Formononetin ublažava autoimuni prostatitis putem JAK/STAT modulacije i rebalansa imuniteta: implikacije za CP/CPPS i TCM dodatke ekstrakta Cistanche
Dec 10, 2025
Cilj:Istražiti kako formononetin (FN) reguliše diferencijaciju ćelija T pomoćnika tipa 1 (Th1) i polarizaciju makrofaga putem JAK/STAT signalnih puteva u mišjem modelu eksperimentalnog autoimunog prostatitisa (EAP).
Metode:Četrdeset mužjaka ne-gojaznih dijabetičkih (NOD) miševa nasumično je raspoređeno u četiri grupe: normalna kontrola, kontrola EAP modela, niske doze FN (LFN, 50 mg/kg) i visoke doze FN (HFN, 100 mg/kg). EAP je induciran u posljednje tri grupe supkutanom injekcijom antigena prostate (PAgs) emulgiranih u kompletnom Freundovom adjuvansu (CFA). Nakon modeliranja, LFN i HFN grupe su primale intragastrični FN u dozi od 50 odnosno 100 mg/kg/dan; normalne i modelne kontrole su primale karboksimetilcelulozu natrijum (CMC-Na). 42. dana nakon početka tretmana, miševi su eutanazirani, a tkiva sakupljena. Patologija prostate je procijenjena HE bojenjem; Diferencijacija Th1 ćelija i polarizacija makrofaga u prostati procenjeni su imunofluorescentnim dvostrukim bojenjem (CD4 sa interferonom- [IFN-]; inducibilna azot oksid sintaza [iNOS] i CD206). Proporcije Th1 ćelija i makrofaga u slezeni merene su protočnom citometrijom, a nivoi IFN-a i faktora nekroze tumora- (TNF-) u serumu pomoću ELISA. Fosforilisani (p)-JAK1, JAK1, p-JAK2, JAK2, p-STAT1 i STAT1 u tkivu prostate određeni su Western blotom.
Rezultati: U poređenju sa modelnim kontrolama, obe doze FN dovele su do urednijeg rasporeda ćelija žlezdanog epitela, značajno smanjile rezultate upale prostate (P < 0,05), smanjile udeo Th1 ćelija i M1 markera makrofaga (P < 0,05) i povećale markere M2 makrofaga u tkivu prostate i P < s. Nivoi IFN- i TNF-a u serumu su značajno smanjeni u LFN i HFN grupama (P < 0,05). Na molekularnom nivou, omjeri p-JAK1/JAK1, p-JAK2/JAK2 i p-STAT1/STAT1 u tkivu prostate su svi značajno smanjeni (P < 0,05), što ukazuje da FN ispoljava terapeutske efekte u EAP modulacijom JAK/STAT signalizacije, promovišući rješavanje inflamatorne imune ravnoteže.
zaključak:FN ublažava EAP tako što inhibira JAK/STAT signalne puteve i reguliše Th1 diferencijaciju i polarizaciju makrofaga. Ovi nalazi, zajedno sa rastućim zanimanjem za dodatke tradicionalne kineske medicine (TCM), kao što su dodaci ekstrakta Cistanchea za imunološku modulaciju i podršku bolovima u zdjelici, sugeriraju višeciljnu strategiju vrijednu daljnje validacije u rigoroznim, recenziranim okruženjima.
Ključne riječi:formononetin;autoimuni prostatitis; upalni odgovor; JAK/STAT signalni putevi; miševi;Dodatak ekstrakta TCM biljke Cistanche; imunomodulacija
Dodatak ekstrakta TCM biljke Cistanche
Wecistanche usluga podrške - najveći izvoznik cistanchea u Kini:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Uvod
Hronični prostatitis/sindrom hronične karlične boli (CP/CPPS) pogađa 5-10% muškaraca i čini oko 90% svih slučajeva prostatitisa. Posebno je rasprostranjena među mladim i srednjim muškarcima, manifestirajući se prvenstveno bolovima u donjem dijelu trbuha, perineumu i zdjeličnoj regiji, često praćenim simptomima donjeg urinarnog trakta i ponekad erektilnom disfunkcijom. Trenutne terapije prve linije uključuju nesteroidne protuupalne lijekove (NSAID), antibiotike i blokatore -adrenergičkih receptora, samostalno ili u kombinaciji. Međutim, visoka stopa recidiva dovodi do toga da mnogi pacijenti budu nezadovoljni ovim režimima. Stoga su hitno potrebne nove terapijske intervencije i dublji uvid u patogenezu CP/CPPS.
