Prekomjerna ekspresija CD73 u podocitima: novi marker ozljede podocita kod ljudske bubrežne bolesti
Feb 26, 2022
sažetak:CD73 put je važan protuupalni mehanizam u različitim okruženjima bolesti. Zapažanja na modelima miševa sugeriraju da bi CD73 mogao imati zaštitnu uloguoštećenje bubrega; međutim, nema direktnih dokaza o njegovoj ulozi kod ljudibolest bubregaje opisano do danas. Ovdje smo pretpostavili da postoji povreda podocita kod ljudibolesti bubregamijenja ekspresiju CD73 što može olakšati dijagnozu podocitopatija. Procijenili smo ekspresiju CD73 i jednog od njegovih funkcionalno važnih meta, CC kemokinskog receptora tipa 2 (CCR2), u podocitima izbubregbiopsije 39 pacijenata s podocitopatijom (uključujući fokalnu segmentalnu glomerulosklerozu (FSGS), bolest minimalnih promjena (MCD), membranozni glomerulonefritis (MGN) i amiloidozu)) i kontrolne grupe. Ekspresija CD73 podocita u svakoj od grupa bolesti je značajno povećana u poređenju sa kontrolnom (p < 0.0{{10}}1–p="">< 0,0001).="" štaviše,="" postojala="" je="" izražena="" negativna="" korelacija="" između="" ekspresije="" cd73="" i="" ccr2,="" što="" je="" potvrđeno="" imunohistohemijom="" i="" imunofluorescencijom="" (pearson="" r="−" 0,5068,="" p="0.0031;" pearson="" r="−" 0,4705,="" p="0.0313)," što="" ukazuje="" na="" zaštitnu="" ulogu="" cd73="">povreda bubrega.Konačno, identificirali smo CD73 kao novi potencijalni dijagnostički marker ljudskih podocitopatija, posebno MCD-a koji je bio ozloglašen po nedostatku patoloških karakteristika koje se mogu prepoznati svjetlosnom mikroskopijom i imunohistohemijom.
Ključne riječi:podocit; bolest minimalnih promjena; CD73; CCR2;povreda bubrega;zatajenje bubrega
Uvod
Evolucijska ključna uloga adenozin trifosfata (ATP) kao sveprisutnog intracelularnog izvora energije ažurirana je prije više od tri decenije revolucionarnom idejom da članovi purinergičkog sistema (ATP, adenozin di- i trifosfat (ADP i AMP, respektivno) može isporučiti i ekstracelularne signale za posredovanje u ćelijskim interakcijama [1, 2] Ovaj koncept je doveo do razumijevanja da purinergički sistem učestvuje u oblikovanju imunoloških odgovora putem modulacije profila ekspresije receptora, sekrecije citokina, proizvodnje reaktivnih vrsta kisika (ROS) i intracelularna probava patogena [3–7] Ekstracelularni ATP se podvrgava konverziji/defosforilaciji u ADP i AMP preko CD39 (ekto-nukleozidtrifosfat difosfohidrolaze 1) i konačno, AMP se razgrađuje do adenozina pomoću CD73 (ekto{9}}) nukleotida [8] CD73 može biti prisutan u membrani vezanom ili rastvorljivom obliku. Membranski oblik ima dimer strukturu koja se sastoji od dvije identične podjedinice od 70 kD koje se vezuju za plazma membranu preko veze između C-terminalnog serina i glikozilfosfatidil inozitola (GPI) [9]. Važno je napomenuti da su CD39 supstrati ATP i ADP kompetitivni inhibitori CD73 [9-11]. Ekspresija CD73 stoga predstavlja kritični put podešavanja nivoa adenozina u ekstracelularnom prostoru. CD73 nije molekul specifičan za ćeliju ili organ; njegova ekspresija na leukocitima, endotelu, epitelnim ili mezenhimskim stanicama različitih organa (bubreg, pluća, jetra, debelo crijevo, mozak i srce) i matične ćelije su dobro dokumentirane [12-14]. Peralta et al. [ 15 ]. U skladu sa ovim podacima, pokazalo se da njegovo djelovanje ublažava akutno oštećenje pluća, odbacivanje alografta disajnih puteva, akutnu bolest transplantata protiv domaćina i sepsu [4,16–19].
