Prethodno učenje o strahu omogućava brzu asimilaciju novih sjećanja na strah direktno u kortikalne mreže 3. dio

Eksperimentalni dizajn

Reproducibilnost podataka je procijenjena različitim ponavljanjima (S1 tabela). Prvi eksperimenti inaktivacije CNQX u Te2 (slike 1A-1C) izvedeni su u većem broju ponavljanja jer su to bili prvi eksperimenti koje smo proveli i služili su za testiranje glavne hipoteze naše studije. Životinje su a priori raspoređene u različite grupe ponašanja na način izbalansiran po težini. Mužjaci iz istog legla nasumično su raspoređeni u svaku eksperimentalnu grupu. Prvo smo se pozabavili glavnom hipotezom našeg istraživanja, tj. inaktivacija korteksa može drugačije utjecati na konsolidaciju nove memorije straha kod eksperimentalno naivnih pacova i životinja koje su naučile prethodni strah.

Mužjaci imaju izuzetno jaka pamćenja jer imaju jači instinkt preživljavanja i želju za razmnožavanjem. Životinje koje preživljavaju u divljini moraju zapamtiti mnogo geografskih informacija, vrsta hrane, tragova grabežljivaca i lokacija članova grupe kako bi se bolje prilagodile okolišu i zaštitile život.

Na primjer, mužjaci lavova moraju zapamtiti status cijele teritorije, članske odnose i lokacije takmičara kako bi zaštitili teritoriju i svoj status. Mužjaci zebre moraju zapamtiti lokaciju izvora vode i hrane na travnjaku kako bi preživjeli i razmnožavali se. Kompanija gaziranih pića jednom je objavila oglas koji je pokazao da se mužjak polarnog medvjeda može sjetiti ronioca i njegovog jedinstvenog mirisa kako bi ga mogao identificirati sljedeći put kada ga vide.

Stoga muške životinje moraju imati jaka sjećanja u smislu zaštite svoje teritorije, obezbjeđenja dovoljno hrane i reprodukcije potomstva. To ih također čini važnim subjektima u ljudskim istraživanjima, na primjer, za istraživanje bolesti kao što su oštećenje pamćenja i Alchajmerova bolest.

U ljudskom svijetu također možemo crpiti inspiraciju iz sjećanja na muške životinje. Kontinuirano izlaganje novim stvarima, kontinuirano učenje i razmišljanje mogu poboljšati naše pamćenje i prilagodljivost, te poboljšati naš životni standard i radnu efikasnost. Stoga, učimo od muških životinja, nastavimo sa gomilanjem znanja i iskustva, imajmo snažne instinkte za preživljavanje i reproduktivne želje i stvaramo bolju budućnost. Vidi se da moramo poboljšati svoje pamćenje. Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje jer je cistanche deserticola tradicionalni kineski ljekoviti materijal s mnogim jedinstvenim efektima, od kojih je jedno poboljšanje pamćenja. Djelotvornost mljevenog mesa proizlazi iz različitih aktivnih sastojaka koje sadrži, uključujući kiselinu, polisaharide, flavonoide, itd. Ovi sastojci mogu promovirati zdravlje mozga na različite načine.

Kliknite saznajte načine za poboljšanje funkcije mozga

U slučaju statističkih razlika između ovih grupa, na kraju smo izvršili dodatne kontrolne grupe kroz injekciju fiziološkog rastvora. Sličan pristup primijenjen je i na optogenetske eksperimente, gdje je AAV-kontrolna grupa izvedena tek nakon što su otkrivene statističke razlike između naivnih i prethodno obučenih pacova. Ovi eksperimentalni rasporedi omogućili su nam da izbjegnemo nepotrebne kontrolne grupe i upotrebu nepotrebnih životinja, što je ključno pitanje u europskom i talijanskom zakonodavstvu o eksperimentiranju na životinjama (princip od 3 Rs).

Postupci ponašanja

Svi eksperimenti su rađeni u svetlosnoj fazi dana (od 8 do 16 časova). Životinje su transportovane pojedinačno od objekta do eksperimentalnih prostorija u različitim malim prozirnim kantama u zavisnosti od eksperimentalnih zahteva.