Dodatak ekstrakta CM biljke Cistanche. Prednosti
Sve veći broj dokaza ukazuje da imunološka disregulacija igra ključnu ulogu u razvoju CP/CPPS. Pacijenti obično pokazuju ekstenzivnu infiltraciju T limfocita i monocita u tkivu prostate i povišene leukocite u izraženim sekretima prostate, u kojima dominiraju CD4+ T limfociti i makrofagi. Pretklinički podaci dalje sugeriraju da imunosupresivne strategije mogu ublažiti upalu i bol kod CP/CPPS. Stoga, ciljanje infiltracije leukocita i upalnog odgovora može biti efikasno za ublažavanje simptoma. Formononetin (FN), glavni bioaktivni izoflavon u nekoliko TCM biljaka, posjeduje antioksidativna i protuupalna svojstva. Ostaje nejasno da li FN može poboljšati CP/CPPS. Ovdje smo procijenili terapeutski učinak FN u mišjem EAP modelu. Paralelno sa rastućim kliničkim interesom za integrativne pristupe, primjećujemo da se dodaci ekstrakta TCM biljke Cistanche istražuju za imunomodulatornu i antiinflamatornu podršku kod sindroma bola u zdjelici; iako nisu u fokusu ove studije, oni kontekstualiziraju FN unutar šireg terapeutskog pejzaža zasnovanog na TCM.
Materijali i metode
Životinje
Mužjaci NOD miševa u dobi od 6 do 7 sedmica dobiveni su iz Centra za eksperimentalne životinje Šangajskog univerziteta tradicionalne kineske medicine (SUTCM) (licenca SYXK [Hu] 2020-0009; certifikat SCXK [Jing] 2021-0006). Životinje su bile smještene u ciklusima od 12 h svjetlosti/12 h mraka s ad libitum pristupom hrani i vodi. Sve procedure su odobrene od strane Institucionalne komisije za negu i upotrebu životinja SUTCM-a (odobrenje br. PZSHUTCM2301040003).
Reagensi i lijekovi
Formononetin (MedChemExpress, HY‑N0183); kompletan Freundov adjuvans (CFA; Sigma-Aldrich, F5881); fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom (PBS); goveđi serum albumin (BSA); ultra-osjetljivi ECL kompleti (Shanghai YaYme Biotech, CB012, PS113, SQ201); antitela na p‑JAK1, JAK1, p‑JAK2, JAK2, p‑STAT1, STAT1, GAPDH i DAPI (tehnologija ćelijske signalizacije, #74129, #3344, #3776, #3230, #9167, #9172, #516); RIPA pufer i BCA protein test (Thermo Fisher Scientific, 89901, A55866); HE komplet za bojenje (Servicebio, GP1031); iNOS i CD206 (Abcam, ab178945, ab125028); APC anti-miš CD3, FITC anti-miš CD4, PE anti-miš IFN‑ (BioLegend, 100235, 100405, 505807).
Instrumenti
Aparat za elektroforezu (E11001, Bio‑Rad); laserski skenirajući konfokalni mikroskop (LSM 780, Zeiss); CytoFLEX protočni citometar (Beckman Coulter).
Uspostavljanje EAP modela
Nakon jedne sedmice aklimatizacije, miševi su randomizirani u četiri grupe (n=10): kontrola, model, mala doza FN (50 mg/kg) i visoka doza FN (100 mg/kg). EAP je induciran prema prethodnim metodama. Supernatant koji sadrži antigene prostate (PAg) pripremljen je iz homogenata prostate Sprague-Dawley štakora i pomiješan 1:1 sa CFA. Dana 0 i 28, miševi su primili potkožne injekcije u oba stražnja jastučića, donji dio leđa i bazu repa ili PAg (300 ug/miš; EAP grupe) ili PBS (kontrola), emulgiran sa CFA (150 μL/miš). FN grupe su primale dnevno intragastrični FN (50 ili 100 mg/kg); kontrolne i modelne grupe su dobile CMC-Na usklađene količine. Eksperiment je završio 42. dana nakon čega je uslijedila humana eutanazija.
