Produžena ex-vivo normotermna perfuzija bubrega: Utjecaj sastava perfuzata
Feb 26, 2022
Abstract
Normotermna mašinska perfuzija (NMP) donorabubrezi pruža priliku za poboljšano očuvanje transplantata i objektivnu ex-vivo procjenu organa prije transplantacije. Trenutno postoji mnoštvo perfuzijskih rješenja za bubrežni NMP. Ovo istraživanje imalo je za cilj da procijeni četiri različita perfuzijska rješenja jedan pored drugog i utvrdi utjecaj različitih sastava perfuzata na izmjerenebubrežniparametri perfuzije. Porcinebubrezia krv je dobijena iz klaonice.Bubrezipodvrgnut NMP na 37˚C tokom 7 sati, sa 4 različita perfuziona rastvora (n=5 po grupi). Grupa 1 se sastojala od crvenih krvnih zrnaca (RBC) i perfuzionog rastvora zasnovanog na Williamsovom medijumu E. Grupa 2 se sastojala od eritrocita, albumina i uravnoteženog sastava elektrolita. Grupa 3 je sadržavala eritrocite i medijum baziran na britanskom kliničkom rastvoru NMP. Grupa 4 je sadržavala eritrocite i medij korišten u 24-satnim eksperimentima perfuzije. Obrasci protoka NMP za rješenja 1 i 2 bili su slični, rješenja 3 i 4 su pokazala niže, ali stabilnije brzine protoka. Reaktivne supstance tiobarbiturne kiseline bile su značajno veće u rastvoru 1 i 4 u odnosu na druge grupe. Nivoi markera povrede N-acetil- -D glukozaminidaze bili su značajno niži u rastvoru 2 u poređenju sa rastvorom 3 i 4. Ova studija ilustruje da sastav perfuzata tokom NMP značajno utiče na izmerene parametre perfuzije i povrede i samim tim utiče na interpretaciju potencijalnih markera održivosti. Potrebna su dalja istraživanja kako bi se istražili pojedinačni uticaji glavnih komponenti perfuzata kako bi se odredili najoptimalniji uslovi tokom NMP-a i na kraju razvili univerzalni kriterijumi za procenu organa.
Ključne riječi:bubrežna funkcija; bubreg; povreda bubrega; bubrezi perfuzirani; bubrežni tubularni
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI FUNKCIJU BUBREGA/BUBREGA
Uvod
Širom svijeta, standardni donatorbubregMetoda konzerviranja je statička hladnjača (SCS). Međutim, u Holandiji se hipotermična mašinska perfuzija (HMP) klinički koristi za očuvanje svih preminulih donora.bubrezi.HMP je pokazao smanjenje funkcije odgođenog grafta i poboljšanu 1- i 3- godinububrežnipreživljavanje grafta u poređenju sa očuvanjem SCS [1,2]. Kako bi se minimizirao značajan jaz između ponude i potražnje za donatorimabubrezi,suboptimalan pokojnik-donatorbubrezise sve više koriste. Zbog povećane upotrebe ovih donatora manje nego optimalnog kvalitetabubrezi,od najveće je važnosti uspostaviti još dalje optimizirane strategije za robusnu i objektivnu procjenu prije transplantacije, kao i za očuvanje. Upotreba normotermne mašinske perfuzije (NMP) za ove umrle-donorebubrezise sve više razmatra. Pretkliničke studije su pokazale da NMP može dovesti do boljeg ishoda transplantacije u poređenju sa samim SCS [3]. Kao donacija nakon srčane smrti i proširenih kriterijuma donatorabubrezisu manje tolerantni na hipotermično skladištenje u poređenju sa organima dobijenim iz standardnih kriterijuma donorskih procedura, donatorski organi