Auditivni trening: Prva sesija ponašanja. Slušne životinje uslovljene strahom (CS1-CS2). U ovoj grupi, pacovi su nežno odvođeni iz kućnog kaveza i prenošeni iz sobe za smeštaj u prostoriju sa zvučnom izolacijom. Jednom tamo, životinje su stavljene u aparat za kondicioniranje koji se sastojao od pravokutnog crnog kaveza (35 × 40 cm) opremljenog rešetkom od nehrđajućeg čelika (1 cm u promjeru, na razmaku od 1,5 cm) povezanom sa postavom za isporuku šoka.

Pacovi su ostavljeni neometani 1 minut. Nakon ovog vremena, primijenjeno je 7 uslovljenih stimulusa (CS) koji se sastoje od čistog tona frekvencije 15 kHz (po 15 s trajanja, 80 dB, 36 s probnog intervala). Posljednja 1 s svakog tona bila je uparena sa bolnim UZ (0,5 mA, 1 s). Na kraju kondicioniranja, pacovi su vraćeni u svoj kućni kavez.

Životinje samo za šok (shock-CS2). U ovoj grupi, pacovi su na sličan način bili smješteni unutar istog uređaja za kondicioniranje. Neposredno nakon toga, svaki pacov je podvrgnut 7-udarcima stopala (1 s, 0.5 mA) jedan za drugim. Na kraju stimulacije životinje su vraćene u kućni kavez. Vremensko trajanje u kavezu za kondicioniranje bilo je manje od 9 sekundi. Prethodne studije su pokazale da ovaj postupak omogućava izbjegavanje asocijativnih procesa između bolnih i senzornih podražaja [29,30].

Miris životinja uslovljenih strahom (miris-CS2). U ovoj grupi, pacovi su smješteni unutar istog pravokutnog crnog kaveza koji je korišten u gornjim eksperimentalnim grupama i spojen na postavku za isporuku šoka. Pacovi su ostavljeni neometani 2 min. Nakon ovog vremena dato je 7 CS koji se sastoje od mirisa vanile (10 s trajanja svaki, 24 s probni interval). Posljednja 1 s svakog mirisa uparena je sa bolnim UZ (0,5 mA, 1 s). Modul za kondicioniranje je postavljen u blizini izvora ventilacije kako bi se izbjegla perzistentnost isporučenih stimulusa nakon njihovog otklanjanja. Kavez je osiguran gornjom rešetkom. Mirisi su prikazani pomoću olfaktometra za razrjeđivanje protoka. Čisti vazduh (1,5 L/min) je bio usmeren na elektromagnetni ventil, koji je, kada je radio, propuštao vazduh u bocu od 15 ml koja je sadržala 10 ml mirisa vanile.

Životinje samo za ton (Tone-CS2). Pacovi u ovoj grupi su smješteni u isti crni kavez i predstavljeni su tonom 15-kHz (7 stimulusa, 15 s trajanja, 36 s ITI) isporučenim u odsustvu SAD-a.

Prethodno izložene životinje (Tone-CS1-CS2). Pacovi su stavljeni u kavez za kondicioniranje i, 1 minut kasnije, predstavljen im je 20 puta samo 15-kHz ton, a 24 h kasnije isti je ton uparen sa SAD koji je postao CS1.

Životinje uslovljene strahom bijelim šumom (WN-CS2). U ovoj grupi, pacovi su stavljeni u pravougaoni crni kavez i ostavljeni neometani 1 minut. Nakon ovog vremena, primijenjeno je 7 CS-ova koji se sastoje od WN-a (15 s trajanja svaki, 75 dB, 36 s međuprobnog intervala). Posljednja 1 s svakog tona je uparena sa bolnim US (0.5 mA, 1 s). Na kraju kondicioniranja, pacovi su vraćeni u svoj kućni kavez.

Auditivno učenje straha: Drugi trening ponašanja. Dvije sedmice nakon postupaka opisanih u gornjem paragrafu, životinje su obučene za još jedan drugačiji zadatak kondicioniranja slušnog straha. Pacovi su stavljeni u standardnu ​​kutiju za kožu, kao u našem prethodnom radu [10], i ostavljeni neometani 2 min. Nakon ovog vremena, isporučeno je 7 CS-ova koji se sastoje od čistih tonova frekvencije 3 kHz (8 s trajanja svaki, 80 dB, 22 s međuprobnog intervala). Posljednja 1 s svakog tona bila je uparena sa bolnim UZ (0,5 mA, 1 s). Na kraju kondicioniranja, pacovi su vraćeni u svoj kućni kavez.

