Preventivni efekti feniletanol glikozida iz Cistanche Tubulosa

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Shu-Ping You, et al

Abstract

Pozadina:Cistanchetubulosaje tradicionalni kineski biljni lijek koji se široko koristi za regulaciju imuniteta.Phenyletanoildglikozidi(CPhG) iz ove biljke su prvenstveno efikasni materijali. Cilj ove studije bio je procijeniti preventivne i terapijske efekte CPhG na fibrozu jetre izazvanu BSA kod pacova i srodne molekularne mehanizme koji uključuju zvijezdaste ćelije jetre. Biejiarangan (BJRG), još jedan tradicionalni kineski biljni lijek, korišten je kao pozitivna kontrola.

Metode:U in vivo eksperimentima, 75 SD štakora je nasumično podijeljeno u 6 grupa: normalni (tretirani destiliranom vodom), model (tretirani BSA), pozitivni lijek (tretirani BSA plus BJRG 600 mg/kg/dan) i tretirani BSA plus CPhGs (125, 250 i 500 mg/kg/dan) grupe. Indeksi jetre i slezene, serumski nivoi aspartat aminotransferaze (AST), alanin aminotransferaze (ALT), heksadecenske kiseline (HA), laminina (LN), prokolagena tipa III (PCIII), kolagena tipa IV (IV-C), hidroksiprolina (Hyp ), i transformirajući faktor rasta 1 (TGF- 1) mjereni su u jetri pacova. Histopatološke ocjene za fibrozu jetre procijenjene su za svaku grupu korištenjem H&E i Masson-ovog trihromskog bojenja. Ekspresija TGF- 1, kolagena I (Col-I) i kolagena III (Col-III) određena je imunohistohemijskom metodom bojenja. Ovi efekti su dalje procenjeni in vitro određivanjem nivoa ekspresije NF-κB p65 i Col-I kvantitativnim PCR analizama u realnom vremenu. Ekspresija Col-I proteina je također ispitana Western blottingom.

Rezultati: Sve grupe doza (125, 250 i 500 mg/kg/dan) CPhG-a značajno su smanjile indeks jetre i slezene, smanjile ALT, AST, HA, LN , PCIII, IV-C nivoi u serumu, sadržaj TGF- 1 (P < 0.01,="" p="">< 0.01,="" i="" p="">< 0,01)="" i="" hyp="" sadržaj.="" cphg="" su="" takođe="" značajno="" ublažili="" oticanje="" ćelija="" jetre="" i="" efikasno="" sprečili="" nekrozu="" hepatocita="" i="" infiltraciju="" inflamatornih="" ćelija.="" imunohistohemijski="" rezultati="" su="" pokazali="" da="" cphg="" značajno="" smanjuju="" ekspresiju="" tgf-="" 1="" (p="">< 0,01,="" p="">< 0,01="" i="" p="">< 0,01),="" col-i="" i="" col-iii.="" in="" vitro="" efekti="" cphgs="" (100,="" 75,="" 50="" i="" 25="" ug/ml)="" na="" hsc-t6="" su="" pokazali="" da="" cphgs="" značajno="" smanjuju="" ekspresiju="" mrna="" nf-κb="" p65="" i="" col-i,="" a="" cphgs="" takođe="" smanjuju="" ekspresiju="" col-i="">

Zaključci:CPhG imaju značajan efekat anti-hepatične fibroze i mogu se koristiti kao hepatoprotektivni agensi za liječenje fibroze jetre.

Ključne riječi:fibroza jetre,Cistanche tubulosa,Phenyletanoildglikozid,Chemokine BSA, Prevencija i terapija

PhenyletanoildglikozidainCistanchetubulosa

Pozadina

Fibroza jetre je odgovor zacjeljivanja rana na tešku ozljedu jetre koja se javlja u patogenezi kroničnog hepatitisa izazvanog različitim faktorima. Ovi faktori su virusna infekcija, zloupotreba alkohola, kolestaza i metaboličke i autoimune bolesti [1–3]. Progresivno nakupljanje ekstracelularnog matriksa (ECM) i smanjeno remodeliranje remete normalnu arhitekturu jetre, što rezultira fibrozom jetre [4]. Fibroza jetre je kritična kod kronične bolesti jetre i često se razvija u ireverzibilnu cirozu i karcinogenezu. Trenutno ne postoje metode ili efikasni lijekovi za liječenje fibroze jetre. Stoga je hitno pronaći lijek protiv fibroze jetre koji će ublažiti progresiju ozljede jetre do fibroze i raka.

CistanchetubulosaW (iz porodice Orobanchaceae) je parazitska biljka koja se široko uzgaja u južnom regionu Xinjianga u Kini [5]. Ljudi ga obično koriste za jačanje bubrega, hranjenje krvi, opuštanje crijeva i odlaganje starenja. Zvanično je naveden u kineskoj farmakopeji [6].Cistanchetubulosasadrži različite aktivne komponente. To uključujePhenyletanoildglikozidi(CPhGs), iridoidi i polisaharidi. Kao jedna od mnogih aktivnih komponenti uCistanchetubulosa, CPhGshave je pokazao uvjerljive antioksidativne, anti-umorne, neuroprotektivne i antiinflamatorne efekte u in vivo i in vitro studijama [7]. Poslednjih godina objavljeno je da CPhG imaju hepatoprotektivne efekte. Potencijalni mehanizmi koji leže u osnovi ovih efekata su uklanjanje slobodnih radikala, zaštita jetrenih membrana, imunoregulacija, inhibicija apoptoze, inhibicija ekspresije HBsAg i HBeAg, i inhibicija replikacije HBV DNK i drugi [8-11]. Međutim, nekoliko studija u literaturi bavi se dejstvom GPhC na anti-hepatičnu fibrozu. Stoga je ova studija imala za cilj istražiti učinak GPhC-a ​​na anti-hepatičnu fibrozu korištenjem amodela goveđeg serumskog albumina (BSA) inducirane hepatične fibroze kod pacova. Srodni molekularni mehanizmi su istraženi u HSC-T6 ćelijama.

Metode

Hemikalije i reagensi

Hidroksiprolin komplet (alkalna hidroliza) (Lot:20140616) kupljen je od Nanjing Jiancheng Bioinženjering Instituta (Kina). Pacov TGF- 1 sendvič ELISA setovi (Lot: 238240615) su kupljeni od Lianke Biotech Co., Ltd. (Kina). Zečje anti-CollagenI antitijelo (Lot: 140619), Zečje Anti-Collagen III antitijelo (Lot: 980788 W) i zečje Anti-TGF- 1 antitijelo (Lot: 140619) je obezbijedila Beijing BiosynthesisBiotechnology Co., LTD ( Kina). U paketu sa normalnim ovčjim serumom (radna tečnost) (Lot: WP141214), PV-6000(Lot: WK141225) i DAB kompletom (Lot: K136621D) kupljeni su od Zhongshan Golden Bridge BiotechCo., Ltd. (Kina). Detekcija primarnih antitela obavljena je korišćenjem 2. rastvora antitela (Alk-Phos.Konjugovani, Anti-zečji) i 2. rastvora antitela (Alk-Phos. Konjugovan, Anti-miš) (lot: 272387) kupljen od kompanije Invitrogen (SAD) .