marginalnog kvaliteta bi mogli imati koristi od očuvanja NMP [4,5]. Trenutno samo jedna kliničkabubrežniNMP ispitivanje se provodi u Velikoj Britaniji, s relativno kratkim periodom perfuzije prije transplantacije od 1 sata [6]. Za adekvatnu procjenu organa i reanimaciju, međutim, potrebno je duže vrijeme NMP [7]. Ova metoda pruža priliku za dijagnostiku organa prije transplantacije, poboljšano očuvanje i ex-vivo intervencije prije transplantacije radi poboljšanja posttransplantacijebubrežna funkcija. Danas su mnogi centri za transplantaciju počeli da ulažu u ovu obećavajuću normotermnu ex-vivo perfuzionu strategiju. Među ovim centrima postoji širok izbor NMP perfuzijskih rješenja. Velika heterogenost u sastavu mogla bi da ometa krajnji cilj da se definišu uniformni i robusni kriterijumi za procenu NMP. Ova heterogenost je dijelom vođena trenutno samo ograničenim razumijevanjem o tome kakva bi točna formulacija NMP rješenja trebala biti. Najvjerovatnije, normotermna perfuzijska otopina mora sadržavati nosač kisika, koloid i uravnotežen sastav elektrolita [8]. Sastav će također ovisiti o trajanju NMP-a, jer će duži periodi perfuzije zahtijevati optimizirane kompozicije perfuzata kako bi se održalo stabilno okruženje gotovo fiziološko tokom cijele perfuzije. U ovoj studiji su procijenjena četiri različita normotermna perfuzijska rješenja, tri uobičajeno korištena postojeća rješenja na koja nisu napravljene izmjene i jedno novo dizajnirano rješenje. Proveli smo produženi (7h) NMP kod svinjabubregmodel donacije. Naš cilj je bio analizirati u kojoj mjeri različite kompozicije perfuzata u cjelini utiču na ravnotežu elektrolita,bubrežna funkcija, i markeri ozljeda mjereni tokom NMP.
materijali i metode
Vađenje bubrega i krviOdrživa svinjabubreziod domaćih domaćih svinja (krmače; tip Topigs 20) i krv je dobijena iz lokalne klaonice (Kroon Vlees, Groningen, Holandija). Svinje su omamljene dvovremenim električnim šokom i naknadno iskrvavljene prema uobičajenim klaoničkim procedurama. Sakupljena je autologna krv i dodat je heparin (5000 internacionalnih jedinica po ml (IU), LEO1 pharma, Ballerup, Danska) kako bi se spriječilo zgrušavanje krvi.Bubrezisu brzo izvučeni nakon cirkulatorne smrti svinje, što je rezultiralo otprilike 20 minuta tople ishemije (WI) prije hladnog konzerviranja. Nakon perioda WI,bubrezisu isprani i ohlađeni sa 180 ml natrijum hlorida (NaCl) (0,9 procenata) (Baxter BV, Utrecht, Holandija) na 4˚C, što je označilo početak hladne ishemije (CI).Bubrezisu secirane bez viška masnog tkiva i otkriveni su krvni sudovi. Sljedeći,bubrezibili povezani sa aBubregAssist Transport HMP uređaj (Organ Assist, Groningen, Nizozemska). Ova HMP mašina očuvanabubrezisa hladnom (0–4˚C) UW mašinskom perfuzionom otopinom (Belzer UW-MP otopina, Bridge to Life Ltd, Columbia, SC) u trajanju od 2-4 sata koristeći oksigenirani pulsirajući HMP pri srednjem arterijskom tlaku od 25 mmHg . Heparinizirana autologna krv je osiromašena leukocitnim filterom (BioR 02 plus BS PF, Fresenius Kabi, Zeist, Nizozemska), centrifugirana, a zatim je uklonjena supernatantna plazma.
