Zaštitni efekti Cistanchea protiv H2O2/UVB-inducirane degradacije dermalnog fibroblastnog kolagena putem Hsa-microRNA-4535-posredovanog TGF/Smad signalizacije
May 06, 2023
SAŽETAK
Ova studija je imala za cilj da istraži mehanizam koji leži u osnovizaštitni efekti cistancheaprotiv oštećenja izazvanih H2O2/UVB upotrebom in vitro i in vivo modela fotooštećenja. Štaviše, identifikovali smo učešće regulacije miRNA u ovom procesu. H2O2/UVB tretirani HS68 ljudski dermalni fibroblasti i UVB-inducirani C57BL/6J goli miševi korišćeni su kao in vitro i in vivo modeli fotooštećenja. Rezultati su to pokazalicistanche tretmanublažava smanjenje vitalnosti ćelija izazvano H2O2/UVB, TGF /Smad signalno oštećenjei starenje kože. Na osnovu rezultata analiza mikroRNA niza i pretraživanja baze podataka, has-miR-4535 je identificiran kaopotencijalni kandidat miRNA koja cilja na Smad4. In vitro, cistanche tretman je aktivirao kompleks Smad2/3/4 i inhibirao ekspresiju hsa-miR-4535 u ćelijama izloženim H2O2/UVB. In vivo, lokalna primjena niskih (12 mg/kg) i visokih doza (24 mg/kg) cistanchea na dorzalnu kožu C57BL/6J golih miševa značajno je ublažila fotooštećenje kože uzrokovano UVB-om promicanjem signalizacije sinteze TGF/Smad kolagena, smanjenje epidermalne hiperplazije, formiranje bora i starenje kože, kao i inhibiranje ekspresije hsa-miR-4535. Uzeti zajedno, naši nalazi ukazuju na vezu između hsa-miR-4535 i signalizacije sinteze TGF/Smad kolagena i sugeriraju da su ovi faktori uključeni u foto-zaštitni mehanizam cistanchea u dermalnim fibroblastima protiv starenja izazvanog H2O2/UVB. Dokazi su to ukazivalicistanche sa svojstvima protiv starenjamože bitismatra se dopunom uproizvodi za njegu kože.
Cistanche proizvod za njegu kože na prodaju
UVOD
Klinički znakovi starenja ljudske kože uključuju povećane bore, opuštenost i nepravilnu pigmentaciju [1]. Proces starenja kože je složen i može se podijeliti u dvije vrste: unutrašnje starenje i ekstrinzično starenje. Unutarnje starenje uzrokovano je protokom vremena i genetskim faktorima, dok vanjsko starenje, koje se naziva i fotostarenje, uglavnom je rezultat izlaganja ultraljubičastom zračenju [2, 3]. Prethodne studije su pokazale da se obilje reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) stvaraju tokom unutrašnjeg i ekstrinzičnog starenja. Akumulacija ROS može inducirati signalizaciju protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK) i aktivirati njen nizvodni transkripcijski faktor, protein aktivator-1 (AP-1). Aktivirani AP-1 može se translocirati u jezgro i vezati se za promotorske regije matriksnih metaloproteinaza (MMP) [4]. MMP su velika grupa endopeptidaza zavisna od cinka, koja doprinosi degradaciji ekstracelularnog matriksa dermisa kože (ECM). Konkretno, MMP-1, kolagenaza, je uključena u cijepanje kolagena tipova I i III [5]. Kolagen tipovi I i III, glavne komponente ECM-a, sposobne su da pruže podršku i snagu dermisu kože, a njihovo neuređenje dovodi do karakterističnih bora i labavosti ostarjele kože [6]. Transformirajući faktor rasta-beta (TGF) je sveprisutan i moćan citokin sa tri različite izoforme, TGF 1, TGF 2 i TGF 3, koji mogu pozitivno regulisati sintezu kolagena u dermisu ljudske kože [2]. TGF iniciraju svoj signal interakcijom sa specifičnim kompleksima receptora serin/treonin kinaze na površini ćelije, uključujući tipove TGF receptora I (T RI) i II (T RII). T RI fosforilacija pokreće fosforilaciju R-Smada (Smad2 i Smad3). Aktivirani R-Smadi stupaju u interakciju sa Smad4 da regulišu njegovu translokaciju jezgra i