Goveđi serum albumin (BSA) (Lot: SLBG8239V) je kupljen od Sigme (SAD). Prije upotrebe, BSA je pripremljen na 18 g/L u normalnom fiziološkom rastvoru, bakterije su uklonjene filtracijom, a BSA čuvan na 4 stepena. Freundov nepotpuni adjuvans koji sadrži 1 g lipida iz ovčije dlake (Lot: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Kina,)) pomiješan je sa 2 g tekućeg parafina (Lot: 20130815, Tianjin Chemical Coyu Fine. Ltd. (Kina), sterilisan u parnom autoklavu i uskladišten na 4 stepena. Pozitivni lek BJRG je dobijen kao Biejiarangan tablete od Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (Kina). Zalihe lekova BJRG su pripremljene rastvaranjem BJRG tableta u destilovana voda u koncentraciji od 600 mg/kg.

Phenyletanoild glikozidainCistancheima preventivno dejstvo

Biljni materijali

Cistanche tubulosa(porodica Orobanchaceae) kupljena je iz regije Minfeng u Xinjiangu u Kini. Materijal je potvrdio istraživač Jun Zhao, Ključni laboratorij za ujgursku medicinu, Institut Materia Medica iz Xinjianga. Uzorci vaučera deponovani su u Institut Materia Medica u Xinjiangu.

Priprema CPhG

Osušeni i narezani rizomiCistanchetubulosa(60 kg) su uzastopno ekstrahovani pod refluksom tri puta sa 70% etanola, a rastvarač je uklonjen da bi se dobio etanolni ekstrakt. Etanolni ekstrakti su pročišćeni upotrebom AB-8 smole da bi se dobilofeniletanoidglikozidi(CPhGs). Osnovni rastvori CPhG-a koji se koriste za različite grupe doza u ispitivanjima na životinjama (500 mg/kg, 250 mg/kg, odnosno 125 mg/kg) su rastvoreni u 0,5 procenata (5 g/L) karboksimetil celuloze ( natrijumova so).

Kvantifikacija CPhG

Sadržaj dviju komponenti (ehinakozida i akteozida) u CPhG je određen HPLC-om korištenjem ranije objavljene metode (Zhang et al. 2004)[12]. HPLC je izveden korišćenjem Shimadzu LC-10AHPLC opremljenog UV detektorom. HPLC kolona je bila Phenomenex Gemini ODS kolona (250 × 4,6 mm, 5 μm). Izokratska mobilna faza se sastojala od metanol-acetonitril-1 posto octene kiseline (15:10:75, v/v/v). Eluiranje je trajalo 40 min, a brzina protoka je održavana na 0,6 mL/min. Temperatura kolone je održavana konstantnom na 30 stepeni. UV detekcija je bila na 334 nm.

Životinje i ćelijska linija HSC-T6

[Grade SPF] zdravi odrasli mužjaci Sprague–Dawley (SD) pacova (180–220 g) kupljeni su od Centra za životinje Medicinskog univerziteta Xinjiang, broj licence: SCXK (novo)2011–0004. Pacovi su hranjeni hranom bez specifičnih patogena (SPF). Sve procedure vezane za eksperimente na životinjama odobrio je Komitet za etiku životinja prve pridružene bolnice Medicinskog univerziteta Xinjiang. Pacovi su bili smešteni u kavezima u kontrolisanim uslovima okoline (25 stepeni i ciklus svetlosti/mraka od 12 sati) i imali su slobodan pristup standardnoj hrani za pacove i vodi iz slavine. Pacovi su se aklimatizirali prije tretmana.

Besmrtna zvjezdasta ćelijska linija jetre štakora, HSC-T6, dobijena je od Wuhan Procell Gene BiotechnologyCo., LTD. (Wuhan, Kina). HSC-T6 ćelije su kultivisane u Dulbecco-ovom modifikovanom orlovom medijumu (visoka glukoza) (DMEM, Peking, Kina) sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma (Gibco, Južna Amerika), 100 IU/ml penicilina i 100 ug/ml streptomicina (Beijing). ) u vlažnom inkubatoru na 37 stepeni sa 5 posto CO2.

Povreda jetre izazvana BSA i tretmani

Sedamdeset pet SD štakora je nasumično podijeljeno u šest grupa: normalni (tretirani destiliranom vodom), model (tretirani BSA), pozitivni lijek (tretirani BSA plus BJRG 600 mg/kg/dan) i grupe tretirane BSA plus CPhG (125, 250, 500 mg/kg/dan). Grupe tretirane BSA plus CPhGs (125, 250, 500 mg/kg/dan) imale su 13 pacova u svakoj grupi, a druga grupa je imala 12 pacova u svakoj grupi. BSA-indukovani model ozljede jetre podijeljen je na primarnu senzibilizaciju praćenu imunološkim napadom) [13]. Osim normalne grupe, drugim grupama su davane više subkutanih injekcija sa 0,5 ml (9 mg/ml) BSAFreundovog nepotpunog adjuvansa 1., 15., 22., 29. i 36. dan za primarnu senzibilizaciju. Sedam dana nakon pete injekcije, krv je uzeta kroz pleksus vene ratretine i testirana na antitijela na albumin u serumu. BSA antitijelo u serumu štakora detektirano je metodom difuzije na agaru. Napadna injekcija je izvedena davanjem 0,4 ml BSA u normalnom fiziološkom rastvoru kroz kaudalnu venu kod pacova pozitivnih na BSA antitela dva puta nedeljno po deset puta. Koncentracije i vremena injekcija su 5.00, 5.50, 6.00, 6.50,7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 i 10.00 g/L 46. dana , dan 50, dan 53, dan 57, dan 60, dan 64, dan 67, dan 71, dan 74 i dan 78, respektivno. U normalnoj grupi, normalna fiziološka otopina je korištena za imunološke primarne (senzibilizacija) i sekundarne (napad) injekcije umjesto BSA, a ostala stanja su bila ista kao i ona u grupi modela.