Perfuzijska rješenjaDefinirane su četiri eksperimentalne grupe (n=5 po grupi), sa različitim NMP rješenjem u svakoj grupi. Prijebubreguzimanja, određivan je perfuzioni rastvor koji će se koristiti tokom eksperimenta. Sva četiri perfuziona rastvora sadržavala su autologna crvena krvna zrnca svinja (RBC), ali je sastav svakog NMP medijuma bio različit (Tablica 1). U našoj laboratoriji stečeno je veliko iskustvo sa perfuzijom svinjabubrezii jetre glodara koristeći Williamsov Medium E (WME) (Life Technologies Ltd, Bleiswijk, Nizozemska) [9–11]. Ovaj perfuzat ne sadrži vazodilatator i odlučili smo da ga ne pravimo
izmjene početnog rješenja. Perfuzioni rastvor grupe 2 je razvijen od strane naše grupe da sadrži elektrolite u fiziološkim koncentracijama i vrši fiziološki koloidno osmotski pritisak na glomerularnu membranu. Perfuzat grupe 3 bio je klinički korišteni britanski NMP rastvor bez koloida, koji se trenutno koristi u randomiziranom kontroliranom ispitivanju u kojem se uspoređuje 1h NMP sa SCS humanog preminulog donora.bubreziu Ujedinjenom Kraljevstvu [12]. Što se tiče grupe 4, ovo rješenje je uspješno korišteno u studiji autotransplantacije svinja u Aarhusu, Danska [13]. Zasnovan je na perfuzatu koji su dizajnirali Weissenbacher et al., koji su perfuzionirali odbačene ljudskebubrezitokom 24 sata [7]. Pored gore navedenih sastojaka, perfuzat u grupi 1 je dopunjen glukozom kada je koncentracija pala ispod 4 mmol/l. Proizvedeni urin je bio
po satu zamijenjen sa WME. U grupi 2 infuzijska pumpa sa špricem je ubrizgala ukupnu parenteralnu ishranu (SmofKabiven) (Fresenius Kabi Nederland BV, Zeist, Holandija) brzinom od 0,5 ml/ruci insulina (10{{1{ {12}}}}0 IU, takođe Novo Nordisk A/S) brzinom od 0,005 ml/h. Nakon svakog sata, proizvodnja urina je recirkulacija u grupi 2 kako bi se održala stabilna ravnoteža elektrolita. U trećoj grupi, 170 ml čistih eritrocita pomiješano je sa 120 ml fiziološkog rastvora, adenina, glukoze i manitola (SAG-M), što je dovelo do hematokrita od 0,5–0,65 l/l, da bi se imitirao sastav tipične klinički korištene jedinice RBC (koji se koristi u britanskom kliničkom NMP perfuzatu). Tokom ovih eksperimenata korišćene su tri infuzione pumpe sa štrcaljkom za infuziju Flolana (GlaxoSmithKline BV, Zeist, Holandija) brzinom od 5 ml/h, glukoze 5 procenata (Baxter BV, Utreht, Holandija) brzinom od 4 ml/ h i mješavina od 150 ml Synthamin-17 10 posto (Baxter Healthcare Ltd., Norfolk, Ujedinjeno Kraljevstvo), 6 ml natrijum bikarbonata (NaHCO 3 ) 8,4 posto (B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Njemačka) , 30 IU insulina (1000 IU, Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Danska) i Cernevit (Baxter BV, Utrecht, Holandija) brzinom od 20 ml/h, prema protokolu trenutne kliničke studije u Velikoj Britaniji. Proizvodnja urina je svaki sat zamijenjena Ringersovim laktatom (također Baxter BV). Tokom NMP-a četvrte grupe, infuzijska pumpa šprica je ubrizgala verapamil (2,5 mg/ml, takođe Sandoz BV) rastvoren u fiziološkom rastvoru brzinom od 0,3 ml/h. Proizvodnja urina je također recirkulacija u ovoj grupi nakon svakog sata kako bi se održala stabilna ravnoteža elektrolita. Volumen uzoraka u svakoj grupi korigovan je različitim komponentama. Volumen u grupi 1 zamijenjen je WME, u grupi 2 perfuzionim medijumom, u grupi 3 Ringers laktatom i u grupi 4 Sterofundinom1 (takođe B. Braun).
NMP podešavanjePostavka perfuzije bila je identična onoj koju je prethodno opisala naša grupa [14]. Thebubreziperfundirani su na asinusoidni pulsirajući način, sa frekvencijom od 60 impulsa u minuti, ata set, bez regulacije povratne sprege, tlakom od 110/70 mmHg i oksigenirani sa 95 posto kisika/5 posto ugljičnog dioksida (karbogena) tokom svih eksperimenata. Ovaj suprafiziološki nivo kiseonika je standardna procedura u sva četiri postojeća protokola. Perfuzija je kontrolisana elektronskim interfejsom i softverom za kontrolu po meri (LabView Software, National Instruments Netherlands BV, Woerden, Holandija). Šematski prikaz tadanomotermnog perfuzijskog kola prikazan je na slici 1.