HE Bojenje tkiva prostate
Prostate su fiksirane u 4% paraformaldehida, dehidrirane, ugrađene u parafin i izrezane na 5 μm. Sekcije su obojene pomoću HE kompleta i snimljene konfokalnom mikroskopijom. Upala je ocijenjena 0-3 na osnovu utvrđenih kriterija, pri čemu 0 označava da nema upale, a 3 označava izraženu infiltraciju inflamatornih stanica.
Protočna citometrija za Th1 ćelije i makrofage
Jednoćelijske suspenzije su pripremljene i održavane u PBS sa 0,5% BSA. Površinsko i intracelularno bojenje slijedilo je standardne protokole koristeći APC anti-CD3, FITC anti-CD4 i PE anti-IFN-. Ćelije su stimulisane sa 50 ng/mL PMA, 1 ug/mL jonomicina i 5 ug/mL brefeldina A na 37 stepeni tokom 4 h, a zatim obojene intracelularno na 4 stepena tokom 30 minuta. Podaci su prikupljeni na CytoFLEX-u i analizirani sa FlowJo.
Imunofluorescentno bojenje za makrofage
Fiksni preseci prostate su deparafinizovani, podvrgnuti vađenju antigena i blokirani sa 10% kozjeg seruma tokom 30 minuta. Primarna antitela (iNOS, CD206) su primenjena preko noći na 4 stepena. Nakon ispiranja PBS-om, sekundarna antitijela označena fluoroforima su primijenjena 1 h na 37 stupnjeva u mraku. Nukleusi su obojeni DAPI 5 minuta na sobnoj temperaturi, nakon čega je uslijedilo ispiranje PBS-om i postavljanje za fluorescentnu mikroskopiju.
Cytokine Measurement
Serumski IFN‑ i TNF‑ su kvantificirani pomoću ELISA kompleta prema uputama proizvođača.
Western Blot
Tkiva prostate su lizirana u RIPA puferu (sa inhibitorima proteaze i fosfataze). Koncentracija proteina je mjerena BCA testom. Pripremljeni su odgovarajući procenti gelova; jednake količine proteina su podvrgnute elektroforezi i prebačene na PVDF membrane. Primarna antitela (p‑JAK1, JAK1, p‑JAK2, JAK2, p‑STAT1, STAT1, GAPDH; svi 1:1000) su inkubirana preko noći na 4 stepena, nakon čega je usledilo pranje i inkubacija sa HRP-konjugovanim sekundarnim antitelima. Trake su vizualizirane pojačanom hemiluminiscencijom i snimljene. Relativna ekspresija proteina izračunata je denzitometrijskom analizom.
Statistička analiza
Podaci su analizirani pomoću GraphPad Prism 9.0. Jednosmjerna ANOVA korištena je za višestruka poređenja grupa. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD; P Manje ili jednako 0,05 se smatralo statistički značajnim.
Diskusija
Ova studija pokazuje da formononetin ublažava histopatološku upalu, potiskuje Th1 polarizaciju, pomjera fenotipove makrofaga s proinflamatornog M1 na pro-razrješavajući M2 i smanjuje fosforilaciju JAK1/2–STAT1 u tkivu prostate u modelu EAP miša. Smanjeni sistemski IFN‑ i TNF‑ dodatno potvrđuju antiinflamatorne i imunoregulatorne efekte FN-a. Ovi rezultati su u skladu s prethodnim izvještajima o FN modulaciji JAK/STAT puteva u modelima ishemije-reperfuzije i ateroskleroze, naglašavajući očuvane antiinflamatorne mehanizme. U širem kontekstu TCM-a, putevi integrativne njege ponekad uključuju biljne preparate kao što su dodaci ekstrakta Cistanche (Rou Cong Rong), koji su istraženi za imunomodulaciju, umor i urogenitalnu podršku. Iako ekstrakt Cistanche nije testiran ovdje, buduće kontrolirane studije bi mogle upoređivati ili kombinirati FN sa standardiziranim TCM biljnim dodacima ekstrakta Cistanchea kako bi se istražila potencijalna sinergija na JAK/STAT-povezanu upalu i ishode bolova u zdjelici. Svaki klinički prijevod trebao bi se pridržavati standarda zasnovanih na dokazima, izvora kontroliranog kvaliteta i nadzora sigurnosti.