Normalnoj grupi je oralno davana destilovana voda u dozi od 10 ml/kg/dan. Grupi modela oralno je davana 10 ml/kg/dan 0,5 posto CMC-Na rastvora. Pozitivnoj grupi leka oralno je davana 600 mg/kg/dan BJRG. Grupe tretirane BSA plus CPhG (125,250 i 500 mg/kg/dan) oralno su davane 125, 250 i 500 mg/kg/dan CPhG-a, respektivno. Svakodnevno doziranje štakora je nastavljeno dvije sedmice nakon posljednje injekcije.

Nakon eksperimentalnog perioda, pacovi su gladni 12 sati prije 10 posto hloral hidrata, a zatim su odmah eutanazirani. Uzorci seruma su sakupljeni iz svakog ratanda koji je odmah korišten. Jetra su uzeta u dvije svrhe: (1) konzerviranje u tekućem dušiku za Hyp kits i (2) fiksacija u 10 posto formaldehida za histološke i imunohistohemijske pretrage. Ukupno trajanje studija na životinjama bilo je 93 dana.

Phenyletanoild glikozidainCistancheima preventivno dejstvo

Indeksi jetre i slezene

Jetra i slezena su secirane laparotomijom i isprane fiziološkim rastvorom 4 stepena. Nakon apsorpcije viška vode filter papirom, jetra i slezena su izmjerene kako bi se izračunali odgovarajući indeksi: Relativna težina organa=masa organa (g)/pojedinačna tjelesna masa (g) × 100 posto [14].

Analiza markera fibroze jetre

Zaštitni efekat CPhG protiv oštećenja jetre izazvanih BSA procenjen je merenjem ALT i AST (Mind ray automatski biohemijski analizator, A086A0182). Razvoj fibroze jetre i efekti lečenja utvrđeni su ispitivanjem HA, LN, PC III i IV-C (hemiluminiscencijski analizator, TaiGeKeXin, MP2808).

Hyp sadržaj i TGF- 1 analiza

Nivo Hyp u tkivu jetre određen je spektrofotometrijskom metodom prema uputstvima kompleta. Nivo Hyp je izražen kao Hyp (ug)/protein (mg).Hyp (ug/mg)=(Izmjereni OD - prazna OD)/(standardna OD prazna OD)×5 (ug/ml) × 10/vlažna težina tkiva (ml/mg). Koncentracija TGF- 1 u jetri je otkrivena korišćenjem ELISA kompleta prema uputstvima proizvođača. Inhibicijski efekat CPhG-a na fibrozu je potvrđen nivoima ekspresije TGF- 1.

Histopatološki pregled

Tkivo jetre u istom dijelu lijevog režnja je resecirano i fiksirano u 10-postotnom rastvoru formaldehida. Tkiva su obojena konvencionalnim H&E i Massonovim strikrom bojenjem kako bi se promatrale histopatološke promjene pod svjetlosnim mikroskopom. Ekspresija kolagena tipa I, kolagena tipa III i TGF- 1 u tkivima jetre analizirana je imunohistohemijskim bojenjem [15].

Semi-kvantitativna imunohistohemija je obavljena prema prijavljenim metodama [16, 17]. Sljedeće klasifikacije su korištene za TGF- 1 pozitivne ćelije: "-" označava skoro nikakav izraz, 20=l; " plus " označava pozitivne ćelije pojedinačno prikupljene u području lezije, 21=2; " plus plus " označava pozitivne ćelije u malim grupama okupljene oko područja lezije, 22=4; " plus plus plus " označava dispergirane pozitivne ćelije izražene, kao 23=8. Rezultati predstavljaju hijerarhijsku integraciju. Kromogeni stepen i opseg kolagena tipa I i kolagena tipa III pretvoreni su u CRI za statističku analizu (hromogeni stepen × hromogeni opseg). Hromogeni stepen se deli na slab " plus", umeren " plus plus " i jak " plus plus plus ". Kromogeni raspon je podijeljen na " plus ", njegov hromogeni raspon < pogled="" 1/4;="" "="" plus="" plus="" ",="" njegov="" hromogeni="" raspon="" vida/4-2/4;="" "="" plus="" plus="" plus="" ",="" njegov="" hromogeni="" raspon="" vida="" 2/4-3/4;="" "="" plus="" plus="" plus="" plus="" ",="" njegov="" hromogeni="" raspon=""> 3/4. Slijepo bodovanje su izvršile dvije osobe gdje je "plus" 1; " plus plus "je 2, " plus plus plus " je 3, a " plus plus plus plus " je 4. Tri polja za posmatranje mikroskopa (uvećanje × 200) su nasumično odabrana za svaki odjeljak, s prosječnim nivoom uzoraka koji se koristi kao polukvantitativni nivo.

Eksperimenti sa ćelijama

HSC-T6 ćelije su postavljene u ploču sa 96-jažicom. U početku, ćelije su kultivisane sa DMEM koji sadrži 10 procenat FBS tokom 48 h. Medijum je zatim zamenjen sa DMEM bez FBS da bi se ćelije izgladnjile 12 h. Ćelije su zatim kultivisane sa DMEM koji je sadržavao 5,0 ng/mLTGF- 1 (bez FBS) tokom 24 h. Konačno, različite koncentracije CPhG (100 ug/ml, 50 ug/ml i 25 ug/ml), akteozida (6 ug/ml, 3 ug/ml i 1,5 ug/ml), andehinakozida (500 ug/ml, 250 ug/ml). i 125 ug/ml) izvedeni su na ploči u četiri duplikata jažica i inkubirani 48 h.

PCR analiza u realnom vremenu

Nivo ekspresije mRNA NF-κB, p65 i kolagena I određen je PCR-om u realnom vremenu. Da bi se odredila ekspresija mRNA u HSC-T6 ćelijama, ćelije (4 × 105 ćelija) su zasijane u ploče sa šest jažica sa 3 mL DMEM sa 10 procenata FBS i inkubirane preko noći na 37 stepeni i 5 procenata CO2, nakon čega je podloge za ćelijsku kulturu su promijenjene na DMEM bez seruma. Zatim, CPhGs (100 ug/ml, 50 ug/ml i 25 ug/ml), akteozid (6 ug/ml, 3 ug/ml i 1,5 ug/ml) i ehinakozid (500 ug/ml, 250 ug /ml i 125 ug/ml) u jažice. Nakon 48 h inkubacije sa CPhG ili monomernim sastavima, ukupna RNK je ekstrahirana upotrebom TRIzol reagensa (Invitrogen, SAD) i snažno miješana hloroformom 15 s. Nakon sjedenja na sobnoj temperaturi 3 minute, lizat je centrifugiran na 12,000 × g 15 minuta na 4 stepena. RNK u vodenoj fazi precipitirana je izopropanolom, a gornja vodena faza je prebačena u novu mikrocentrifugalnu epruvetu. RNK je precipitirana dodavanjem 0,75 posto etanola, nakon čega je epruveta za mikrocentrifugu i centrifugirana na 12,000 × g na 4 stepena ne više od 5 min. Supernatant je uklonjen i RNA je sušena na sobnoj temperaturi 5-10 min. Specifični setovi prajmera (Sangon, Šangaj, Kina) koji su korišteni za amplificiranje aktina štakora [GenBank: NM_031144.3], Collagen I [GenBank: NM_ 053304.1], i NF- κB p65[GenBank: NM_199267.2] geni su dizajnirani koristeći Batch Primer 3. Prednji (FW) i reverzni (RV) prajmeri su bili sljedeći: Kolagen I (FW: GGA GAGAGC ATG ACC GAT GG, RV: GGG ACT TCT TGAGGT TGC CA), NF-κB p65 (FW: CAT ACG CTG ACCCTA GCC TG, RV: TTT CTT CAA TCC GGT GGCGA), -aktin (FW: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GATG, RV: AGA GGG CAG GGA CAA CAC A). Rezultati su normalizovani na mRNA kućnog gena -aktina kao interne kontrole i predstavljeni su kao relativni nivoi mRNA