Analiza urina i perfuzataSvaki sat uzimani su uzorci arterijskog perfuzata i urina. U grupama 2 i 4, u kojima je urin bio recirkuliran, uzorci perfuzata su uzeti prije recirkulacije urina. Uzorci gasa arterijske krvi perfuzata analizirani su nakon 0, 240 i 420 minuta NMP. Perfuzijski parametri su dokumentovani svakih pola sata. Standardnim kliničkim testovima u perfuzatu mjerene su koncentracije laktat dehidrogenaze (LDH) i aspartat aminotransferaze (ASAT), natrijuma, kalija, glukoze i kreatinina. Klirens kreatinina, frakciono izlučivanje kreatinina na 100 g (FE kreatinin/100 g) i frakciono izlučivanje natrijuma (FENa plus ) izračunati su da bi se odredilobubrežna funkcija. Jednačine se mogu naći u S1 dodatku. Obje N-acetil- -D glukozaminidaze (NAG) (takođe Sigma-Aldrich), kao markerbubrežnitubularna disfunkcija/povreda i tiobarbiturna kiselina reaktivne supstance (TBARS) (lipidna peroksidacija-malondialdehid (MDA)) komplet za testiranje, Sigma-Aldrich BV, Zwijndrecht, Holandija), da bi se kvantifikovao oksidativni stres, izmereni su u perfuzatu.
HistologijaBiopsija gornje iglekorteks bubregaje snimljen prije početka NMP-a. Na kraju svakog eksperimenta, sakupljeni su uzorci hirurškog tkiva iz gornjeg korteksa. Ove biopsije su bile
Statistička analizaAnaliza podataka je izvršena korišćenjem GraphPad Prism Version 8.3.1 (GraphPad software Inc., La Jolla, CA, USA). Za sve kontinuirane longitudinalno mjerene varijable, kao što su ASAT i LDH, izračunata je površina ispod krive (AUC). Jednosmjerna ANOVA sa višestrukim poređenjima korištena je za poređenje vrijednosti AUC između grupa ako su podaci normalno raspoređeni (Shapiro Wilk test) i imaju homogenost varijansi (testirano pomoću Bartlettovog testa). Ako podaci nisu ispunili ove pretpostavke, korišten je Kruskal-Wallisov test sa Dunnovim testom višestrukih poređenja. Za dvostrane p-vrijednosti od 0.05 ili manje se smatralo da ukazuju na statističku značajnost.
Rezultati
Perfuzioni parametriU tabeli 2, podaci (srednja, minimalna i maksimalna) o toploj i hladnoj ishemiji, trajanju i težini HMP prije starta i nakon NMP, kao i delta težine (razlika u težini na t=420 u odnosu na t {{2 }}). Delta težina je bila značajno veća u grupi 1 u poređenju sa grupom 2 (p=0.041). Nije bilo drugih značajnih razlika između vrijednosti svih eksperimentalnih grupa. Tokom NMPbubrežniarterijski protok se povećao tokom prvih 60 minuta reperfuzije u grupi 1 i 2. Nakon 60 minuta protok je obično počeo da se smanjuje. Perfuzije u grupi 3 i 4 počele su s nižim vrijednostima protoka, ali su pokazale konstantniji protok kroz NMP. Krajnje vrijednosti nakon 7 sati NMP bile su približno 75 ml/min/100g u svim grupama (slika 2).