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREZU/BUBREZU
Kao što je uvjerljivo pokazano na nekoliko modela miševa, CD73 može sudjelovati u tubulo-glomerularnoj interakciji ububreg. CD73-posredovano stvaranje adenozina koji potiče od CD73 iz ATP-a tubularnog porijekla tokom ishemijsko-reperfuzijskog oštećenja pokazalo se da ublažava upalu putem inhibicije efektorske funkcije neutrofila [20]. Štaviše, miševi sa nedostatkom CD73- pokazuju autoimunu upalu koja je praćena smanjenim brojem podocita i endotelnim fenestracijama [21]. Ovaj fenomen je bio povezan sa povećanim nivoima proinflamatornih citokina u serumu poput faktora tumorske nekroze (TNF)-alfa ili hemokinskog CXC motiva liganda 2 (CXCL-2). U ljudskom okruženjubolest bubrega,pretpostavljeno je da oštećenje podocita vjerovatno predstavlja mješavinu adaptivnih i destruktivnih mehanizama ćelijskog odgovora na patološke stimuluse, što ne odražava nužno objavljena zapažanja in vitro ili životinjskih modela. Etiologija ozljede podocita varira od mehaničkog stresa (glomerularna hiperfiltracija), oksidativnog stresa (kao kod hipertenzivne ili dijabetičke nefropatije, toksične ozljede, infiltracije upalnih stanica ili životinjskih modela bolesti minimalnih promjena) do imunološkog stresa (tj. oštećenja imunološkog kompleksa i komplementa). tokom glomerulonefritisa) [22]. Inflamatorno stanje glomerulonefritisa može stimulirati podocite da sintetiziraju različite citokine, potencijalno putem signalizacije posredovane CC kemokinskim receptorom 2 (CCR2). Ipak, malo se zna o ulozi CD73 kod ljudibolest bubrega, posebno u uvjetima kronične upale i ozljede podocita.
U ovoj studiji, pretpostavili smo da CD73 igra ulogu u patogenezi ljudskih glomerularnih bolesti i analizirali ekspresiju CD73 podocita kod ljudi.bubregbiopsije pacijenata sa patologijama povezanim s podocitopatijom. Pokazali smo da je površinska ekspresija CD73 podocita pouzdan marker oštećenja podocita, što posebno podržava dijagnostičku vrijednost CD73 u bolesti minimalnih promjena (MCD). Štaviše, izvještavamo o negativnoj korelaciji između ekspresije CCR2 podocita i ekspresije CD73, sugerirajući da prekomjerna ekspresija CD73 predstavlja adaptivni odgovor na glomerularnu leziju.
Rezultati
Klinički podaci i ultrastrukturno snimanje oštećenja podocitaTabela 1 prikazuje kliničku prezentaciju slučajeva uključenih u studiju u pogledu starosti, pola, kreatinina i vrijednosti ukupne proteinurije. Svi FSGS pacijenti su imali primarni oblik NOS (nije drugačije naznačen). Među 12 pacijenata sa MGN, 5 je bilo pozitivno na fosfolipazu A2 receptor (PLA2R) (42 procenta). U grupi amiloidoze, 2 pacijenta su imala AA-amiloidozu (16,7 posto) i 10 AL-amiloidozu (83,3 posto); kod 2 pacijenta sa AL-amiloidozom lakog lanca kapa je bila evidentna (20 posto), a 8 je bilo pozitivno na lambda (80 posto grupe AL-amiloidoze). Kod svih pacijenata sa MCD, FSGS, MGN i amiloidozom, oštećenje podocita je jasno detektovano elektronskom mikroskopijom (Slika 1).