transkripcijski aktiviraju kolagen tipove I i III kroz vezivanje za promotore Smad-vezujućih elemenata (SBE) [7, 8]. Sve više dokaza ukazuje na to da povišena generacija ROS-a, inducirana intrinzičnim ili fotostarenjem, doprinosi oštećenju TGF/Smad signalnog puta, što zauzvrat rezultira smanjenom sintezom kolagena u dermalnim fibroblastima ljudske kože [9, 10]. cistanche (3,5,7-trihidroksi flavon), prirodni član porodice flavonoida, obiluje Alpinia officinarum i propolisom. cistanche je potencijalni kandidat za liječenje ishemijskog moždanog udara, dijabetesa i različitih tipova raka [11–13]. Osim toga, cistanche posjeduje radikalno čišćenje i protuupalno djelovanje [14, 15]. Ranije smo pokazali da cistanche smanjuje upalu izazvanu H2O2-i promovira stvaranje kolagena putem receptora faktora rasta 1 sličnog insulinu (IGFI-R)/ERK1/2 signalnih puteva u HS68 ćelijama [16, 17]. Nadalje, studija je pokazala da je cistanche identificiran kao spoj Alpinia officinarum i da posjeduje inhibitorne efekte kolagenaze u ćelijama dermalnih fibroblasta [18]. Međutim, detaljniji molekularni mehanizam vezan za to kako cistanche regulira starenje dermalne kože nije poznat. MikroRNA (miRNA) su grupa malih, jednolančanih, nekodirajućih RNA molekula prosječne dužine od 22 nukleotida. Zrele miRNA se transkribiraju iz DNK sekvenci. U većini slučajeva, zrele miRNA se vezuju za 3′-netranslated regione (UTRs) ciljne mRNA kako bi utišale translaciju mRNA [19]. U ljudskoj koži, miRNA igraju ključnu ulogu u regulaciji staničnog metabolizma, raka, starenja i formiranja kolagena [20-23]. Na primjer, miR-377 može inducirati starenje dermalnih fibroblasta inhibiranjem ekspresije DNK metiltransferaze 1 (DNMT1), što kasnije dovodi do manje metilacije u p53 promotoru i starenju dermalnih fibroblasta [22]. Profil miRNA u UVB-induciranim oštećenjima u ljudskim ćelijama dermalne papile (nHDP) je prethodno istražen [24]. Međutim, kako UVB-indukovano starenje dermalnih fibroblasta kroz regulaciju miRNA, posebno u uključivanju prirodnog jedinjenja, uglavnom je nepoznato. Ova studija je imala za cilj istražiti zaštitne efekte cistanchea od oštećenja kože izazvanih H2O2/UVB, kao i ulogu mikroRNA posredovane degradacije kolagena u ovom procesu. Dalje smo imali za cilj da identifikujemo mikroRNA uključene u regulaciju sinteze kolagena.
REZULTATI
cistanche inhibira UVB/H2O2-indukovanu citotoksičnost u HS68 humanim dermalnim fibroblastima
Da bi se istražila citotoksičnost cistanchea (Slika 1A) in vitro, HS68 ćelije su tretirane različitim dozama cistanchea (0, 10, 20, 30, 40, 50 μM) za 24 h. Rezultati MTT testa pokazali su da cistanche nije bio citotoksičan za HS68 ćelije (slika 1B). Zatim smo izložili ćelije HS68 različitim dozama H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) i UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) tokom 24 sata. Tretman H2O2 i UVB-om smanjio je vitalnost ćelija na način ovisan o dozi (Slika 1C, 1D). Za procjenu citoprotektivnih svojstava cistanche slijedećeH2O2 i izloženosti UVB-u, tretirali smo HS68 ćelijurazličite koncentracije cistanša (10, 20, 30 μM)prateći H2O2- (200 μM) i UVB-inducirano (40mJ/cm²) oštećenja. H2O2 ili samo UVB tretmanznačajno smanjio (40 posto) održivost HS68ćelije. Međutim, tretman cistancheom spriječio je smrt stanicana način ovisan o koncentraciji (Slika 1E, 1F).Izražena je veća koncentracija cistanša (30 μM).allevied H2O2- i UVB-indukovana citotoksičnost.Stoga je korištena doza od 30 μM cistanchenaknadnoin vitrostudije za procjenu njegove zaštitneefekti u HS68 ćelijama.