Strah od zadržavanja pamćenja. Zadržavanje slušne memorije straha koja je nedavno stečena na CS2 (3 kHz) testirana je 4 dana kasnije. Za optogenetičke eksperimente, test nedavne memorije je izveden sa laserskom isporukom 24 h nakon CS2-US učenja u analogiji s vremenskim intervalom u kojem smo izvršili inaktivaciju korteksa primjenom CNQX-a (tj. 24 h nakon obuka). Pacovi su naviknuti na aparate koji se razlikuju od onih koji se koriste za kondicioniranje i smješteni u drugu prostoriju kako bi se izbjeglo uvjetovano ponašanje straha prema kontekstualnim znakovima [10,62].

Novi aparat se sastojao od prozirnog plastičnog kaveza sa crnom obojenom stranom zatvorenom u kutiji za prigušivanje zvuka opremljenoj ispušnim ventilatorom, koji je eliminisao mirisni vazduh iz kućišta i stvarao pozadinsku buku od 60 dB. Životinjama je bilo dozvoljeno da istražuju kavez 5 minuta dnevno tokom sesije navikavanja. Na dan testa zadržavanja pamćenja straha, nakon 2 minute slobodnog istraživanja, isporučili smo 4 CS2 od 3 kHz (8 s—22 ITI) nakon čega nije slijedio nijedan US.

Ako je to zahtijevala eksperimentalna potražnja, pacovi su zatim testirani na zadržavanje udaljene memorije straha, stečene 2 sedmice prije drugog ispitivanja slušnog uslovljavanja straha. U tom cilju, 7 dana nakon testa zadržavanja pamćenja straha na 3-kHz ton, životinje su stavljene u novo okruženje (crno-bijeli prugasti kavez) i zatim predstavljene sa 15-kHz tonom. Predstavljena su četiri tona u intervalima od 36s.

Kontekstualni trening: Prva sesija ponašanja. Kontekstualna grupa za uslovljavanje straha (CtxA-CtxB). U ovoj grupi, pacovi su nježno izvučeni iz kućnog kaveza, stavljeni u kantu i nošeni iz prostorije za smještaj u prostoriju sa zvučnom izolacijom. Kada su tamo, životinje su bile smještene unutar aparata za kondicioniranje koji se sastojao od gore spomenutog pravokutnog crnog kaveza, opremljenog rešetkom od nehrđajućeg čelika spojenom na postavku za isporuku šoka. Pacovi su ostavljeni neometani 1 minut. Nakon ovog vremena, primijenjeno je 5 US (0.5 mA, 1 s) u vremenskim intervalima od 51 s. Na kraju sesije životinje su vraćene u svoj kućni kavez.

Grupa samo za šok (shock-CtxB). Pacovi, kada su jednom stavljeni u aparat za kondicioniranje, odmah su primili 5- šokove stopala (1 s, 0.5 mA) jedan za drugim. Vremensko trajanje u kavezu za kondicioniranje bilo je manje od 7 sekundi. Prethodne studije su pokazale da ovaj postupak omogućava izbjegavanje asocijativnih procesa između bolnih i senzornih podražaja [29,30].

Grupa samo za šok (shock-CtxB). Pacovi, kada su jednom stavljeni u aparat za kondicioniranje, odmah su primili 5- šokove stopala (1 s, 0.5 mA) jedan za drugim. Vremensko trajanje u kavezu za kondicioniranje bilo je manje od 7 sekundi. Prethodne studije su pokazale da ovaj postupak omogućava izbjegavanje asocijativnih procesa između bolnih i senzornih podražaja [29,30].

Novo kontekstualno uslovljavanje straha i nedavno zadržavanje sjećanja na strah. Dvije sedmice nakon procedura opisanih u gornjem paragrafu, sve grupe su obučene da povežu novo kontekstualno okruženje (modul kutije skinner, smješten u drugoj prostoriji) sa bolnim US (0.5 mA, 1 s) . Svaka životinja je stavljena u novu komoru i ostavljena neometana 2 min. Zatim je izložen 5 UZ razdvojenih intervalima od 30 s.

Zadržavanje kontekstualne memorije straha testirano je 4 dana nakon postupka uslovljavanja straha tako što su pacovi ponovo stavljeni u Skinner box komoru na 3 minute. Za optogenetičke eksperimente, test nedavne memorije je izveden sa laserskom isporukom 24 h nakon učenja CtxB-US analogno vremenskom intervalu u kojem smo izvršili inaktivaciju korteksa putem primjene CNQX-a (tj. 24 h nakon treninga). Ako je to zahtijevala eksperimentalna potražnja, pacovi su zatim testirani na zadržavanje udaljene memorije straha stavljanjem životinja u kontekst uparen sa SAD 2 tjedna prije nove povezanosti.

