Priprema i primjena Cistanche glikozida metodom enzimske hidrolize

Abstract: Istraživanje pripreme glikozida Cistanche enzimskom hidrolizom i istraživanje njegove primjene. Koristeći stopu ekstrakcije Cistanche glikozida kao indikatora evaluacije, za ekstrakciju Cistanche glikozida korištena je metoda enzimske hidrolize, a određena je tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC). Konstruiranjem modela miša koji stari, glikozidi Cistanche deserticola pripremljeni enzimskom hidrolizom primijenjeni su na miševe modela koji stare, te su uočene sposobnosti učenja i pamćenja miševa modela koji stare, kao i detekcija nivoa oksidacije moždanog tkiva. Rezultati su pokazali da su optimalni uslovi za ortogonalni eksperiment enzimske hidrolize bili: kada je odnos materijala i tečnosti bio 1:10, vremena ekstrakcije su bila 3 puta, temperatura ekstrakcije je bila 80 stepeni, a vreme ekstrakcije 1 minut, stopa ekstrakcije glikozida Cistanche deserticola bila je najveća. U poređenju sa kontrolnom grupom, efekat glikozida Cistanche na miševe koji su stari model značajno je poboljšao njihove sposobnosti učenja i pamćenja (P<0.05); After treatment with cistanche glycoside, the content of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in brain tissue of aging model mice increased significantly (P<0.05), while the content of malondialdehyde (MDA) decreased significantly (P<0.05). In this study, the preparation method of Cistanche glycosides was optimized and the anti-aging ability of Cistanche glycosides was tested. This study laid a theoretical and practical foundation for the further development and clinical application of Cistanche glycosides in the future.  

Feniletanol glikozid je glavna aktivna komponenta Cistanche deserticola

Ključne riječi: metoda enzimske hidrolize; Cistanche glycoside; Starenje modela miševa; Antioksidans; istraživanje primjene

1 Eksperimentalni dio

1.1 Glavni materijali, reagensi i instrumenti

Zdravi mužjaci ICR miševa, Beijing Huizhi Heyuan Biotechnology Co., Ltd; Cistanche glikozid, Anyang Yishoutang Pharmaceutical Chain Co., Ltd; Standard glikozida Cistanche (čistoća veća ili jednaka 99.0 posto), Wuhan Huashun Biotechnology Co., Ltd; Unutrašnja Mongolija Beiqi, Shanxi Beiqi, Unutrašnja Mongolija Cistanche glikozid specijalne klase, Unutrašnja Mongolija Cistanche glikozid prve klase, Unutrašnja Mongolija Cistanche glikozid druge klase, Shanxi Heipi Qi AA razred, Shanxi Heipi Qi A, Gansu Cistanche, svi Gansu Cistanche kupovina; Metanol, etanol, analitički alkohol, Nanjing Datang Chemical Co., Ltd; SOD, MDA i CAT kompleti, Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd.

DFY400 okretna brza brusilica za tradicionalnu kinesku medicinu, Zhejiang Wenling Dade Traditional Chinese Medicine Machinery Co., Ltd; SHZ-D vakuum pumpa za cirkulaciju vode, Gongyi Yuhua Instrument Co., Ltd; 101-1Y infracrvena pećnica za sušenje, Hangzhou Lantian Laboratory Instrument Factory; U2001 Ultraljubičasti spektrofotometar, Hitachi, Japan; Aglient 1100 LC tečna hromatografija visokih performansi, Agilent Technologies, SAD; 6511 električni mikseri, Šangajska fabrika modela uzoraka; PHS-3C mjerač kiselosti, Shanghai Ridao Scientific Instrument Co., Ltd; DF-500 mašina za sušenje zamrzavanjem, Baokun Vacuum Technology Co., Ltd.