Reakcije su izvedene sa 8 μL IQ SYBR GreenSupermixa, 1 μL 10 pM para prajmera, 8,5 μL destilovane vode i 2,5 μL cDNA. Svaka polimerazna lančana reakcija je izvedena pod sledećim uslovima: 95 stepeni u trajanju od 3 min, zatim 40 ciklusa od 10 s na 95 stepeni, 30 s na 55 stepeni i 10 s na 55 stepeni – 95 stepeni za produženje, nakon čega sledi merenje pojedinačne fluorescencije. Konačni rezultati su opisani relativnim vrijednostima (2-ΔΔCt). Proračun i analiza su obavljeni pomoću iQ5 PCR sistema za detekciju u realnom vremenu.

Western blot analiza

Nivoi ekspresije proteina kolagena I (Abcam, Cambridge, UK, br. art.: ab34710) određen je Westernblottingom [sa -aktinom (Lot: 60008-1-lg; Proteintech, Kina) kao kućnom kontrolom. Ekstrakti celih ćelija pripremljeni su korišćenjem radioimunoprecipitacionog testa (RIPA) (Thermo Scientific, SAD) pufera sa 1% koktela inhibitora Haltproteaze (Thermo Scientific, SAD) i 1% koktela inhibitora halt fosfataze (Thermo Scientific, SAD). Koncentracija proteina je mjerena i kvantificirana Bradfordovom metodom [18]. Protein (10-50 ug) je odvojen na 10% SDS-PAGE gelu i prebačen na PVDF membrane (Millipore, SAD). Membrane su blokirane 1 h na sobnoj temperaturi sa 5% BSA i primarnim antitelima (Anti-Colla gen I antitelo, razblaženje 1:200 ili mišje mAb od -aktina, 1:5000 razblaživanje) inkubirani su na 4 stepena preko noći. Odgovarajući Alk-Phos. konjugirana sekundarna antitijela su inkubirana na sobnoj temperaturi. Konačno, membrane su tri puta isprane sa 1 × Tris-HClsaline sa 0,1 posto Tween 20, a signali su skenirani i vizualizirani GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad). Denzitometrijska analiza je izvršena na proteinima od interesa i normalizovana na -aktin pomoću softvera GEL DOCImage Studio (Bio-Rad). -aktin je korišten kao interna kontrola.

Statistička analiza

Za provjeru normalnosti i homogenosti varijanse primijenjeni su Shapiro-Wilkov test normalnosti i Levenov test homogenosti varijanse. Analiza varijanse (ANOVA) praćena Tukeyjevim post hoc testom korištena je za identifikaciju statističkih razlika nehomogenih, normalno raspoređenih podataka. Kruskal-Wallisov neparametarski test korišten je za analizu podataka koji nisu normalno raspoređeni ili homogeni. Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SD. Značaj je postavljen na P < 0.05.="" svi="" podaci="" su="" analizirani="" softverom="" spss="" 16.0="" (medicinski="" univerzitet="">

Rezultati

Kvantitativno određivanje CPhGsCPhG uCistanchetubulosasadrži dvaPhenyletanoildglikozidi, ehinakozid i akteozid, a njihov sadržaj u CPhGs je utvrđen HPLC analizom (slika 1) na 42,71 ± 0,42 posto i 14,27 ± 0,18 posto, respektivno.

Indeksi jetre i slezene

Kao što je prikazano u Tabeli 1, indeksi jetre i slezene u grupi modela su značajno povišeni [P < 0.01,p="">< 0,05].="" indeksi="" jetre="" i="" slezene="" pozitivnog="" lijeka="" bjrg="" i="" cphg="" u="" različitim="" grupama="" doza="" bili="" su="" značajno="" smanjeni="" u="" poređenju="" sa="" modelnom="" grupom="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0.004," pliver="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024,PSpleen=0.070," respektivno].="" indeksi="" jetre="" i="" slezene="" bili="" su="" niži="" od="" onih="" u="" grupi="">

Efekti CPhG na ALT, AST aktivnosti i markere fibroze jetre

U ovoj studiji, serumski nivoi jetrenih enzima AST i ALT bili su značajno povećani u grupi modela, odražavajući hepatocelularno oštećenje kod pacova sa fibrozom jetre izazvano BSA. Međutim, eksperimenti su pokazali da tretman sa BJRG (600 mg/kg) i CPhGs (125, 250 i 500 mg/kg) značajno smanjuje AST[PAST < 0.001,="" past="">< 0.001,="" past="">< 0.001,="" past="">< 0.001,="" respektivno]="" i="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189" ,="" palt="0.255," respektivno]="" nivoi="" u="" jetrenoj="" fibrozi.="" (tabela="">

Nivoi HA, LN, PC i IV-C kod pacova modela bili su značajno povećani [PHA < 0.001,="" pln="">< 0.{{39}="" 01,="" ppciii="0.002," piv-c="">< 0,001,="" respektivno].="" u="" poređenju="" sa="" grupom="" modela,="" nivoi="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023," respektivno],="" ln="" [pln="0.011," pln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069," respektivno],="" pc="" iii[p="" pciii="" {{26="" }}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," respektivno],="" i="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" respektivno]="" kod="" pacova="" su="" značajno="" smanjeni="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" i="" cphg="" u="" različitim="" dozama="" grupa="" (125,="" 250="" i="" 500="" mg/kg="" )="" (tabela="">

Hyp sadržaj i TGF- 1

Sadržaj kolagena je takođe detektovan merenjem Hyplevels u tkivu jetre. Kao što je prikazano u Tabeli 4, srednji nivo Hyp u grupi modela bio je značajno veći nego u normalnoj grupi, ali je značajno smanjen u BJRG grupi i različitim grupama sa dozom CPhGs.