Životinje su nošene u 2 različite kante u komore za kondicioniranje prema različitim kontekstualnim procedurama.

Mera smrzavanja. U svim eksperimentalnim postupcima, procjena zadržavanja pamćenja straha određena je kao odgovor smrzavanja [10], analiziran kao potpuno odsustvo somatske pokretljivosti osim respiratornih pokreta. Za svaku životinju, vrijeme (u sekundama) provedeno u smrzavanju je mjereno van mreže od strane 2 nezavisna posmatrača koji su bili slijepi za grupe životinja.

Hirurške procedure

Za davanje odabranih supstanci na ciljna mjesta, pacovi su anestezirani izofluranom: indukcija je izvedena pri 4% [vol/vol] u 2 L/min medicinskom zraku i produžena do kontinuiranog izlaganja pri 2% [vol/vol]) kada su pacovi postavljeni u stereotaksički aparat.

Napravljen je rez na lobanji i izbušene su male rupe za šišanje kako bi se omogućilo prodiranje infuzione igle 28-gauge. Za isporuku supstanci korištena je 10-ul Hamilton šprica postavljena na infuzionu pumpu. Nakon infuzije, igla je ostavljena na mjestu još 3 min. Rez je zatim zatvoren kopčama za rane od nerđajućeg čelika, a životinji je data supkutana injekcija analgetika/protuupalnog ketoprofena (2 mg/kg tjelesne težine), a životinja je držana na toplom i pod nadzorom do oporavka od anestezije.

Kao iu prethodnim studijama [10,32–34], kaniliranje životinjama nije bilo potrebno, jer su aktivni spojevi davani direktno stereotaksički. Ovaj postupak je povoljan jer se izbjegava hirurška trauma svojstvena proceduri trajnog kaniliranja, čime se trauma ograničava na penetraciju jedne igle [10,32–34]. Zaista, opća anestezija ne utječe značajno na konsolidaciju pamćenja [10,32–34]. Kako bi se osiguralo da je vrijeme primjene jedinjenja vezano za pokus učenja bio tačan, tako da su štakori primili odabrana jedinjenja oko 1 h i oko 1 dan nakon treninga, anestezija izofluranom je inducirana 5 minuta prije planirane injekcije, npr. u 55. min kod pacova tretiranih 60 minuta nakon treninga i 23 h i 55 min kod životinja koje su ubrizgane 24 h nakon treninga. Svaki pacov je kondicioniran, a zatim operiran zasebno. Životinjama koje su pripadale različitim grupama ponašanja manipulisalo se na isprepleteni način.

Selektivni inhibitor AMPA/kainat glutamatnih receptora CNQX ({{0}}Cijano-7-nitrohinoksalin-2,3-dion) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] je otopljen u sterilnom fiziološkom rastvoru (NaCl, 0.9%) i podešen na pH 7,4 sa HCl. Inhibitor sinteze proteina anizomicin (Merck, 125 ug/ul) je otopljen u ekvimolarnoj HCl, razrijeđen sterilnim fiziološkim rastvorom i podešen na pH 7,4 sa NaOH. Sterilni fiziološki rastvor (0,9% NaCl) korišćen je kao kontrola nosača. Ove supstance su bilateralno ubrizgane brzinom od 0,1 ul/min i zapreminom od 0,5 ul po mestu na sledećim stereotaksičkim koordinatama uzetim iz Paxinos i Watson atlasa [26], sa Te2 kortikalnim poljem upućenim u Zillesov atlas [25]:

Sekundarni slušni korteks (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Prednji cingularni korteks (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

Volumen injekcije (0.5 ul po mjestu) odabran je na osnovu prethodnih studija u kojima su aktivna jedinjenja injektirana u Te2 [10,34] i ACC [55,63] kod odraslih pacova.