Cistanche ekstrakt u prahu

Kliknite ovdje da pogledate Cistanche proizvode

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

1.2 Eksperimentalne metode

1. 2. 1. Tretman i ekstrakcija uzoraka glikozida Cistanche

Koristeći stopu ekstrakcije Cistanche glikozida kao indeks evaluacije, za istraživanje je korišten L9 (34) ortogonalni eksperimentalni dizajn. Specifični dizajn šeme prikazan je u tabeli 1.

Tab. 1 Tabela nivoa faktora

Precizno izmjerite 100,0 g uzorka glikozida Cistanche, osušite ga u sušionici, zgnječite, procijedite kroz sito od 60 mesh i ekstrahirajte Cistanche glikozid iz hidrolizata samoenzima Scutellaria baicalensis prema ortogonalnoj eksperimentalnoj shemi u tabeli 1 [13,14].

1. 2. 2. Određivanje sadržaja Cistanche glikozida

Koristite UV-vidljivi spektrofotometar da odredite sadržaj Cistanche glikozida. Precizno izmjerite 0.5 mL ekstrakta glikozida Cistanche i pomiješajte ga sa 4,5 mL ultra čiste vode. Dodajte 0.5 mL 5% rastvora natrijum nitrita i ostavite da odstoji 5 minuta. Zatim dodajte 0.5 mL 10 procentnog rastvora aluminijum nitrata. Lagano promiješajte i ostavite da odstoji 6 minuta. Zatim dodajte 4 mL 1,0 mol/L rastvora natrijum hidroksida. Lagano promiješajte i ostavite da odstoji 15 minuta. Mjerite na talasnoj dužini od 510 nm između ultraljubičastog i vidljivog svjetla.

Eksperiment s cistanche deserticola

1. 2. 3 HPLC analiza

Korištenje Kromasil C18 kolone (250 mm × 4,6 mm, 5 μ m) Sobna temperatura, volumen ubrizgavanja 20 μL. Brzina protoka 1 mL/min, A-faza voda, B-faza acetonitril. Procedura eluiranja: 0-5 minuta, 5 posto faza B, 95 posto faza A; 5-8 minuta, 5 posto -8 posto faza B, 95 posto -92 posto faza A; 8-15 minuta, 20 posto faza B, 80 posto faza A; 15~18 minuta, 20% ~30% faza B, 80% ~70% faza A; 18-35 minuta, 30 posto -45 posto faza B, 70 posto -55 posto faza A; 35~38 minuta, 45% ~80% faza B, 55% ~20% faza A. Talasna dužina detekcije je 254 nm.

1. 2. 4 Grupisanje životinja i administracija

Odabrano je 72 zdrava mužjaka ICR miša koji su nasumično podijeljeni u 4 grupe, sa po 18 miševa u svakoj grupi: kontrolna grupa (Con grupa), grupa modela (Mod grupa), pozitivna kontrolna grupa (PC grupa) i grupa cistanche glikozida (HQ grupa ). Miševi kontrolne grupe primali su oralnu primjenu dvostruko destilovane vode i supkutanu injekciju izotonične fiziološke otopine; Miševima u grupi modela oralno je davana dvostruko destilovana voda i hipodermalno im je ubrizgana 400 mg/kg D-neneneba galaktoze; U pozitivnoj kontrolnoj grupi oralno je primijenjeno 800 mg/kg piracetama, a subkutano je ubrizgano 400 mg/kg D-neneneba galaktoze; Miševima u grupi cistanche glikozida je dato 400 mg/kg astragalozida (doza je određena u preliminarnom eksperimentu; Shanxi Beiqi) oralno, a 400 mg/kg D-neneneba galaktoze je ubrizgano subkutano. Svim eksperimentalnim miševima davana je oralno i subkutano 10 uzastopnih sedmica. Izmjerite svakog miša svake sedmice i pažljivo pratite fizičko stanje svake grupe miševa. U 9. sedmici, nakon oralne primjene i supkutane injekcije u trajanju od 30 minuta, svaka grupa miševa je podvrgnuta skakanju s platforme i testovima izbjegavanja mraka. U 10. sedmici, Morrisov test vodenog lavirinta izveden je na svakoj grupi miševa. U 11. sedmici, uzeto je moždano tkivo svake grupe miševa da bi se odredio sadržaj superoksid dismutaze (SOD), katalaze (CAT) i malondialdehida (MDA) u moždanom tkivu.