Slika 1. Ultrastrukturna slika primarnog i sekundarnog oštećenja podocita. (a) Širenje tijela podocita na bazalnu membranu glomerula (strelica) uz retrakciju stopala u slučaju MCD. (b) Ekstenzivno brisanje podocita stopala (strelica) i citoplazmatska vakuolizacija (zvezda) kod pacijenta sa primarnim FSGS. (c) Brisanje procesa stopala (strelica), vakuolizacija i istaknute organele (dvostruka strelica) sa osnovnim epimembranoznim elektronskim gustim materijalom (zvijezda) kod primarnog membranoznog glomerulonefritisa. (d) Subepitelna akumulacija amiloidnih fibrila (strelica sa dve glave) sa uzastopnim odvajanjem podocita (kao znak ireverzibilnog oštećenja podocita) kod pacijenta sa AL-amiloidozom (lambda). Svi elektronski mikrosnimci su predstavljeni pri uvećanju od 4000 ×. Umetci—odgovarajuće fotomikrografije svjetlosne mikroskopije (40 × /0,65 NA; veličina trake skale: 50 µm in (a,c,d) i 100 µm in (b); PAS-bojenje).
Površinska ekspresija CD73 povezana je s ozljedom podocita kod bolesti bubrega kod ljudi
Da bismo istražili da li podociti eksprimiraju CD73 u fiziološkom okruženju i da bismo procijenili obrazac CD73 različitih bolesti povezanih s oštećenjem podocita, izvršili smo imunohistohemijsku analizu ekspresije CD73. Ultrastrukturna analiza je potvrdila oštećenje podocita kao nepravilnost citoskeleta uz najmanje brisanje nastavka stopala (Slika 1). U našoj negativnoj kontrolnoj grupi bez lezije podocita, nije bilo moguće detektovati značajnu ekspresiju CD73 u podocitima uprkos pozitivnosti unutrašnje kontrole (peritubularne kapilare) koja je tipično pozitivno obojena (Slika 2). S druge strane, grupe oštećenih podocita (MCD, FSGS, MGN i amiloidoza) pokazale su statistički visoko značajnu regulaciju CD73 podocita (p < 0.{{1{{20}}}}="" 001);="" značajno="" povećanje="" je="" bilo="" konzistentno="" i="" kada="" se="" porede="" pojedinačni="" entiteti="" sa="" negativnim="" kontrolama="" (p="" najmanje="">< 0,001).="" zanimljivo="" je="" da="" je="" stepen="" regulacije="" cd73="" bio="" manji="" u="" mcd="" grupi,="" iako="" značajno="" niži="" samo="" u="" poređenju="" sa="" uzorcima="" mgn="" (p="0.0043)" (slika="" 2).="" u="" grupama="" za="" oštećenje="" podocita,="" nije="" bilo="" korelacije="" između="" semikvantitativnog="" cd73="" rezultata="" i="" proteinurije="" na="" binarnom="" (nefrotskom/nefrotskom)="" ili="" kvantitativnom="" (g/24="" h)="" nivou="" (spearman="" r="−" 0,0807,="" p="0" .6302="" i="" spearman="" r="−" 0.076,="" p="0.6497," respektivno;="" slika="" 3a).="" sve="" u="" svemu,="" nije="" bilo="" korelacije="" između="" cd73="" rezultata="" i="" nivoa="" kreatinina="" (spearman="" r="0.0722," p="0.6259;" slika="" 3b).="" osim="" toga,="" nismo="" mogli="" otkriti="" značajnu="" korelaciju="" između="" ekspresije="" cd73="" i="" hipertenzije="" (spearman="" r="−" 0,03024,="" p="0.8384)" ili="" dijabetes="" melitusa="" (spearman="" r="−" 0,1784,="" p="" {{45="">
Povećana regulacija CD73 iz podocita u humanoj glomerularnoj bolesti negativno korelira s ekspresijom CCR2 receptora i nije u korelaciji s ekspresijom nefrina i podocinaCijeneći objavljene podatke o smanjenju ekspresije CCR2 makrofaga nakon prekomjerne ekspresije CD73 u modelu matičnih ćelija, pretpostavili smo da je pojačana regulacija CD73 tokom povrede podocita u obrnutoj korelaciji sa ekspresijom proinflamatornog CCR2 i izvršenom imunohistohemijskom analizom CCR2. U kontrolnoj grupi nije se mogla detektovati nikakva ili samo blaga ekspresija CCR2, bez značajnog odstupanja u odnosu na CD73 potpis u istim uzorcima. Nasuprot tome, uglavnom značajna regulacija površinskog CCR2 (ali različitog intenziteta) se mogla vidjeti u većini uzoraka iz biopsija oštećenih podocita i općenito je bila povećana u odnosu na kontrolnu grupu (p=0.0206; Dodatna slika S1). Grupe bolesti nisu se značajno razlikovale jedna od druge u tom pogledu.