Da bi se inaktivirao dorzalni hipokampus, aktivna jedinjenja su ubrizgana u zapremini od 0.6 ul po mjestu na sljedećim stereotaksičkim koordinatama:

Dorzalni hipokampus: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Ireverzibilne lezije dorzalnog hipokampusa izazvane su davanjem NMDA (Tocris, 18 ug/ul, rastvorenog u sterilnom fiziološkom rastvoru, 0,4 ul po mestu) brzinom od 0.1 ul/ min u tačkama na gore navedenim koordinatama. Iste koordinate korištene su za kontrole ubrizgane slanom otopinom i lažno operirane životinje.

Red Retrobeads (Lumafluor, 1:2 razrjeđenje u fiziološkom rastvoru, 0.6 ul) su ubrizgane u BLA prema sljedećim koordinatama: AP: -2,8; L: ±5,4; DV: −8.3.

Na kraju eksperimenata, histološki su verifikovani tragovi igle u slučaju injekcija CNQX, anisomicina ili fiziološke otopine ili proširenje lezija u slučaju injekcija NMDA. Pacovi su duboko anestezirani i intrakardijalno perfuzirani sa 4% formaldehida. Njihovi mozgovi su izrezani na 30 μm na kriostatu. Nissl-om obojeni serijski rezovi pripremljeni su konvencionalnom procedurom, a preseci su histološki verifikovani pod mikroskopom uvećanim od 2,5×.

Optogenetski eksperimenti

Injekcija virusa. Adeno-asocirani virus AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-trešnja i kontrolni vektor AAV5:CaMKII -trešnja su dobijeni sa Univerziteta Sjeverne Karoline Vector Core (Chapel Hill, Sjeverna Karolina, Sjedinjene Američke Države). Titar ovih virusa bio je 5:8 Titar virusa bio je 5,8 × 10^12 vg/ml za oba virusa. Upotreba CaMKII promotora omogućava ekspresiju transgena favorizujući piramidalne neurone. Virusi su bili smješteni u zamrzivaču od -80˚C. Virusne infuzije usmjerene na Te2 ili ACC izvedene su na gore navedenim stereotaksičkim koordinatama u zapreminama od 0,5 ul za svaku rupu. Virus je ubrizgavan brzinom od 0,1 ul/min, a igla je ostavljena na mjestu dodatnih 5 minuta. Virusne injekcije su obavljene 4 sedmice prije optogenetskih eksperimenata.

Iluminacija.

Optička vlakna (Plexon, 200/230 μm jezgro; 10 mm dužine) su implantirana bilateralno u BLA (AP=−2,8, L=± 5,4, V=−8,2 mm od bregma). Optogenetska inhibicija Te2 projekcija na BLA ili ACC projekcija na BLA je postignuta upotrebom PlexBright Optogenetic Stimulation System spojenog na lasersku diodu (Laserglow Technologies). Žuto svjetlo (589 nm) se generiše i prolazi kroz optičko vlakno. Gustina snage procijenjena na vrhu optičkog vlakna bila je 10 do 15 mW za osvjetljenje projekcijskih mjesta. Tokom zadržavanja pamćenja straha, emisija svjetlosti je pokrenuta 4 s prije početka tona, zadržala se tokom cijelog tona i zaustavljena 4 s nakon pomaka tona. Životinje koje pripadaju grupama za kondicioniranje kontekstualnog straha dobile su svjetlosnu stimulaciju tokom cijelog istraživanja konteksta (3 min). Pacovi su upoznati sa patch kablom 2 dana prije ispitivanja zadržavanja memorije.

Imunohistohemija. Po završetku optogenetskih eksperimenata, pacovi su duboko anestezirani i perfuzirani intrakardijalno sa 4% PAF-a kako bi se ispitala difuzija virusa. Mozgovi su secirani, pohranjeni preko noći na 4˚C i konačno prebačeni u 30% saharoze. Koronalni preseci (30 μm) su isečeni na kriostatu i sakupljeni u PBS. Slobodno plutajuće sekcije su inkubirane u otopini za blokiranje 1 h na sobnoj temperaturi. Zatim su inkubirani u primarnom monoklonskom mišjem antitelu anti mCherry (razblaživanje 1:500, Abcam) u rastvoru za blokiranje preko noći na sobnoj temperaturi. Nakon toga, sekcije su isprane PBS-om i inkubirane 1 h na sobnoj temperaturi sa sekundarnim fluorescentnim AlexaFluor-568 anti-mišjim antitijelom (1:600, Invitrogen) razrijeđenim u PBS-u. Sekcije su oprane u PBS-u, montirane sa medijumom za montažu koji sadrži DAPI (Vektor), a prekrivač je prekriven.