Analiza urina i perfuzataPojedinačni podaci o funkcionalnim parametrima i parametrima ozljede tijekom perfuzije mogu se naći u Tablici 3.Bubrežna funkcija.Grupa 3 je pokazala najveći nivo izlučivanja urina (slika 3). Kumulativna diureza u grupi 3 bila je značajno veća u poređenju sa grupom 1 (p=0.003), grupom 2 (p < 0,001)="" i="" grupom="" 4="" (p="0.008)." neki="">bubreziu grupi 2 nije proizvodio urin u t=180 i t=300, što je dovelo do nižih prosječnih nivoa kumulativne proizvodnje urina u t=360 i t=420. Nivoi natrijuma i kalijuma su se značajno razlikovali između grupa (slika 4). Nivoi na t=0 ukazuju na početne početne vrijednosti pri perfuziji. Posebno se visoko pokazala grupa 3
Tokom perfuzije, pH u grupi 3 je opao bez stabilizacije, dok su druge grupe dostigle uravnoteženiji nivo od približno 7,4 nakon 7 sati NMP (slika 5). Klirens kreatinina bio je nizak u svim grupama (slike 6A i 6B). Ipak, bio je značajno veći nego u grupi 3 u poređenju sa grupom 2 (p=0.039). Frakciono izlučivanje kreatinina na 100g (slike 6C i 6D) bilo je značajno veće u grupi 3 u poređenju sa grupom 1 (p=0.026), grupom 2 (p=0.017) i grupom 4 ( p=0.045). FENa plus je bio visok u svim grupama, što ukazuje da je tubularna funkcija ozbiljno narušena (slike 6E i 6F) kod ovih ishemijski oštećenihbubrezi. FENa plus u grupi 3 bio je značajno veći u poređenju sa grupom 2 (p=0.037) i grupom 4 (p=0.019). Sve ostale grupe nisu se značajno razlikovale.Povreda bubrega.Nivoi ASAT tokom NMP su analizirani (slike 7A i 7B) kao marker za opštu ćelijsku povredu. Srednja vrijednost AUC je određena za svaku grupu. Nivoi u grupi 4 bili su značajno viši u poređenju sa grupom 1 (p=0.022) i grupom 2 (p=0.011). Nivoi LDH su također izmjereni u perfuzatu kao opći marker ozljede (slike 7C i 7D). Izračunat je AUC koji je pokazao najniže nivoe LDH u grupama 1 i 2. Grupa 2 je bila značajno niža u poređenju sa grupom 4 (p=0.020). Grupa 1 je pokazala značajno niže nivoe u poređenju sa grupom 4 (p=0.022). Nivoi NAG su bili značajno viši u grupi 3 u poređenju sa grupom 1 (p=0.043) i grupom 2 (p=0}.006) (slike 8A i 8B). TBARS, koncentracija malondialdehida (MDA), izmjerena je u sve četiri grupe kao marker za lipidnu peroksidaciju (slike 8C i 8D). Nivoi MDA su bili značajno viši u grupi 1 u poređenju sa grupom 2 (p=0.003) i grupom 3 (p < 0,001).="" grupa="" 2="" je="" pokazala="" značajno="" niže="" nivoe="" mda="" u="" poređenju="" sa="" grupom="" 4="" (p="0.006)." grupa="" 3="" je="" pokazala="" značajno="" niže="" nivoe="" u="" poređenju="" sa="" grupom="" 4=""><>
Histologija
Tačkasti grafikoni na slici 9 pokazujububrežnitubularna oštećenja/ATN, tubularna dilatacija i glomerularna dilatacija rezultati prije početka NMP (t {{0}}) i nakon 7 sati NMP (t=420). Početne vrijednosti histološke nekroze i tubularne dilatacije bile su uporedive između grupa, sa samo marginalnim razlikama u krajnjim rezultatima. Dilatacija glomerula u t=420 bila je značajno niža u grupi 2 u poređenju sa druge 3 grupe. Histološke brojke po grupi mogu se naći na S1 slici. Bax i Bcl{8}} indukcija puta, indikatori za ekspresiju pro- i anti-apoptotičkog gena, respektivno, oba su pokazala pomak u nivoima krajnje tačke NMP u poređenju sa nivoima na t=0 (slika 10). Ekspresija Delta Bax gena (razlika između t=0 i t=420) je izračunata u svim grupama i bila je značajno veća u grupi 1 u poređenju sa grupom 2 (p=0.046), grupa 3 (p < 0,001)="" i="" grupa="" 4="" (p="0.003)." ekspresija="" bcl-2="" se="" smanjila="" u="" svim="" grupama="" nakon="" 7="" sati="" perfuzije="" bez="" značajnih="" razlika="" između="">
Diskusija
Opšti interes zabubrežniNormotermne ex-vivo tehnike perfuzije mašina su u porastu, ali klinički dokazi ostaju ograničeni sa samo jednim kliničkim NMP ispitivanjem u toku. Sprovedene su opsežne pretkliničke studije koje su istraživale potencijal NMP. Mnoštvo različitihbubrežninormotermni perfuzati postoje među različitim istraživačkim grupama. Međutim, pitanje je u kojoj meri sastav perfuzata utičebubrežna funkcijai kako to utiče na tumačenje potencijalnih markera održivosti ostaje. Stoga je ova studija procijenila utjecaj četiri različita normotermna ex-vivo perfuzijska rješenja jedan pored drugog nabubrežna funkcijaipovreda bubregatokom produženog NMP-a upotrebom svinjabubregmodel donacije nakon cirkulatorne smrti.