Nadalje smo analizirali potencijalnu korelaciju između intenziteta ekspresije CD73 i CCR2. Zaista, upoređujući CD73 i CCR2 rezultate iz kohorte biopsije povrede podocita, može se uočiti izražena negativna korelacija (Spearman r=− 0.4821, p=0.{{18} }052), (Slika 4). Treba napomenuti da glomeruli sa CD73-pozitivnim podocitima pokazuju smanjenu ekspresiju CCR2 ne samo u podocitima već iu okolnim ćelijama, kao što su parijetalne epitelne ćelije (Slika 4). Inverzna korelacija je potvrđena procjenom imunofluorescentnog obojenja za CD73/CCR2 u oštećenim podocitima konfokalnom mikroskopijom (Spearman r=− 0,4478, p=0.0282), (Slika 5). Da bismo odgovorili na eventualnu povezanost između CD73 pozitivnosti i (gubitka) ekspresije proteina specifične za podocite, izvršili smo dodatno imunofluorescentno bojenje za nefrin i podocin i procijenili njihov obrazac ekspresije u kontrolnim, MCD i FSGS grupama (Slika 6a) kao i zajedničko bojenje sa CD73 u uzorcima sa lezijom podocita (Slika 6b–e). Nismo mogli otkriti značajnu korelaciju između srednjeg intenziteta fluorescencije ekspresije podocina ili nefrina s jedne strane i srednje ekspresije CD73 s druge strane (n=39, Spearman r=0.212, p {{33} }.1948 za podocin i n=60, Spearman r=0.01906, p=0.8851 za nefrin).
Diskusija
Ovdje po prvi put opisujemo ekspresiju CD73 na površini povrijeđenih podocita kod ljudibubrežna bolest. Analiziranjebubrežnibiopsije pacijenata sa izraženim oštećenjem podocita kao što su MCD, FSGS, MGN i amiloidoza, izvještavamo o značajnom povećanju ekspresije CD73 podocita u svakoj od ovih grupa u poređenju sa kontrolnombubrezi,neovisno o etiologiji oštećenja podocita. Štaviše, izvještavamo o inverznoj korelaciji između ekspresije CD73 i CCR2 od strane podocita grupa oštećenih podocita. Pokazalo se da pojačani CCR2 specifičan za podocite posreduje kod dijabetičarapovreda bubregakod miševa [23]. Osim toga, prijavljeno je da blokada CCR2 u mišjem modelu FSGS-a izazvanog Adriamicinom smanjuje proteinuriju i glomerularnu ozljedu [24]. Nedavna studija Lee et al.—takođe koristeći mišji model—ukazuje da bi smanjenje CCR2 moglo poboljšati albuminuriju izazvanu gojaznošću putem blokade oksidativnog stresa i akumulacije lipida [25]. Zaista, u in vitro sistemu koji koristi mezenhimalne matične ćelije (MSC) iz mišjeg perikardijalnog tkiva, pokazalo se da CD73-s prekomjernom ekspresijom MSC-a diktiraju reparativne procese kroz protuupalno djelovanje, između ostalih faktora također zbog inhibicije CCR{ {9}}pozitivna infiltracija makrofaga [13]. Stoga, u svjetlu naših rezultata i objavljenih podataka, primamljivo je pretpostaviti da ekspresija CD73 u podocitima može djelovati zaštitno upovreda bubrega, moguće putem puteva koji prigušuju CCR2. CCR2 signalizacija je usko povezana sa adhezijom i aktivacijom makrofaga [26, 27]. Makrofagi mogu utjecati na patogenezu podocitopatijebolesti bubrega(kao primarni MGN, gdje je infiltracija CD68 plus, CCR2 plus makrofaga prepoznata kao značajan indikator završne fazezatajenje bubrega[28]), daljnje studije povezanosti između sadržaja monocita/makrofaga, porijekla (infiltrirajući naspram rezidentnog), profila aktivacije (M1—proinflamatorni naspram M2—alternativno aktiviran) i ekspresije CD73 kod ljudibolest bubreganeophodni su za provjeru usklađenosti naših rezultata s prethodnim podacima sa mišjih modela.