Slično su prikupljeni i mozgovi štakora koji su bili podvrgnuti NMDA injekcijama. Slobodno plutajuće sekcije, nakon nekoliko ispiranja, inkubirane su sa primarnim monoklonskim mišjim anti-Neun (1:1,000 razrjeđenje, Merck) antitijelo u otopini za blokiranje preko noći na sobnoj temperaturi. Nakon toga, sekcije su isprane PBS-om i inkubirane 1 h na sobnoj temperaturi sa biotiniliranim konjskim anti-mišjim antitijelom (1:200 razrjeđenje, vektor). Kompleks avidin-biotin (ABC kompleks 1:100, vektor, 2 h i pola inkubacije) spojen je sa diaminobenzidinom (0,03%, Merck) da bi se obojio Neun. Sekcije su zatim isprane u PBS-u i prebačene na želatinom obložene pločice, dehidrirane i prekrivene pokrovnim stakalcem.

Te2 sekcije pacova ubrizganih retro kuglicama su podvrgnuti inkubaciji sa primarnim poliklonskim zečjim anti-Fos antitijelom (1:2,000, Cell Signaling) u otopini za blokiranje preko noći na sobnoj temperaturi. Nakon toga, kriške su isprane PBS-om i inkubirane 1 h na sobnoj temperaturi sa anti-zečjim Alexa 488 (1:1,000, Invitrogen, u PBS-u). Konačno, imuno označene sekcije su isprane u PBS-u, postavljene na želatinom obložene pločice i prekrivene medijumom za montažu sa dodatkom DAPI.

Mikroskopija

Označavanje mCherry je ispitano korištenjem Zeiss Airyscan konfokalnog mikroskopa: Korištena su dva lasera (405 i 561 nm), od kojih svaki odgovara vršnom spektru emisije za DAPI (Nissl boja za ćelijska jezgra) i Alexa 568 (mCherry ), respektivno. Da bi se analizirala difuzija virusa na mjestima ubrizgavanja, mikrografije Te2 i ACC su napravljene kao mozaične slike (svaka pojedinačna je snimljena korištenjem 10× objektiva). Terminali aksona u BLA analizirani su korišćenjem 40× objektiva kao z-stack od 10 sekcija, međusobno razmaknutih 1 μm (159 μm kvadrat; frakcija zumiranja, 1,0).

Za životinje ubrizgane retrobeads koje su podvrgnute cFos imunoobilježavanju, slike su dobijene pri povećanju od 40× (159 μm kvadrat; frakcija zumiranja, 1.0) sa 3 različita lasera, što odgovara spektru vršne emisije za DAPI (Nissl boja za ćelijska jezgra), AlexaFluor 488 (cFos) i Texas Red (Retrobeads), respektivno. Sekcije od 0,7 μm su dobijene duž 10- μm z-stacka. Broj jezgara koje eksprimiraju cFos, kuglicama označenih i dvostruko pozitivnih (cFos+ kuglice označene) kvantificiran je za svaku životinju u Te2 regiji na anteroposteriornim koordinatama od 6,7 do 7,3 mm od bregme [10]. Podaci su zatim usrednjeni da bi se dobila srednja vrednost svake životinje i rezultati su statistički upoređeni. Slike preseka sa DAB bojenjem Neuna analizirane su korišćenjem softvera Neurolucida spojenog na mikroskop preko CCD kamere u boji [10].

Analiza podataka i kriteriji isključenja

n za svaku grupu ustanovljeno je a priori prema našim prethodnim studijama [10,16,17], ranije objavljenim radovima iz ove oblasti (vidi kao reference za ACC [6,22,55] i Te2 [10,59]), i kroz procjene G-snage, prema sljedećoj tabeli (Tabela 1):

Za svaku analizu, procijenili smo konačni srednji broj od 8 do 10 životinja za svaku grupu. Grupe su vođene sa internim kontrolama u istoj eksperimentalnoj sesiji (S1 tabela). S obzirom na varijabilnost hirurških i bihevioralnih zahvata, a priori smo uključili veći broj eksperimentalnih subjekata (do 15% više) koji su u nekim slučajevima zadovoljili eksperimentalne kriterije i bili uključeni, čime smo izbjegli proizvoljno isključenje. U slučaju hipokampalnih studija, da bismo procijenili efekte NMDA i CNQX injekcija u različitim vremenskim intervalima, izbalansirali smo ukupan broj kontrolnih životinja između pacova sa nosačem i lažno operiranih pacova među različitim grupama.