proceniti izolovanobubrežna funkcijaprije transplantacije. Hosgood i kolege pružili su prve kliničke dokaze o izvodljivosti procjene održivosti prije transplantacije tokombubrežniNMP. Njihovo perfuziono rješenje je trenutno najšire korišteno tokom NMP-a i prvobitno je razvijeno za procjenububrežna funkcijaprije transplantacije u roku od 1-2 sata [16].Bubreziperfuzirani ovim rastvorom obično pokazuju visoku proizvodnju urina [17]. Zaista, najveća proizvodnja urina uočena je u grupi 3, koja se zasniva na ovom kliničkom UK perfuzatu, što je dovelo do više nego potpunog urinom izlučivanja cirkulirajućeg volumena perfuzata u ovoj grupi tokom 7 sati NMP. Kontinuirani gubitak volumena cirkulirajuće perfuzijske tekućine morao je biti nadoknađen povremenim dodavanjem sličnih volumena Ringerovog laktata, u skladu s kliničkim protokolom za ovaj perfuzijski rastvor. U našoj studiji, to je rezultiralo značajnim promjenama sastava elektrolita i pH vrijednosti, budući da urin nije cirkulirao. Ova visoka proizvodnja urina najvjerovatnije se može pripisati odsustvu koloida samo u ovoj perfuzionoj otopini. Sve tri druge grupe perfuzione otopine su sadržavale znatnu količinu albumina. U intravaskularnom prostoru albumin je glavna komponenta koja održava normalan koloidno osmotski tlak [18]. Ravnoteža između hidrostatskog pritiska i koloidno osmotskog pritiska rezultira fiziološkom brzinom ultrafiltracije preko glomerularne membrane [19]. Kaths et al. pokazali su da proizvodnja urina tokom NMP nije u korelaciji sa funkcijom nakon transplantacije. Pretpostavili su da na proizvodnju urina u velikoj mjeri utiče sastav perfuzata, posebno onkotski pritisak i osmolarnost, što je u skladu s našim rezultatima [20].
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREZU/BUBREZU
Glavni odgovorni organ za regulaciju elektrolita jebubregali postoje dokazi da jebubregsama po sebi takođe ima koristi od ravnoteže elektrolita. Utvrđeno je da neravnoteža kalija, a posebno hipokalemija, može dovesti do raznih promjena ububrežna funkcijauključujući poremećeni tubularni transport, poremećenu sposobnost koncentracije urina, promenjenu reapsorpciju natrijuma i intracelularnu acidozu [21–23]. Da bi objasnili neizbježan gubitak važnih perfuznih elektrolita u urinu, Weissenbacher et al. predložio upotrebu recirkulacije urina tokom NMP. Pokazali su da olakšava pravilno održavanje volumena perfuzata i homeostaze kod odbačenih ljudibubrezi, čak i nakon 24 sata NMP [7]. Izmjerena koncentracija albumina u perfuzatu opadala je tokom vremena tokom perfuzije. Ovo smanjenje je najvjerovatnije uzrokovano prianjanjem albumina na plastičnu cijev perfuzijskog kola i samo se mala količina može pripisati gubitku u proizvedenom urinu, što je također uočeno u drugim NMP studijama [24]. Ovaj gubitak albumina u urinu može se objasniti oštećenjem endotelnih ćelija izazvanim toplom ishemijom sa poremećajem filterskih dijafragmi što dovodi do proteinurije, što je u skladu sa našim uočenim nivoima albuminurije tokom NMP [25].