Slika 1. cistanche inhibira UVB/H2O2-indukovanu citotoksičnost u HS68 humanim dermalnim fibroblastima. (A) Hemijska struktura cistanche. (B) Vijabilnost ćelija HS68 tretiranih različitim koncentracijama cistanche (10, 20, 30, 40, 50 µM ) tokom 24 h. (C i D) Vijabilnost ćelija HS68 izloženih različitim dozama H2O2 (100, 150, 200, 250, 300 µM) ili ozračenih UVB (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2) tokom 24 h. (E i F) Vijabilnost ćelija HS68 izloženih H2O2 (200 µM) ili ozračenih UVB (40 J/cm2) tokom 1 h, a zatim tretiranih cistanche (10, 20, 30 µM) tokom 23 h. Citoprotektivni efekti cistanchea određeni su MTT testom. Kontrolnim ćelijama je dodijeljena 100 posto održivost. Vrijednosti su prikazane kao srednja vrijednost ± SE. Prikazana je kvantifikacija rezultata (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 u odnosu na netretirane kontrolne ćelije; ##P < 0,01, ###P < 0,001 u odnosu na ćelije tretirane H2O2 ili UVB.
Cistanche atenuira H2O2-indukovanu HS68 ćelijustarenje, a ne apoptoza
Cistanche slabi UVB/H2O2-induciranu intracelularnu/mitohondrijsku proizvodnju ROS i MMP neravnotežu u HS68 ćelijama
cistanche atenuira H2O2-indukovani TGF /Smadoštećenje puta sinteze kolagena u HS68 ćelijama
Liječenje Cistancheom smanjuje povećanu ekspresiju hsa-miR-4535 izazvanu H2O2-, za koju se predviđa da cilja Smad4
Slika 4. cistanche smanjuje oštećenje puta sinteze TGF/Smad kolagena izazvano H2O2- u HS68 ćelijama. (A) HS68 ćelije su bile izložene H2O2 (200 µM) tokom 1 h, a zatim tretirane sa cistanche-om (30 µM) tokom 23 h. Ekspresija proteina komponenti puta vezanih za sintezu kolagena (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) i proteina povezanog sa degradacijom kolagena (MMP-1) detektovani su Western blot-om. (B) Ekspresija proteina p-smad2/3 i Smad4 u nuklearnim i citosolnim frakcijama otkrivena je Western blottingom. GAPDH je korišten kao kontrola opterećenja. Vrijednosti su prikazane kao srednja vrijednost ± SE. Prikazana je kvantifikacija rezultata (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0,001 vs. netretirane kontrolne ćelije; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 naspram H2O2-tretiranih ćelija. (C) Anti-p-Smad2/3, Smad4 antitijelo i FITC/PE-konjugirano sekundarno antitijelo korišteni su za detekciju ekspresije p-Smad2/3 (zeleno) i Smad4 (crveno). DAPI je označio lokaciju jezgra (plavo). Slike su snimljene pomoću fluorescentnog mikroskopa (200×).
Modulacija Smad4 od strane has-miR-4535 je uključena u sintezu kolagena u dermalnim fibroblastima ljudske kože izloženim H2O2-
i nivoi COL3A1 (slika 7F). Prekomjerna ekspresija hsa-miR-4535 (Slike 8A-8C) ili inhibicija Smad4 od strane siRNA (Slika 8D, 8E) rezultirala je smanjenom sintezom kolagena pod tretmanom cistanche nakon izlaganja H2O2. Iznenađujuće, otkrili smo da i direktno utišavanje Smad4 i tretmani sa hsa-miR-4535 oponašaju obrnutu sintezu kolagena izazvanu cistanche u HS68 ćelijama tretiranim H2O2-. Uzeti zajedno, zaključili smo da cistanche reguliše sintezu kolagena, potencijalno kroz smanjenje nivoa hsa-miR-4535 kako bi se poboljšala signalizacija Smad4 u HS68 ćelijama izloženim H2O2.
cistanche poboljšava put sinteze TGF/Smad kolagena i ublažava starenje kože, kao i inhibiciju has-miR-4535 ekspresije u HS68 ćelijama izloženim UVB-u
Lokalna primjena cistanchea ublažava hiperplaziju kože izazvanu UVB-om i degradaciju kolagena, kao i pojačava TGF/Smad signalizaciju u dorzalnoj koži C57BL6/J golih miševa
Slika 6. cistanche povećava ekspresiju Smad4 smanjenjem nivoa hsa-miR-4535. (A, B) HS68 ćelije su tretirane različitim koncentracijama H2O2 (0, 100, 20{{30}} µM ) tokom 24 h. (C, D) HS68 ćelije su bile izložene H2O2 (200 µM) 1 h, a zatim tretirane cistanche-om (30 µM) 23 h. Ekspresija hsa-miR-4535 i Smad4 detektirana je qRT-PCR. Vrijednosti su prikazane kao srednja vrijednost ± SE. Prikazana je kvantifikacija rezultata (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 u odnosu na netretirane kontrolne ćelije; ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs H2O2-tretirane ćelije.