Analiza ponašanja, histološke inspekcije i brojanje ćelija vršeni su na slijepo. Životinje sa neadekvatnom lokalizacijom traga igle ili lezijom u slučaju NMDA-ireverzibilnih lezija isključene su iz analize podataka (S1 tabela). U farmakološkim studijama isključili smo 57 životinja na ukupno 465 životinja zbog pogrešnog postavljanja igle (22/255 za Te2, 31/179 za ACC i 4/31 za hipokampus). U studijama praćenja, na 21 životinji, eliminisali smo 3 subjekta kod kojih je injekcija retrobeads promašila BLA. U optogenetskim studijama Te2, na ukupno 30 životinja, isključili smo 1 štakora jer položaj optičkih vlakana nije bio iznad ciljne regije, 1 pacov. Na kraju krajeva, virus je bio odsutan u Te2 i 2 štakora jer je difuzija virusa bila manja od 4,7% odnosno 5,3% površine Te2 na mjestima injekcije. Kod štakora uključenih u statističku analizu, minimalna difuzija virusa iznosila je 39,6% na prednjoj stereotaksičnoj koordinati i 50,2% na stražnjoj stereotaksičnoj koordinati.

Slično, u eksperimentima ACC optogenetike, na ukupno 32 životinje, 2 pacova su eliminisana jer postavljanje optičkih vlakana nije bilo iznad ciljne regije. Dva štakora su isključena jer je virus u ACC bio odsutan, 1 životinja jer je virus bio u susjednom sekundarnom motornom korteksu, a 1 štakor jer je difuzija virusa bila manja od 2,3% površine ACC na mjestima injekcije. Kod preostalih štakora, minimalna difuzija virusa bila je 33,3% na prednjoj stereotaksičnoj koordinati i 42,2% na stražnjoj koordinati.

U NMDA studijama lezija, lezije su uglavnom bile usmjerene na CA1 regiju dorzalnog hipokampusa. Minimalno (crveno) i maksimalno (ružičasto) proširenje hipokampalnih lezija na cijelom području dorzalnog hipokampusa iznosilo je 23,2% odnosno 53,5% na prednjoj stereotaksičnoj koordinati i 28,3% i 62,3% na stražnjoj koordinati. Od ukupno 73 životinje, 4 štakora su eliminisana jer je lezija izostala, dok su dodatne 3 životinje odbačene jer je proširenje lezija bilo manje od 5.0% (odnosno 4,8%, 4,3%, 3,1 %) koji se odnosi na područje hipokampusa na 2 koordinate.

Analiza konture područja izvršena je vizualnom inspekcijom i ručnim kvantificiranjem pomoću alata region-contour softvera ZEN 3.0. Vrijednosti površine su tada normalizirane na ukupnu površinu regije. Stereotaksične koordinate Te2, ACC i hipokampusa su bazirane na Paxinos atlasu [26] i, u slučaju Te2, sa kortikalnim poljem upućenim u Zillesov atlas [25].

Statistička analiza

Svi podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM. Svi podaci su prošli Levenov test za jednakost varijansi. Dakle, parametarska statistika je korištena u svim eksperimentima. Podaci iz 2 grupe su upoređeni korištenjem 2-repa neparenih Student t-testova. Poređenja više grupa su procijenjena korištenjem 1-way ANOVA testa sa Tukeyjevim post hoc testom. Da bismo odgovorili na razlike između i unutar grupa, izračunali smo 3 × 2 mješoviti dizajn ANOVA model sa grupom (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) kao između- varijabla subjekata i stanje (prije i nakon nedavnog kondicioniranja +injekcija) kao varijabla unutar subjekata. Tamo gdje je interakcija grupa × uvjet bila značajna, izvršili smo jednostavnu analizu glavnih efekata i prilagodili svaku p-vrijednost Bonferronijevom korekcijom. Za svaki mješoviti ANOVA model, procijenili smo pretpostavku sferičnosti kroz Mauchlyjev test sferičnosti.