Hepatična koncentracija TGF{{0}} grupe modela kod pacova je značajno povećana [P < 0.001].="" u="" poređenju="" sa="" modelnom="" grupom,="" nivoi="" tgf-="" 1="" pozitivnog="" lijeka="" i="" različitih="" grupa="" doza="" cphg-a="" su="" značajno="" smanjeni="" [p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,p="" tgf{{10="" }}="">< 0,001,="" ptgf-="" 1="">< 0,001,="" respektivno].="" rezultati="" su="" sažeti="" u="" tabeli="">

Histopatološki pregled

Posmatranja normalnih dijelova tkiva jetre obojenih H&E i Massonovim trihromom pokazuju različite hepatiklobule i jetrene sinusoide. Struktura tkiva jetre kod modelnih pacova bila je poremećena, a tkivo jetre i jetreni sinusoidi zamijenjeni su velikom količinom vezivnog tkiva. Međutim, u liječenoj grupi otkrivena je normalnija citoarhitektura i manje vezivnog tkiva nego u grupi modela.

H&E bojenje

U normalnoj grupi uočen je strukturni integritet jetrenog lobula bez abnormalnih portalnih područja i jetrenih sinusoida. Jetrene vrpce bile su raspoređene uredno, sa jezgrom okrugla i bistra. Jezgra se nalaze u centru ćelije, sa obilnom citoplazmom. Samo područje portala ima malu količinu fibroznog tkiva (slika 2a).

U grupi modela lobularna struktura je bila ozbiljno oštećena. Ćelije jetre su pokazale blagu vodenastu degeneraciju, uglavnom balončastu degeneraciju i/ili masnu degeneraciju. Uočeno je i stvaranje inflamatorne ćelijske infiltracije, ekstenzivne hiperplazije fibroznog tkiva, formiranje velikog broja fibroznog septuma, podijeljenih lobula i značajne proliferacije ćelija jetre. Ova zapažanja su potvrdila uspjeh uspostavljanja životinjskog modela imunološke ozljede štakora. fibroza jetre (slika 2b).

U poređenju sa modelnom grupom, došlo je do smanjenja infiltracije inflamatornih ćelija u različitim CPhG. Takođe je uočeno manje nekroze i masne degeneracije ćelija jetre, kao i ublažavanje fibroze. CPhGs je značajno ublažio patologiju jetrene fibroze izazvane BSA kod pacova, ublažio oticanje jetrenih ćelija i efikasno spriječio nekrozu hepatocita i infiltraciju inflamatornih stanica, sugerirajući da CPhG ima zaštitni učinak na hepatičnu fibrozu kod pacova izazvanu BSA. (Slika 2c–f).

Massonovo trihromno bojenje

U normalnoj grupi tkivo jetre je bilo normalno. Područje portala jetre pokazalo je mali broj vlakana plavog kolagena, a tkivo jetre je bilo normalno strukturirano (slika 3a). U poređenju sa tkivom jetre normalne grupe, fibrozno tkivo je proliferisalo centralnim listićem i proširilo se u parenhim jetre. Kolagenska vlakna su se protezala i povezivala i obavijala čitav lobulu i okruživala centralnu venu. Ovi efekti, zajedno sa fibrozom hepatocita, lobularnim strukturnim oštećenjem, periportalnom fibrozom i formiranjem pseudolobula (slika 3b) pružili su dokaz da je model uspostavljen.

U poređenju sa modelnom grupom, kolagenska vlakna u pozitivnoj kontrolnoj grupi bila su blago proširena prema van od područja perifernog portala (slika 3c). U poređenju sa modelnom grupom, kolagenska vlakna u različitim grupama doziranja CPhGs su značajno smanjena, proliferacija vlakana je inhibirana, a proliferacija fibroznog tkiva unutar parenhima jetre značajno smanjena. Ovi rezultati sugeriraju da CPhGs štiti pacove od fibroze jetre izazvane BSA (Slika 3d–f).

Imunohistohemijsko bojenje

Važno je da ekspresija kolagena tipa I i kolagena tipa III igraju bitnu ulogu u razvoju fibroze jetre, a njihovo stvaranje i taloženje u tkivu jetre može poslužiti kao važna determinanta efikasnosti anti-hepatične fibroze. Rezultati su sažeti u tabeli 5.

Kolagen tip I

Normalna grupa je izrazila kolagen tipa I uglavnom u krvnim sudovima i portalnom području. Grupa modela imala je visoko izraženu vaskularnu fibrozu kolagena tipa I u portalnim područjima. U Disseovom prostoru, bojanje kolagena tipa I je uočeno kao pruga ili kao nejednaka distribucija. Kolagenom obložena fibrousepta formira pseudolobulu. U ovim eksperimentima formirano je manje fibroznih septa za BJRJ (600 mg/kg) i različite dozne grupe CPhG s (125, 250 i 500 mg/kg) [PCol I= 0.002, PCol I {{6 }}.001, PCol I=0.023 i PCol I=0.044, respektivno]. Semikvantitativni rezultati su otkrili da je ekspresija njihovog kolagena tipa I bila značajno niža u poređenju sa modelnom grupom (slika 4).

Kolagen tip III

Kolagen tip III bio je slabo izražen u normalnoj grupi, a periferna područja oko portalnih i hepatičnih vena su pokazivala malu količinu finih žutih umjesto kontinuiranih vlakana (slika 5a). U grupi modela, kolagenska vlakna su pokazala široke i debele niti, što ukazuje na snažnu ekspresiju, uglavnom locirane u području portala i fibroznog tkiva (slika 5b).

Kolagenska vlakna BJRJ (600 mg/kg) i različite doseggrupe CPhG (125, 250 i 500 mg/kg) bila su filamentozna i raspoređena oko centralnih vena i portalnih područja. U poređenju sa modelnom grupom, kolagenska vlakna su značajno smanjena, bojenje je bilo blijedo i tanko, a imunohistohemijsko bojenje je bilo slabo pozitivno (sl. 5c–f). Ovi semi-kvantitativni rezultati pokazuju da pozitivno izražene ćelije u pozitivnim i različitim dozama grupama [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PColIII=0.010 i PCol III=0.037, respektivno] su se razlikovali od onih u grupi modela.