Slika 7. Prekomjerna ekspresija ili inhibicija hsa-miR-4535 reguliše sintezu kolagena u HS68 ćelijama. (A–C) HS68 ćelije su transficirane sa hsa-miR-4535 inhibitorom (40 nM) ili inhibitorom NC (40 nM) tokom 1 h, a zatim su tretirane sa H2O2 (2 00 μM) tokom 23 h. (D–F) HS68 ćelije su transficirane sa hsa-miR-4535 mimikom (10 nM) ili imitacijom NC (10 nM) tokom 1 h, a zatim su tretirane cistancheom (30 μM) tokom 23 h. hsa-miR-4535 nivoi su detektovani qPCR-om kako bi se osigurala uspješna transfekcija. Nivoi proteina Smad4, COL1A1 i COL3A1 analizirani su Western blottingom. GAPDH je korišten kao kontrola opterećenja. Vrijednosti su prikazane kao srednja vrijednost ± SE. Prikazana je kvantifikacija rezultata (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 u odnosu na netretirane kontrolne ćelije; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 u odnosu na H2O2 ili ćelije tretirane cistanche.
Slika 8. Inhibicija Smad4 mimikom siRNA ili hsa-miR-4535 preokreće cistanche posredovano povećanje sinteze kolagena u dermalnim fibroblastima. (A–C) HS68 ćelije su transficirane sa hsa-miR-4535 mimikom (10 nM) ili imitacijom NC (10 nM) u trajanju od 1 h, nakon čega je uslijedio tretman sa cistancheom (3 {{40}} μM) i H2O2 (200 μM) tokom 23 h. Nivoi Hsa-miR-4535 (A) i Smad4 (B) detektovani su qPCR-om kako bi se osigurala uspješna transfekcija. (D–E) HS68 ćelije su transfektovane sa siRNA Smad4 (20 nM) ili siRNA NC (20 nM) tokom 1 h, nakon čega je usledio tretman sa cistanche (30 μM) i H2O2 (200 μM) tokom 23 h. Nivoi Smad4 detektovani su qPCR-om kako bi se osigurala uspješna transfekcija (D). Nivoi proteina Smad4, COL1A1 i COL3A1 analizirani su Western blottingom (C, E). GAPDH je korišten kao kontrola opterećenja. Prikazane vrijednosti su srednje vrijednosti ± SE. Prikazana je kvantifikacija rezultata (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 u odnosu na netretirane kontrolne ćelije; #P < 0,05, ##P < 0,01, u odnosu na ćelije tretirane H2O2-; $$P < 0,01, $$$P < 0,001 u odnosu na H2O2 plus ćelije tretirane cistanche
Osim toga, primjena cistanchea spasila je ekspresiju proteina TGF , p smad2/3 i Smad4 u tkivu kože oštećenom UVB (slika 12C). Naši nalazi su pokazali da bi cistanche potencijalno mogao zaštititi kožu od oštećenja izazvanih UVB zrakama inhibiranjem hsa miR-4535 kako bi se poboljšala ekspresija Smad4 za aktivaciju P-smad2/3 kako bi konačno promovirala sintezu kolagena (Slika 13)
Slika 9. cistanche pojačava put sinteze TGF/Smad kolagena i smanjuje dermalno starenje, kao i inhibiciju ekspresije hsa-miR-4535 u HS68 ćelijama izloženim UVB-u. HS68 ćelije su izložene UVB (4{29}} mJ/cm2), a zatim tretirane cistancheom (3{31}} µM) tokom 23 h. (A) Ekspresija proteina komponenti puta povezanih sa sintezom kolagena (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), proteina povezanog sa degradacijom kolagena (MMP{{20}}) i starenje- povezani markeri (p16 i p21) detektovani su Western blotom. GAPDH je korišten kao kontrola opterećenja. (B i C) RNK ekspresija hsa-miR-4535 i Smad4 detektirana je qRT-PCR. Vrijednosti su prikazane kao srednja vrijednost ± SE. Prikazana je kvantifikacija rezultata (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije; #P < 0,05, ##P < 0,01 u odnosu na ćelije izložene UVB-u.
Pitajte za više:
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950