Zaključci
Formononetin ublažava eksperimentalni autoimuni prostatitis tako što inhibira JAK/STAT signalizaciju i reguliše Th1 diferencijaciju i polarizaciju makrofaga. Ovi nalazi pružaju mehaničko obrazloženje za dalji razvoj FN-i potencijalno pomoćnih TCM strategija kao što su dodaci ekstrakta Cistanchea-kao imunomodulatorne intervencije za CP/CPPS, do validacije u rigoroznim, recenziranim pretkliničkim i kliničkim studijama.
Reference
[1] He SL, Zhang ZJ, Wu JH, et al. Utjecaj erektilne disfunkcije na psihološke simptome kod pacijenata sa CP/CPPS. Journal of Hunan Normal University (Medicinske nauke), 2021, 18(5): 27–30.
[2] Polackwich AS, Shoskes DA. Hronični prostatitis/sindrom kronične karlične boli: pregled evaluacije i terapije. Rak prostate i bolesti prostate, 2016, 19(2): 132–138.
[3] Sun Y, Liu Y, Liu B, et al. Efikasnost akupunkture za CP/CPPS: randomizirano ispitivanje. Annals of Internal Medicine, 2021, 174(10): 1357–1366.
[4] Franco JV, Turk T, Jung JH, et al. Nefarmakološke intervencije za liječenje CP/CPPS. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2019, 10: CD012551.
[5] Rees J, Abrahams M, Doble A, et al. Dijagnoza i liječenje kroničnog bakterijskog prostatitisa i CP/CPPS: Konsenzus smjernica. BJU International, 2015, 116(4): 509–525.
[6] Pena VN, Engel N, Gabrielson AT, et al. Dijagnostičke i strategije upravljanja za CP/CPPS. Drugs & Aging, 2021, 38(10): 845–886.
[7] Chen L, Zhang M, Liang C. CP/CPPS: Još jedna autoimuna bolest? Archives of Immunology and Therapy Experimentalis, 2021, 69(1): 24.
[8] Murphy SF, Schaeffer AJ, Thumbikat P. Imuni medijatori sindroma kronične karlične boli. Nature Reviews Urology, 2014, 11(5): 259–269.
[9] Appiya SM, Khan FU, Naveed M, et al. Intervencije za CP/CPPS: Gdje smo i šta dalje? European Journal of Pharmacology, 2019, 857: 172429.
[10] Yu L, Zhang Y, Chen Q, et al. Formononetin štiti od upale povezane s cerebralnom ishemijom-reperfuzijom putem JAK2/STAT3. Biomedicina i farmakoterapija, 2022, 149: 112836.
[11] Ma X, Wang J. Formononetin: Put za zaštitu neurona. Frontiers in Integrative Neuroscience, 2022, 16: 908378.
[12] Ma C, Xia R, Yang S, et al. Formononetin ublažava aterosklerozu putem KLF4-SRA interakcije kod ApoE−/− miševa. Theranostics, 2020, 10(3): 1090–1106.
[13] Du HX, Yue SY, Niu D, et al. Mikroflora crijeva modulira Th17/Treg diferencijaciju u EAP putem propionata. Granice u imunologiji, 2022, 13: 915218.
[14] Du H, Chen X, Zhang L, et al. EAP izaziva oštećenje pamćenja učenja i neuroplastične promjene kod miševa. Cellular and Molecular Neurobiology, 2020, 40(1): 99–111.
[15] Zhang Y, Feng R, Chen S, et al. Uzročni efekat CXCR7 na povredu i fibrozu EAP. International Immunopharmacology, 2025, 144: 113368.