TGF- 1

Bilo je malo ekspresije TGIF- 1 u normalnim jetrenim ćelijama pacova. Ekspresija je bila ograničena na mali broj intersticijskih ćelija (slika 6a). U grupi modela, ekspresija TGF- 1 bila je široko rasprostranjena u području portala, fibroznim prostorima, zvjezdastim ćelijama jetre, inflamatornim ćelijama, sinusoidnom zidu i citoplazmi. Određeno područje portala pokazalo je izrazito pozitivnu ekspresiju sa smeđkasto-žutim bojama (slika 6b)

Postojala je mala količina ekspresije u području portala i fibroznih septa BJRJ (600 mg/kg) i različitih doznih grupa CPhG (125, 250 i 500 mg/kg). Stepen pozitivnog bojenja u ovim grupama je značajno smanjen u poređenju sa modelom grupe. Bojenje u intersticijskim ćelijama u fibroznim septama i citoplazmi inflamatornih ćelija je smanjeno (sl. 6c–f). Semi-kvantitativni rezultati su otkrili da BJRJ i različite dozne grupe CPhG-a [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0.001,="" p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0." 004,="" respektivno]="" bili="" su="" značajni="" u="" poređenju="" sa="" modelskom="">

Kao što je ranije spomenuto u članku, TGF- 1 je važan citokin u patofiziologiji fibroze jetre, stimulirajući proizvodnju ekstracelularnog matriksa [19]. Pokazali smo da se nivo TGF- 1 povećava u grupi modela na način koji je u skladu sa ozbiljnošću fibroze jetre. Nivoi ekspresije TGF- 1 u jetri bili su u skladu sa nivoima TGF- 1 u serumu. Ovo ukazuje da CPhG mogu značajno smanjiti fibrozu jetre zbog ekspresije TGF- 1 učešćem u sintezi i degradaciji ECM.

Ekspresija kolagena tipa I, kolagena tipa III i TGF- 1 može otkriti patološki proces fibroze jetre. Njihovi nivoi ekspresije u tretiranim grupama su značajno smanjeni i ilustrovali su da CPhG mogu poboljšati aktivnost kolagenaze, održavajući dinamičku ravnotežu sinteze i degradacije jetrenih ECM, čime se odgađa i sprečava stvaranje fibroze jetre.

Ekspresija NF-κB p65 i kolagena I nakon intervencije lijeka u HSC-T6 stanicama

Kako bi se karakterizirali signali fibroze jetre, dva ključna regulatorna gena u jetri su određena putem RT-PCR testa. Podaci su pokazali da ćelije tHSC-T6 iz kontrolne grupe imaju niže nivoe NF κB i mRNA kolagena tipa I. S druge strane, TGF- 1 je inducirao HSC-T6 ćelije da značajno regulišu NF-κB (P < 0.01)="" i="" col-i="" (p="">< 0,01)="" mrna,="" sa="" nivoima="" višim="" od="" one="" u="" kontrolnoj="" grupi.="" u="" prisustvu="" različitih="" koncentracija="" cphg,="" rezultati="" nf-κb="" p65="" [p="" nf-κb="0.001" za="" 100="" ug/ml,="" p="" nf-κb="0.002" za="" 75="" ug/ml="" ,="" p="" nf-κb="0.007" za="" 50="" ug/ml,="" i="" p="" nf-κb="0.012" za="" 25="" ug/ml,="" respektivno]="" i="" col-i="" [p="" col-i="" {{32="" }}.006,="" p="" col-i="0.009," p="" col-i="0.014," p="" col-i="0.019," respektivno]="" su="" pokazali="" smanjenu="" ekspresiju="" ovih="" mrna="" (="" slika="">

Western blot analiza nivoa kolagena I nakon intervencije lijeka u HSC-T6 ćelijama

Slika 8 prikazuje nivoe ekspresije proteina kolagena I u ćelijama HSC-T6 različitih eksperimentalnih grupa. Nivo ekspresije proteina kolagena I je značajno smanjen u različitim doznim grupama CPhG (100 ug/ml, 75 ug/ml, 50 ug/ml, i 25 ug/ml) u poređenju sa TGF- 1 grupom.

Diskusija

CPhGs je feniletanoidni glikozid izoliran i pročišćen iz rizoma Cistanchea, koji se koristi kao tradicionalni kineski biljni lijek. Poslednjih godina pokazalo se da CPhGshad poseduje moćnu sposobnost da spreči povrede jetre [20]. Stoga smo imali za cilj da istražimo da li CPhG imaju inhibitorni učinak na fibrozu hepatitisa fibrozom jetre izazvanom BSA kod pacova. BJRG se obično koristi kao terapeutski lijek za fibrozu jetre u Kini. Napravljen je od oklopa kornjače. Radix PaeoniaRubra, Cordyceps Sinensis, Radix isatidis, itd. imaju efekte obnavljanja Qi-ja i krvi, ublažavanja umora, omekšavanja čvorova. Osim toga, prethodne studije pokazuju da ima očiglednu funkciju blokiranja rane fibroze jetre, inhibiranja proliferacije ćelija koje pohranjuju masti i smanjenja sinteze kolagena [21]. Stoga je BJRG korišten kao pozitivan lijek u ovoj studiji.

Patološke promjene fibroze jetre kod pacova izazvane injekcijama BSA slične su onima kod humane portalne ciroze [22]. CPhG su dozno-zavisno ublažili stepen fibroze jetre i inhibirali transformaciju HSC u ćelije slične miofibroblastu, smanjili povišene nivoe serumskih ALT, AST, HA, LN, CIV, TGF- 1 i indeksa jetre i značajno potisnuli ekspresiju kolagena I, kolagen III i TGF- 1 u tkivu jetre.

Faze fibroze jetre su u korelaciji sa nivoima HA, LN i IV-C u serumu, koji kao markeri mogu igrati ulogu u otkrivanju stepena fibroze jetre [23]. Prijavljeno je da je HA glavni resurs ekstracelularnog matriksa. IV-C kao esencijalni element bazalne membrane bit će sintetiziran u izobilju i u velikoj mjeri deponovan u ranijim fazama ciroze jetre. Nivoi LN i IV-C u serumu su indeksi stope rotacije bazalne membrane i pokazuju stepen fibroze u području portala i sinusoidnih kapilara [24]. PC III je marker u dijagnozi hepatične fibroze i rane ciroze, ali njegova osjetljivost i specifičnost nisu visoke, te postoji značajna razlika između različitih faza offibroze u mnogim referencama [24, 25]. Ova studija je dobila sličan rezultat.

Pored toga, H&E i Masson-ova zapažanja obojena trihromom pokazuju normalno tkivo jetre sa jasnim jetrenim lobulima i jetrenim sinusoidima. Struktura tkiva jetre u grupi modela bila je poremećena, a tkivo jetre i jetreni sinusoid zamenjeni su velikom količinom vezivnog tkiva. Međutim, uočeno je značajno poboljšanje u tretiranim grupama u poređenju sa modelnom grupom.