U inflamatornom mikromiljeu koji se može vidjeti u hipoksiji, ishemiji-reperfuziji ili oštećenju autoimunog tkiva više ćelija oslobađa članove purinergičkog signalnog sistema, pretežno u obliku proinflamatornog ATP-a ili ADP-a [29, 30]. U ovim postavkama, ekto-nukleotidaza CD73 i njen produkt adenozin su važni faktori regulacije i utišavanja imunološkog odgovora. U životinjskim modelima, CD73 se pokazao zaštitnimbubregreperfuzijska ozljeda ishemije i njen nedostatak uzrokuju disfunkciju podocita, što dovodi do autoimune upale ibolest bubrega[21, 31]. Drugi in vivo eksperimenti na miševima koji su koristili ishemijsku reperfuzijsku ozljedu otkrili su važan protuupalni utjecaj CD73 izraženog u proksimalnim tubularnim epitelnim stanicama i njegovo ključno djelovanje ububregzaštita tokom dijabetičke nefropatije putem adenozin-endotelne signalizacije Adora2b receptora [20,32]. Podocitopatije su najčešća grupa glomerularnih lezija koje dovode do proteinurije. MCD, prototip 'primarne' podocitopatije, najčešći je uzrok nefrotske proteinurije kod djece starije od 1 godine [33, 34]. Trenutne hipoteze o patogenezi MCD sugeriraju značajnu ulogu citokina i drugih imunih medijatora u narušavanju integriteta bazalne membrane podocita-glomerula [35-38]. Nesklad između odsustva vidljivih promjena u svjetlosnoj mikroskopiji i teške proteinurije je obilježje MCD; ultrastrukturni dokaz oštećenja podocita elektronskim mikroskopom je stoga uslov sine qua non za dijagnozu MCD do danas. Ovaj dijagnostički algoritam naglašava značaj daljnjih dijagnostičkih alata prve linije u tom pogledu. Ispitivanje ekspresije CD73, posebno u okruženju ograničene dostupnosti elektronske mikroskopije, moglo bi stoga pomoći da se napravi razlika između glomerularnih (tj. podocitopatskih) i ekstraglomerularnih (npr. tubularni ili paraproteinemični) izvora proteinurije. Poređenje između imunohistohemije i imunofluorescencije u našoj studiji govorilo bi u prilog potonjem.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOLESTI BUBREGA/BUBREGA
Nekoliko publikacija je uvjerljivo dokumentiralo aberantnu distribuciju i gubitak proteina specifičnih za podocite u različitimbolest bubregapostavke koje uključuju povredu podocita i proteinuriju, kao što je nedavno pregledano [39]. U našoj studiji, unutar grupe oštećenih podocita, nismo mogli otkriti značajnu korelaciju između intenziteta fluorescencije podocina/nefrina i intenziteta ekspresije CD73. Međutim, specifična ograničenja isključuju patofiziološku interpretaciju statističkih podataka podocina/nefrina u odnosu na CD73. Prvo, za procjenu intenziteta fluorescencije odabrali smo podocite korištenjem tehničkog uvećanja i rezolucionih kapaciteta konfokalne mikroskopije. Iako ovi uvjeti lako omogućavaju otkrivanje tijela podocita, glavni procesi, a posebno procesi stopala, ostaju nejasni, pa stoga vjerovatno nisu označeni/analizirani. Drugo, korelacija između ekspresije CD73 i proteina specifičnih za podocite u cijelim glomerulima ne može se opravdati: iako bi procjena podocina i nefrina na ovom nivou bila legitimna (pošto je razumno pretpostaviti da nijedna druga glomerularna stanica ne eksprimira ove proteine) to se ne može tvrdi se