na nivoe ekspresije njegovih receptora, potencijalno menjajući ravnotežu između signalnih puteva izazvanih TrkA i/ili p75NTR [31–33], ekspresija oba receptora je takođe proverena nakon 48 h tretmana NGF-om. Međutim, nisu primijećene promjene u količini proteina i TrkA i p75NTR nakon stimulacije neurotrofinom (slika S1B).
2.3. NGF povećava lučenje holesterola pomoću U373 u medijum kulture
Dobijeni rezultati su nas potaknuli da istražimo da li efekti posredovani NGF-om mogu odražavati modulaciju sadržaja holesterola. Bojenje uljem crvenom O izvršeno je kako bi se vizualizirali neutralni lipidi, uključujući estere holesterola. Veličina i broj lipidnih kapljica pronađenih u U373 ćelijama bili su slični onima prijavljenim za primarne astrocite [34,35].
Međutim, nisu primijećene promjene nakon tretmana NGF (Slike 2A i S2A, B). Slično, nisu otkrivene promjene u količini slobodnog holesterola, procijenjenom filipinom (Slike 2B i S2C). Nedostatak značajnih efekata na intracelularne nivoe holesterola dodatno je potvrđen enzimskim testom holesterola, koji je istakao da NGF ne menja sadržaj ukupnog holesterola, slobodnog holesterola i estera holesterola (Slika 2C).
Suprotno tome, količina holesterola (slobodnog, estera i ukupnog) je značajno povećana u medijumu kulture U373-tretiranog NGF (slika 2D). Kada se procijene u cjelini, ovi podaci ukazuju da NGF promoviše ekstruziju holesterola tako što povećava ABCA1-posredovani efluks čestica koje sadrže ApoE.
Slika 1. NGF modulira ekspresiju glavnih proteina uključenih u homeostazu holesterola u U373 ćelijama i pojačava sekreciju ApoE n u medijumu kulture U373. (A–G) Reprezentativna Western blot i denzitometrijska analiza SREBP-1, SREBP-2, HMGCR, LDLr, NPC1, ABCA1 i ApoE u U373 ćelijama tretiranim nosačem (Ctrl) i NGF (100 ng /mL) tokom 48 h. n=6 različitih eksperimenata.
Aktin i vinkulin su korišteni kao kontrole opterećenja. (H) Kvantifikacija nivoa ApoE (µg/mL) ELISA testom u medijumu kulture U373 tretiranom nosačem i NGF. n=3 različitih eksperimenata. Podaci predstavljaju srednje vrijednosti ± SD. Statistička analiza je procijenjena jednim neparnim Studetovim testom. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.
2.4. p75NTR je djelimično uključen u NGF posredovane efekte na mrežu proteina holesterola
Eksperimentalni nalazi pokazuju da NGF utiče na metabolizam holesterola u ćelijama jetre kroz aktivaciju svog receptora niskog afiniteta p75NTR [25]. Da bismo testirali da li se ovaj signalni put može sačuvati iu astrocitnim ćelijama, tretirali smo U373 sa LM11A-31, malim ligandom koji djeluje kao specifični p75NTR modulator. Ovo jedinjenje ne aktivira TrkA, ali, slično kao NGF, izaziva indukciju nizvodnih signalnih puteva p75NTR [36]. LM11A-31 oponaša povećanje HMGCR posredovano NGF-om (slika 3A).
Međutim, nisu primijećene promjene u drugim proteinima uključenim u metabolizam holesterola (Slika 3B-D), niti u količini ekstracelularnog ApoE (Slika 3E) i holesterola (ukupnog, slobodnog i estera) koji se oslobađa u medijum kulture (Slika 3F ). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da je ekspresija HMGCR izazvana NGF posredovana aktivnošću p75NTR, dok efekti na NPC1, ABCA1, sekreciju ApoE i ekstruziju holesterola vjerovatno zavise od drugih puteva transdukcije, vjerovatno uključujući TrkA.
Slika 2. Efekti NGF-a na sadržaj neutralnih lipida i holesterola. (A) U373 ćelije su tretirane vehikulom (Ctrl) ili NGF (100 ng/mL) tokom 48 h, a zatim obojene Oil Red O da bi se vizualizovao intracelularni sadržaj neutralnih lipida. n=3 različitih eksperimenata. (B) Reprezentativna slika bojenja filipinom izvršenog na U373 ćelijama tretiranim vehikulom (Ctrl) i NGF (100 ng/mL) tokom 48 h. n=3 različitih eksperimenata. (C) Kvantifikacija intracelularnog nivoa holesterola (ukupni holesterol, slobodni holesterol i esteri holesterola) u ćelijama U373 tretiranim nosačem i NGF. n=3 različitih eksperimenata. (D) Kvantifikacija holesterola (ukupni holesterol, slobodni holesterol i esteri holesterola) u medijumu kulture ćelija U373 tretiranih nosačem (Ctrl) i NGF (100 ng/mL) tokom 48 h. n=3 različitih eksperimenata. Podaci predstavljaju srednje vrijednosti ± SD. Statistička analiza je izvršena pevanjem nesparenog Studentovog t-testa. ** str<0.01.
Slika 3. Efekti modulacije p75NTR od strane LM11A-31 na metabolizam i sekreciju holesterola. (A–D) Reprezentativna Western blot i denzitometrijska analiza HMGCR, ABCA1, NPC1 i ApoE u U373 ćelijama tretiranim nosačem (Ctrl) i LM11A-31 (0.1 µM) tokom 48 sati. n=4 različitih eksperimenata.
Vinkulin je služio kao kućni protein za normalizaciju opterećenja proteinima. (E) Kvantifikacija količine ApoE (µg/mL) ELISA testom u mediju kulture iz ćelija U373 tretiranih nosačem i LM11A-31-. n=3 različitih eksperimenata. (F) Kvantifikacija holesterola (ukupni holesterol, slobodni holesterol i esteri holesterola) u medijumu kulture ćelija U373 tretiranih vehikulom (Ctrl) i LM11A-31 (0.1 µM) tokom 48 h. n=3 različitih eksperimenata. Podaci predstavljaju srednje vrijednosti ± SD. Statistička analiza je izvršena korištenjem jednog neuparenog Studetovog testa. *** p < 0.001.
For more information:1950477648nn@gmail.com