Ne možemo u potpunosti objasniti mehanizam razlika među grupama koje smo uočilibubregdebljanje tokom NMP. Histološki pregled nije bio presudan o mogućim područjima nastanka edema. Potrebno je dalje istraživanje kako bi se razjasnili potencijalno multifaktorski mehanizmi povećanja tjelesne težine u odnosu na korišteni perfuzijski rastvor. Mjereni su različiti parametri perfuzije, gdjebubrežnitok je pokazao najupečatljivije razlike.Renalprotok u grupama 3 i 4 održavao je najstabilnije nivoe tokom 7-satnog NMP perioda. Rastvorima u ovim grupama dodavan je vazodilatator, dok rastvori u prve dve grupe nisu. Endogeni vazodilatatori potiču relaksaciju glatkih mišića krvnih sudova i time regulišu regionalni protok krvi [26]. Kako grupe 1 i 2 nisu bile dopunjene vazodilatatorima, vazospazmi su mogli dovesti do smanjenjabubrežniarterijski protok. Štaviše, postoje dokazi da se medularni i kortikalni protok mogu regulisati pojedinačno [27,28]. Preliminarni neobjavljeni podaci naše grupe, zasnovani na preciznim i kvantitativnim funkcionalnim MRI (ASL) mjerenjima protoka tokom NMP, snažno podržavaju ovaj mehanizam. U tim eksperimentima,bubrežnitok tokom prvog sata NMP je uglavnom medularni, koji prelazi u kortikalni tok nakon više od sat vremena perfuzije. Ova regionalna preraspodjela protoka može objasniti vrhunac uočen u perfuzijama grupa 1 i 2, vjerovatno zbog medularnog ranžiranja tokom prvog sata. Dodavanje vazodilatatora na početku NMP-a moglo bi poboljšati pretežno kortikalnu mikroperfuziju odmah na početku NMP-a, što rezultira stabilnijim protokom kao što je uočeno u grupi 3 i 4. Stoga, ako je stabilan obrazac protoka i moguće fiziološki pretežno kortikalni perfuzija je poželjna tokom NMP-a, može biti preporučljivo dodati vazodilatator u perfuzioni rastvor. Alternativno, ponovljeno pranje eritrocita prije perfuzije može smanjitibubrežnivazokonstrikcija smanjenjem vazokonstriktivne aktivnosti eritrocita [29].
Funkcija bubregatokom NMP je bio izrazito oštećen kod svih svinjabubrezi, vjerovatno zbog inicijalnog toplog ishemijskog oštećenja i nedostatka fizioloških humoralnih regulatornih mehanizama, poput onih koje pokreću anti-diuretički hormon i aldosteron. Klirens kreatinina je bio nizak i visoke vrijednosti FENa plus su uočene u svim grupama. Nagli porast FENa plus nakon 3 sata NMP u grupi 2 mogao je biti rezultat izostanka proizvodnje urina u nekolikobubrezina t=240 i t=300, dok je na kraju perfuzijebubreziponovo počeo proizvoditi mokraću. Povišene vrijednosti FENa plus su vjerovatno rezultat tubularne nekroze, što je također prijavljeno u prethodnim studijama [30,31]. Osim toga, in vivo klirens kreatinina i nivoi FENa plus su u velikoj mjeri pod utjecajem humoralne regulacije. Kao humoralna regulacija
nedostajući tokom NMP eksperimenata, fiziološki klirens kreatinina i nivoi FENa plus se ne očekuju u našem NMP podešavanju.