za CD73 koji je djelimično eksprimiran u endotelnim ćelijama. Treće, samo procjena srednjeg intenziteta fluorescencije kao nezavisnog markera povrede podocita je upitna, jer ne pokriva patološki, granularni obrazac distribucije podocina i nefrina unutar glomerula, što bismo mogli jasno uočiti na slici 6. Stoga smo nevoljni da pripišemo odsustvo korelacije CD73-podocina i CD73-nefrina u našoj analizi divergentnim molekularnim putevima ovih markera. Dalja ispitivanja podocita in vitro i na životinjama su neophodna da bi se istražila eventualna interferencija između ovih signalnih kaskada.
Uzeti zajedno, prepoznajući malu veličinu uzorka kao glavno ograničenje naše studije, ovdje demonstriramo dosljednu prekomjernu ekspresiju CD73 od strane ozlijeđenih podocita i predlažemo CD73 kao novi dijagnostički marker podocitopatije. Kod bolesti s minimalnim promjenama, naši rezultati mogu pomoći da se identificiraju oštećeni podociti i rezultiraju manje vremena i troškova dijagnostičkog procesa. Osim toga, naši rezultati su u skladu s objavljenim podacima iz eksperimentalnih pristupa miša i sugeriraju zaštitnu interakciju između CD73 i CCR2 kod ljudibolest bubrega. Dalje multicentrične studije sa većim kohortama pacijenata su neophodne da bi se pozabavili mehanizmima CD73 signalizacije kod ljudibubregbolest i njena prognostička vrijednost. Slično tome, bili bi potrebni veći brojevi kohorte da bi se uspostavila potencijalna korelacija između težine bolesti i ekspresije CD73.
Materijal i metode
Study CohortUkupno 49 biopsija uključenih u ovu studiju od 49 različitih pacijenata dijagnosticirano je između 1. januara 2018. i 31. decembra 2019. u Univerzitetskoj bolnici Mannheim, Univerzitet u Heidelbergu. Daljnji kriterijumi odabira bili su reprezentativna biopsija sa mogućnošću izvođenja trostruke dijagnostike sa imunohistohemijom i EM, adekvatne kliničke informacije, jasna dijagnoza i dovoljno materijala za ovu studiju. Svi pacijenti su bili odrasli i belci. Istraživanja su obuhvatila 39 biopsija pacijenata sa povredom podocita različite etiologije (7 biopsija pacijenata sa primarnom fokalnom segmentnom glomerulosklerozom – FSGS; 8 iz bolesti minimalnih promena – MCD; 12 pacijenata sa membranoznim glomerulonefritisom – MGN; 12 pacijenata sa amiloidozom). Negativne kontrole su bilebubregbiopsije 10 pacijenata bez lezije podocita i bez proteinurije (6 pacijenata sa blagom nefrosklerozom, 2 pacijenta sa intersticijskim nefritisom i 2 pacijenta bez patoloških promena). Sve gore navedene biopsije uključene su u analizu ekspresije CD73 podocita; za CCR2, nakon isključenja parafinskih sekcija sa nedovoljnim brojem nesklerotičnih glomerula (<5), we="" performed="" analysis="" of="" surface="" expression="" and="" of="" correlation="" with="" cd73="" signature="" in="" 6="" samples="" from="" fsgs,="" 8="" from="" mcd,="" 10="" from="" mgn="" and="" 8="" from="" the="" amyloidosis="" group.="" in="" the="" ccr2="" analysis,="" the="" control="" group="" consisted="" of="" 6="" biopsies.="" relevant="" clinical="" data="" were="" collected="" from="" electronic="" medical="" records="" (table="" 1).