Važno je da ekspresija kolagena tipa I i kolagena tipa III igraju bitnu ulogu u razvoju jetrene fibroze, čije blokiranje može spriječiti i liječiti fibrozu jetre. Stoga, stvaranje i taloženje u tkivu jetre kolagena tipa I i kolagena tipa III može poslužiti kao važna determinanta efikasnosti anti-hepatičke fibroze. TGF- 1 je također važan profibrogeni citokin kod oštećenja jetre i biološki je aktivan sa višestrukim farmakološkim djelovanjem[26]. Za održavanje homeostaze tkiva potrebna je ravnoteža između ovih radnji. Aberantna ekspresija TGF 1 je uključena u patogenezu bolesti jetre [27, 28]. Poznato je da je TGF- 1 ključni citokin koji je uključen u ranim fazama fibroze jetre. Oksidativni stres izaziva TGF- 1, što rezultira time da potonji stimulira proizvodnju i taloženje ECM [29]. Stoga je jedna od efikasnih strategija za proizvodnju lijeka protiv fibroze jetre identifikacija anti-TGF- 1 agenasa. Imunohistohemijska analiza je pokazala da ekspresija kolagena tipa I, kolagena tipa III i TGF- 1 može otkriti patološki proces fibroze jetre. Ekspresija kolagena tipa I, kolagena tipa III i TGF- 1 u tretiranim grupama je smanjena, koja je bila značajno niža u grupi koja je primala visoke doze CPhGs-a, posebno, i sugerira da je CPhGs efikasan kolagen tipa I, kolagen tipa III i TGF- 1 inhibitor. Pretpostavlja se da CPhG može poboljšati aktivnost kolagenaze, održavajući dinamičku ravnotežu sinteze i degradacije ECM, odgađajući i sprječavajući nastanak fibroze jetre.

CPhG ne samo da bi mogli poboljšati hepatičnu fibrozu izazvanu BSA kod pacova, već bi također mogli biti povezani sa inhibicijom aktivacije HSC in vitro. Smatra se da aktivacija HSC predstavlja ključni korak fibrogeneze. U ovoj studiji, rezultati su ilustrirali da primjena CPhG-a od 25 do 100 ug/ml značajno smanjuje smanjenu ekspresiju NF-κB p65, ekspresiju mRNA kolagena I i ekspresiju proteina kolagena I u HSC.

NF-κB igra važnu ulogu u modulaciji imunološkog odgovora na infekciju ili podražaje [30]. Nagomilavanje NF-κB u ćelijama jetre može rezultirati regrutacijom upalnih citokina/medijatora, izazivajući tako razvoj fibroze [31, 32]. Štaviše, kolagen je takođe osetljiv indeks koji odražava nivo fibroze i čini oko 50 procenata ukupnog proteina u fibroznoj jetri [33]. Kao rezultat toga, pretpostavili smo da je molekularni mehanizam protiv fibroze jetre povezan sa CPhGs posredovanom inaktivacijom ekspresije NF-κB, u kojoj korist doprinosi sinergističkoj ulozi ublažavanja imunotoksičnosti i upalnog stresa u BSA-oštećenim funkcijama jetrenog tkiva, poboljšavaju funkcije jetrenog tkiva.

Zaključci

U zaključku, naše studije pokazuju da CPhG značajno smanjuju opseg fibroze jetre izazvane BSA kod pacova. Njegov mehanizam može barem djelomično biti posljedica inhibitornog efekta CPhG na sastav ECM i stimulacije degradacije ECM, i/ili direktnog inhibicije sinteze kolagena tipa I, kolagena tipa III i ekspresije TGF{{0 }}. Stoga smo očekivali da se CPhG mogu koristiti u zdravstvenim proizvodima ili u kliničkim lijekovima za prevenciju humane fibroze jetre. Potrebne su buduće studije kako bi se utvrdila efikasnost CPhG-a kao snažnog lijeka protiv hepatične fibroze.

Skraćenice

CPhGs: anol glikozidi iz cistanche;

BSA: goveđi serum albumin;

HSC-T6: zvijezdaste ćelije jetre;

Hyp: Hidroksiprolin;

BJRG: CompoundBiejiarangan tablete;

TGF- 1: Transformirajući faktor rasta 1;

ALT: alaninaminotransferaza;

AST: Aspartat aminotransferaza;

HA: hijaluronska kiselina;

LN: Laminin; PC III: prokolagen tipa III;

IV-C: kolagen tipa IV;

NF-κB: Nuklearni faktor kapa-pojačavač lakog lanca aktiviranih B ćelija;

RT-PCR: lančana reakcija reverzne transkriptaze-polimeraze;

SDS-PAGE: Natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gel elektroforeza.

Konkurentni interesi

Autori izjavljuju da nemaju suprotstavljene interese

Doprinosi autora

TL, JZ, SPY, LM, MT i SLZ su osmislili i dizajnirali eksperimente. SPY, TL i JZ su analizirali podatke. SPY i JZ su napisali rukopis. TL, LM i JZ pregledali su rukopis. Svi autori su pročitali i odobrili konačni rukopis.

Priznanje

Ovo istraživanje je podržala Nacionalna fondacija za prirodne nauke Kine (81260624). Autori bi željeli izraziti iskrenu zahvalnost profesoru Tao Liuu na predloženim poboljšanjima za pisanje ovog rada.

Autor pojedinosti

1Odjel za toksikologiju, Škola javnog zdravlja, Medicinski univerzitet u Xinjiangu, br. 393 Xinyi Road, Urumqi 830011 Autonomna regija Xinjiang Uyghur, Kina. 2 Ključna laboratorija za ujgursku medicinu, Institut MateriaMedica iz Xinjianga, Urumqi 830004, Kina. 3Br. 140 Xinhua South Road, Tianshan District, Urumqi 830000 Xinjiang Uyghur Autonomous Region, Kina.