Statistički parametri (tj. tačna vrijednost n za svaku grupu, SEM, statistički test, veličina efekta i tačna p-vrijednost) su navedeni u legendama. Za jednake veličine uzoraka, veličine efekta za neuparene t-testove određene su izračunavanjem Cohenovog d ili Glassovog d prema sličnosti SD-ova, dok je, za različite veličine uzorka, Hedges'g. Korelacije između broja ćelija i smrzavanja su izračunate korišćenjem Pearsonovog koeficijenta. Da bismo utvrdili da li podaci ispunjavaju pretpostavke statističkog pristupa, odbacili smo nultu hipotezu na nivou P < 0.05. Sve statističke analize su obavljene pomoću SPSS Statistics 22 (IBM).

Popratne informacije

S1 Slika Uvećanje tragova igle Te2 (A) i ACC korteksa (B) ubrizganih CNQX, odabranih kao primjeri. (C) Kada su predstavljene u istom kontekstu 2 sedmice nakon procedure, životinje koje su bile samo u šoku pokazale su nisku reakciju straha, pokazujući da postupak nije izazvao uvjetovano smrzavanje u kontekstu u kojem je šok isporučen. (D) Slični rezultati kao na slici 1 dobijeni su balansiranjem 2 tona koja se koriste kao CS (CS1, 3 kHz i CS2, 15 kHz) (Studentov t test, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, Glass's d=4.14). (E) Kod pacova kondicioniranih s mirisom-CS smrzavanje do mirisa, 2 sedmice nakon kondicioniranja, bilo je visoko čak i ako je testirano u drugačijem okruženju u vezi s kontekstom kondicioniranja, pokazujući na taj način da je strah bio specifično povezan s ovom isporukom signala. Skalirane šipke, 300 μm. ��P < 0,01. Svi podaci su srednji i SEM. Sažeti podaci za S1 Fig mogu se naći u pratećim informacijama u datoteci pod nazivom S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S2 Slika. CNQX injekcija je narušila zadržavanje nedavnih slušnih sjećanja na strah kod pacova gdje je generalizacija straha smanjena samo tonom prije izlaganja ili korištenjem tona bijelog šuma kao CS1. ANOVA 3 × 2 mješovitog dizajna (glavni efekat grupe: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0.236, glavni efekat uslova: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, grupa × interakcija uslova F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) pokazala je da je zamrzavanje na ton od 3 kHz prije njegovog povezivanja sa SAD bilo niže kod životinja koje su primile ton od 15 kHz prije uparivanja od 15 kHz-US (n=10, p=0.001) ili kod pacova kondicioniranih na bijeli šum (n=13 , p=0.008) u poređenju sa CS1-CS2 životinjama (n=22) koje su pokazale promjenjiv odgovor generalizacije straha. Međutim, nakon CS-US učenja i cnqx injekcija u Te2 korteks, nedavno pamćenje straha je oslabljeno u svim grupama (p > 0,05). Jednostavan glavni efekat unutar grupa (prije i nakon CS-US učenja praćenog cnqx injekcijom): CS1-CS2, p=0.025; Ton-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0,05, ��P < 0,01. Svi podaci su srednji i SEM. Zbirni podaci za S2 Fig mogu se naći u Podržavajućim informacijama u datoteci pod nazivom S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S3 Slika (A) Slučajni primjer ubrizgavanja retrobeads ciljanog na BLA. (B i C) Primjeri postavljanja optičkih vlakana iznad BLA životinja kojima su ubrizgani AAV vektori u Te2 (B) i ACC korteks (C). Skalirane šipke, 500 μm.

Priznanja

Zahvaljujemo dr. E. Manasseru na njihovoj kontinuiranoj podršci i savjetima.

Prilozi autora

Konceptualizacija: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Kurs podataka: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Formalna analiza: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Finansijska akvizicija: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Istraga: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Metodologija: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Nadzor: Benedetto Sacchetti.

Validacija: Benedetto Sacchetti.

Pismo – originalni nacrt: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Pisanje – recenzija i uređivanje: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Reference
1. Frankland PW, Bontempi B. Organizacija nedavnih i udaljenih sjećanja. Nat Rev Neurosci. 2005; 6:119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. Neurobiologija konsolidacija, ili koliko je stabilan engram? Annu Rev Psychol. 2004; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Konsolidacija memorije. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarez P, Squire LR. Konsolidacija memorije i medijalni temporalni režanj: jednostavan mrežni model. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Zašto postoje komplementarni sistemi učenja u hipokampusu i neokorteksu: uvidi iz uspjeha i neuspjeha konekcionističkih modela učenja i pamćenja. Psychol Rev. 1995; 102:419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com