="" informed="" consent="" was="" waived="" because="" of="" the="" retrospective="" nature="" of="" the="" study,="" because="" of="" the="" fact="" that="" anonymous="" clinical="" data="" were="" used="" for="" analysis="" and="" because="" the="" study="" was="" performed="" on="" already="" existing="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" after="" completing="" the="" diagnostic="" process,="" as="" approved="" by="" the="" ethic="" committee="" of="" the="" university="" medical="" centre="" mannheim,="" university="" of="" heidelberg="" (reference="" number:="">
Histologija, imunohistohemija, imunofluorescencija i elektronska mikroskopijaSerijski presjeci od 1 µm su rađeni na parafinombubregbiopsije i obojene hematoksilinom/eozinom (H/E), periodičnom kiselinom-Schiffom (PAS), Massonovim trihromnim bojenjem kao i standardnom rutinskom imunohistohemijom u dijagnostičke svrhe. Imunohistohemijsko i imunofluorescentno bojenje biopsija ugrađenih u parafin fiksiranih formalinom za izvedeno je ručno korišćenjem zečjeg anti-humanog CD73 monoklonskog antitela (klon D7F9A, Cell Signaling, Frankfurt na Majni, Nemačka) i mišjeg monoklonskog anti-humanog CCR2 antitela (7A) Abcam, Cambridge, UK), zečje poliklonsko anti-humano antitijelo na nefrin (Abcam, Cambridge, UK) i zečje anti-humano podocinsko antitijelo (Sigma, Saint Louis, MO, SAD), prema protokolima proizvođača. Sve biopsije su uključene u analizu ekspresije CD73 podocita imunohistohemijskom; za CCR2, parafinski preseci sa nedovoljnim brojem nesklerotičnih glomerula (<5) were="" excluded.="" to="" minimize="" the="" noise,="" antibody="" optimization="" for="" immunohistochemistry="" was="" performed="" using="" control="" (tonsil)="" tissue.="" the="" tissue="" sections="" were="" stained="" with="" dako="" real="" detection="" system="" alkaline="" phosphatase/red="" rabbit/mouse="" kit="" (agilent,="" santa="" clara,="" ca,="" usa)="" and="" avidin/biotin="" blocking="" kit="" (vector="" laboratories,="" burlingame,="" ca,="" usa).="" antigen="" retrieval="" was="" performed="" for="" 20="" min="" using="" dako="" target="" retrieval="" solution="" (equivalent="" citrate="" buffer,="" ph="" 6.0).="" primary="" antibodies="" were="" incubated="" for="" 60="" min="" in="" dako="" antibody="" diluent="" with="" 2%="" dry="" milk="" at="" 37="" ◦="" c="" and="" detected="" using="" the="" dako="" real="" link,="" biotinylated="" secondary="" antibodies="" (included="" in="" the="" kit),="" and="" dako="" real="" streptavidin="" alkaline="" phosphatase="" (ap).="" the="" reaction="" was="" visualized="" by="" a="" red="" chromogen="" (included="" in="" the="" kit).="" the="" slides="" were="" counterstained="" with="" hematoxylin,="" dehydrated,="" mounted="" using="" aquatex="" (merck,="" darmstadt,="" germany)="" and="" cover-slipped.="" for="" immunofluorescence,="" ccr2/cd73="" co-expression="" was="" evaluated="" in="" total="" of="" 22="" podocytes="" from="" all="" podocyte="" lesion="" groups.