Kliknite ovdje da provjeriteCistanchetubulosaproizvodi

Reference
1. Cohen-Naftaly M, Friedman SL. Trenutni status novih antifibrotskih terapija u bolesnika s kroničnom bolešću jetre. Ther Adv Gastroenterol. 2011;4(6):391–417.
2. Puche JE, Saiman Y, Friedman SL. Zvezdaste ćelije jetre i fibroza jetre. Compr Physiol. 2013;3(4):1473–92.
3. Hernandez-Gea V, Friedman SL. Patogeneza fibroze jetre. Annu Rev Pathol. 2011;6:425–56.
4. Sohrabpour AA, Mohamadnejad M, Malekzadeh R. Pregledni članak: reverzibilnost ciroze. Aliment Pharmacol Ther. 2012;36(9):824–32.
5. Raven PH, Zhang LB, Ventenat O. Kineska akademija nauka. 23. ed. Kina: Redakcija Flora of China; 2013. str. 1–16.
6. Kineska farmakopejska komisija Ministarstva sanitarne zaštite Narodne Republike Kine. Kineska farmakopeja, Dio 1. Kina: Izdavačka kuća hemijske industrije; 2010. str. 126.
7. Yan GH, Tian JH, Long BW, Li N. Napredak istraživanjafeniletanoidglikozidiodCistanchetubulosa. Central South Pharm. 2012;10:692–5.
8. Li J, Huang D, He L. Efekat Rou Cong Ronga (Herba Cistanches Deserticolae) na reproduktivnu toksičnost kod miševa izazvanu glikozidom Leigongtenga (Radix et Rhizoma Tripterygii). J Tradit Chin Med. 2014;34(3):324–32.
9. Xing Y, Liao J, Tang Y, Zhang P, Tan C, Ni H, et al. ACE i inhibitori agregacije trombocita iz Tamarix hohenackeri Bunge (biljka domaćinHerbaCistanches) raste u Xinjiangu. Pharmacogn Mag. 2014;10(38):111–7.
10. Jia Y, Guan Q, Jiang Y, Salh B, Guo Y, Tu P, et al. Poboljšanje kolitisa izazvanog dekstran sulfatom natrijumom kod miševa pomoću ekstrakta obogaćenog ehinakozidomCistanchetubulosa. Phytother Res. 2014;28(1):110–9.
11. Wong HS, Ko KM. Herba Cistanches stimuliše ćelijski redoks ciklus glutationa pomoću reaktivnih vrsta kiseonika nastalih mitohondrijalnim disanjem u H9c2 kardiomiocitima. Pharm Biol. 2013;51(1):64–73.
12. Zhang SJ, Liu L, Yu JY. ARP: RP-HPLC metoda za istovremeno određivanje ehinakozida i akteozida u Herbie Cistanches. Chin Pharm J 2004; 39(10): 740-741.
13. Zhu QG, Fang BW, Zhu QN, Wu HS, Fu QL. Studija životinjskog modela fibroze jetre izazvane goveđim serumskim albuminom. Chin J Pathol. 1993;22:121–2.
14. Qin DM, Wen ZP, Nie YR, Yao GM. Utjecaj ekstrakta Cichorium glandulosum na CCl4-indukovanu fibrozu jetre. Iran Red Crescent Med J. 2013;15, e10908.
15. Niu HM, Zeng DQ, Long CL, Peng YH, Wang YH, Luo JF, et al. Clerodane diterpenoidi i prenilirani flavonoidi iz Dodonaea viscosa. J Asian Nat Prod Res. 2010;12(1):7–14.
16. Li WW, Song XW, Wang HW, Shen BS, Wang QC. Korelacija NF-κB i patološkog stadija fibroze jetre kod pacijenata sa hroničnim hepatitisom B. Chin J Immunol. 2013;29(3):251–4.
17. Zhang GL, Shi XF, Ran CQ, Xu M, Zhu ZJ. Efekti ukupnih saponina Panax notoginseng protiv fibroze jetre kod pacova. Acta Academiae Medicinae Militaris tercijar. 2007;29:2212–4.
18. Rossi O, Maggiore L, Necci F, Koberling O, MacLennan CA, et al. Poređenje kolorimetrijskih testova sa kvantitativnom analizom aminokiselina za kvantifikaciju proteina generalizovanih modula za membranske antigene (GMMA). Mol Biotechnol. 2015;57(1):84–93.
19. Dang SS, Li YP. Napredak u razumijevanju uloge transformirajućeg faktora rasta- 1 u patogenezi fibroze jetre. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2010;18:1631–6.
20. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z, et al. Zaštitni učinak akteozida na imunološko oštećenje jetre uzrokovano Bacillus Calmette-Guerin plus lipopolisaharidom. Planta Med. 2009;75(14):1463–9.
21. Yang FR, Fang BW, Lou JS. Efekti Fufang Biejia Ruangan pilula na fibrozu jetre in vivo i in vitro. Svjetski J Gastroenterol. 2013;19(32):5326–33.

22. Liu P, Fang BW, Liu C. Uloga transformirajućeg faktora rasta 1 i njegovog receptora u imunološki indukovanoj fibrogenezi jetre kod pacova i učinak kordiceps polisaharida na njih. Chin J Hepatol. 1998;6:232–3.

23. Xu GG, Luo CY, Wu SM, Wang CL. Odnos između stadija jetrefibroze i nivoa biohemije u serumu. HBPD INT. 2002;1:246–8.Vi et al. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Stranica 12 od 13

24. Liu J, Wang JY, Lu Y. Markeri serumske fibroze u dijagnostici fibroze jetre. BradaJ Intern Med. 2006;145:475–7.

25. Li CZ, Wan MB, Zeng MD, Mao YM, Fan ZP, Cao AP, et al. Preliminarna studija kombinacije neinvazivnih parametara u dijagnozi fibroze jetre. Chin J Hepatol. 2001;9:261–3.

26. Chen YL, Li ZY. Odnos između TGF- 1, PDGF-BB, CTGF i hroničnog hepatitisa B sa fibrozom. Chin J Diffic Compl Cas. 2010;9:19–20.

27. Sferra R, Vetuschi A, Catitti V, Ammanniti S, Pompili S, Melideo D, et al. Ekstrakti Boswellia serrata i Salvia miltiorrhiza smanjuju fibrozu jetre izazvanu DMN kod miševa smanjenjem TGF-beta1. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2012;16(11):1484–98.
28. Liu L, Li XM, Chen L, Feng Q, Xu LL, Hu YY, et al. Efekat gipenozida na TGF- 1/Smad put u fibrozi jetre izazvanoj ugljen-tetrahloridom kod pacova. Intern J Integr Med. 2013;1:1–6.
29. Zhang BJ, Xu D, Guo Y, Ping J, Chen LB, Wang H. Zaštita antioksidativnim mehanizmom berberina protiv fibroze jetre štakora izazvane višestrukim hepatotoksičnim faktorima. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2008;35(3):303–9.
30. Tornatore L, Thotakura AK, Bennett J, Moretti M, Franzoso G. Signalni put nuklearnog faktora kapa B: integracija metabolizma s upalom. Trends Cell Biol. 2012;22(11):557–66.
31. Luedde T, Schwabe RF. NF-κB kod ozljede povezivanja jetre, fibroze i hepatocelularnog karcinoma. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2011;8(2):108–18.
32. Petrasek J, Csak T, Szabo G. Toll-like receptors in the seal disease. Adv Clin Chem. 2013;59:155–201.
33. Wang Y, Cheng M, Zhang B, Nie F, Jiang H. Dodatak ishrani soka od borovnice povećava ekspresiju metalotioneina u jetri i ublažava fibrozu jetre kod pacova. PLoS One. 2013;8, e58659.