Za kvantificiranje ozljedebubrežnićelije, mereni su nivoi ASAT i LDH. Najviši nivoi su uočeni u grupama 3 i 4, što sugeriše da se većina povreda dogodila u ove dve grupe. Kaths et al. pokazalo je da povećani nivoi ASAT tokom NMP koreliraju sa post-transplantacijombubrežna funkcijai stoga ASAT može biti važan biomarker za procjenu vitalnosti organa [20]. Utjecaj različitih sastava perfuzata na izmjerene nivoe ASAT-a naglašava važnost usklađivanja NMP protokola među transplantacijskim centrima, kako bi se omogućila konzistentna interpretacija NMP podataka na globalnoj osnovi. Nivoi NAG-a, markera za promijenjen integritet tubula i oštećenja tubula [32,33], bili su najviši u grupi 3, što ukazuje da se većina ozljeda tubula dogodila u ovoj grupi. Nivoi TBARS su izmjereni kako bi se kvantifikovao oksidativni stres tokom perfuzije. Najviši nivoi su uočeni u grupi 1 i 4, što ukazuje na tobubreziu ovim grupama doživjeli su najveći oksidativni stres, što je moglo rezultirati oštećenjem ćelijske funkcije [34]. Promjena omjera Bax/Bcl-2 nakon 7 sati NMP u poređenju sa biopsijom prije NMP je vjerovatno rezultat početnog toplog ishemijskog perioda, a ne potencijalno štetnih efekata koji se javljaju tokom NMP. Ishemijska ozljeda nakon posljedične reperfuzije inducira regulatornu kaskadu apoptoze, koja igra ključnu ulogu u procesu popravke oštećenog proksimalnog tubula [35]. Iako je predloženo mnogo normotermnih markera ozljeda, do danas nijedan nije potvrđen u dobrom kliničkom ispitivanju. Studija koja povezuje niz obećavajućih markera ozljeda izmjerenih tokom NMP-a sa post-transplantacijombubrežna funkcijapotrebno je da se razjasni koji potencijalni biomarkeri treba da budu uključeni u normotermne kriterijume za procjenu održivosti ex-vivo.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI INFEKCIJU BUBREGA/BUBREGA
Naša NMP postavka je korištena u kombinaciji sa svinjskim modelom DCDbubregdonacija u kojoj klaonicibubrezisu korišteni. Ograničenje ove studije je da se klaonički postupak zasniva na iskrvavljenju praćenom srčanim zastojem, što ga čini malo drugačijim od stvarnog modela DCD u kojem je zastoj cirkulacije rezultat srčane ishemije i/ili zatajenja. Međutim, mi smo to primetilibubreziu našoj studiji pokazala je ishemijsku ozljedu sličnu onoj koja je nastala nakon DCD [36,37]. Stoga smatramo da će sadašnji DCD model klaonice pomoći u smanjenju upotrebe laboratorijskih životinja uz održavanje osnovne pouzdanosti i reproduktivnosti. Iako su naše eksperimentalne grupe bile relativno male, naše grupe su uporedive s onima kod drugih svinjabubregmašinske studije perfuzije [17,38–40]. Parametri perfuzije NMP-a koje smo zabilježili u grupi 3, koja je bila bazirana na britanskom kliničkom perfuzijskom rastvoru koji su koristili Hosgood i saradnici, ne mogu se u potpunosti uporediti sa rezultatima koje je ranije objavila Leicester/Cambridge grupa [6,12]. u našoj studiji,bubrezibili su podvrgnuti mnogo dužem NMP-u i perfuzirani su sa višim srednjim arterijskim pritiskom. Dalje više,bubreziperfuzirali Hosgood et al. presađene su nakon mašinske perfuzije. Za potpuno pouzdano poređenje između četiri perfuzijska rješenja, buduća studija bi trebala uključivati transplantacijububrezinakon NMP-a jer će to omogućiti stvarno praćenje i funkcionalnu procjenu in vivo.
Zaključno, perfuzija svinjabubrezipokazalo se izvodljivim sa sva četiri testirana rješenja. Međutim, postojale su značajne razlike između nivoa elektrolita,bubrežna funkcijaparametre i markere povreda u četiri grupe. Ove razlike, u kombinaciji sa trenutnom heterogenošću u primenjenim perfuzionim rešenjima među grupama, ometaju razvoj standardizovanih kriterijuma za procenu NMP. Smatramo da je i u eksperimentalnom i u kliničkom NMP-u od suštinskog značaja da se pažljivo unaprijed odredi tačna svrha i željeno trajanje NMP-a, jer bi svaki mogao zahtijevati neophodna prilagođavanja u protokolu perfuzije i perfuzije. Važno je naglasiti da se ova studija fokusirala na efekte postojećih perfuzata u cjelini na mjerene ishode, a ne na istraživanje uloga pojedinih komponenti perfuzata. Potrebna su dalja istraživanja kako bi se razjasnili pojedinačni uticaji i prednosti svakog sastojka perfuzije tokom NMP-a