="" cd73="" was="" stained="" with="" alexa="" flour="" tm="" 488="" tyramide="" superboost="" tm="" kit,="" streptavidin="" (invitrogen,="" thermo="" fisher,="" waltham,="" ma,="" usa)="" using="" secondary="" biotinylated="" anti-mouse="" antibody="" (biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" secondary="" antibodies="" for="" the="" immunofluorescence="" were="" donkey="" anti-mouse="" cf="" 594="" and="" donkey="" anti-rabbit="" cf="" 594="" (both="" from="" biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" for="" electron="" microscopy,="" biopsies="" were="" post-fixed="" with="" 1%="" osmium="" tetroxide="" (roth,="" karlsruhe,="" germany),="" embedded="" in="" agar="" 100="" resin="" (agar="" scientific,="" stansted,="" uk),="" cut="" at90nm="" thickness="" andstained="" with1%="" uranylacetate(serva,="" heidelberg,="" germany).="" micro-graphs="" were="" taken="" on="" transmission="" electron="" microscope="" jem-1400="" (joel,="" freising,="">
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI FUNKCIJU BUBREGA/BUBREGA
Svetlosna mikroskopija i morfometrijske analizeSnimanje i analiza slike rađeni su pomoću PreciPoint skenirajućeg mikroskopa M8 sa Olympus PlanCN 40 × /0.65 objektivom i MicroPoint softverom (v.5 2. maja 016; PreciPoint, Freising , Njemačka). Semikvantitativna procjena površinske ekspresije CD73 podocita u imunohistohemijskom bojenju procijenjena je pomoću skale 0-3 (0—bez ekspresije; 1—fokalna segmentalna pozitivnost (<50% podocytes="" positive="" in=""><50% glomeruli);="" 2—focal="" global="" (="">50 posto podocita pozitivnih<50% glomeruli);="" 3—diffuse="" (any="" percentage="" of="" podocytes="" positive="" in="">50 posto glomerula). CD73 pozitivni i negativni podociti analizirani su na koekspresiju CCR2 koristeći semikvantitativni sistem bodovanja zasnovan na intenzitetu (0—bez ekspresije, 1—slaba ekspresija, 2—umjerena ekspresija i 3—jaka ekspresija, prema internoj CCR2 pozitivnoj kontroli na biopsiji— endotel i infiltrirajuće imune ćelije). Evaluaciju su izvršila dva patologa (SP i ZP) nezavisno na slijepi način.
Konfokalna mikroskopijaSlike CD73 (Alexa Fluor 488), CCR2 (Alexa Fluor 594) i jezgara (DAPI) podocita su dobijene uzastopno pomoću Olympus FV1000 motorizovanog konfokalnog mikroskopa opremljenog HeNe 594 nm, Argon 488 nm i UV dioda 405 nm laser i fotomultiplikatorske cijevi (PMT) koje kontrolira softver FluoView, koristeći 60 × /1,35 UPlanSApo objektiv. 12-bitne slike sa okvirima od 512 × 512 piksela i veličinom piksela od 0,41 µm za preglede i 0,10 µm za visoku rezoluciju dobijene su održavanjem svih postavki na mikroskopu konstantnim. Slike su dalje poluautomatski obrađene i analizirane korištenjem makronaredbe ImageJ koju je razvila kompanija (datum pristupa: 15. decembar 2020.). Ukratko, slike su segmentirane za pojedinačne podocite, primijenjen je prag i izmjeren srednji intenzitet, statistički analiziran i ucrtan. Sve slike su obrađene sa stalnim postavkama i prikazane sa istom pseudo-bojom jednako linearno prilagođenom za pojedinačne kanale na spojenim slikama
Statističke analizeStatističke analize su obavljene pomoćuGraphPadPrismv. 8.4.3 softver (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, SAD). Svi podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM. Statističke razlike su izračunate korišćenjem uparenog ili neuparenog t-testa, kao i Pirsonove korelacione analize, kako je naznačeno.