1. 2. 5 Mjerenje sposobnosti učenja i pamćenja kod ostarjelih miševa

1) Eksperiment izbjegavanja

Prije eksperimenta, miševi su stavljeni na instrument i aklimatizirani 3 minute. Nakon potpunog prilagođavanja mračnom instrumentu i okruženju, miševi su vraćeni u kavez za uzgoj. Zatim su miševi bili izloženi kontinuiranom strujnom udaru dok su stajali na podu. Nakon šoka, miševi su instinktivno pobjegli s poda na platformu, a cijeli proces treninga trajao je 5 minuta. Nakon što je eksperiment završen, prebrojan je ukupan broj puta kada su miševi dobili strujni udar, što je broj grešaka izbjegavanja mraka.

Pustinjski živi cistanche

2) Eksperiment sa platformom za skakanje

Eksperimentalna sprava za skakanje je 45 cm × 35 cm × 25 cm organska staklena kutija sa unutarnjom pregradom, a sa lijeve i desne strane postavljena je gumena podloga prečnika 9,5 cm i visine 4,5 cm. mreže. Dno kutije je prekriveno bakrenim rešetkama kao stimulacijskim elektrodama. Kada je podvrgnut stimulaciji strujnog udara, miš će pobjeći na sigurnu platformu i potom skočiti s platforme. Kada stopala miša dođu u kontakt sa električnom mrežom i dožive električni udar, to je odgovor na grešku. Zabilježite broj grešaka i kašnjenje miša u roku od 3 minute. Nakon 24 sata, test je ponovo mjerio sposobnosti učenja i pamćenja miševa na osnovu broja grešaka i kašnjenja.

3) Eksperiment vodenog lavirinta

Prije eksperimenta, miševi su stavljeni u uređaj za vodeni labirint i ostavljeni da slobodno plivaju 2 minute kako bi se prilagodili okolini.

Eksperiment pozicioniranja navigacije [15]: Zabilježite vrijeme kada miševi pronađu platformu.

Eksperiment istraživanja svemira [16]: zabilježite vrijeme prelaska miševa preko platforme.

1. 2. 6 Određivanje sadržaja antioksidansa u moždanom tkivu 6 ostarjelih miševa

Nakon odvajanja mišjeg moždanog tkiva prema konvencionalnim metodama, mjeren je sadržaj SOD, MDA i CAT u moždanom tkivu svake grupe miševa prema koracima operacije SOD, MDA i CAT kompleta.

1.3 Statistika i analiza podataka

U ovoj studiji, svi podaci su statistički analizirani korištenjem Excel tabela i SPSS19.{1}} softvera, a međugrupne razlike su evaluirane korištenjem uparenih t-testova. Kada je P<0.05, it indicates statistical significance; When P<0.01, it indicates significant statistical significance.

2 Rezultati i diskusija

2.1 Ortogonalni eksperiment

Tabela 2 prikazuje rezultate ortogonalnog eksperimenta za glikozide Cistanche. Iz tabele 2 se može videti da je optimalni proces ekstrakcije A3B1C2D3, sa temperaturom ekstrakcije od 80 stepeni, vremenom ekstrakcije od 1 minuta, odnosom čvrsta i tečnost od 1:10 i tri vremena ekstrakcije. Postiže se najveći stepen ekstrakcije Cistanche glikozida.

Tab. 2 Ortogonalni eksperiment sa Cistanche glikozidom

2.2 Određivanje sadržaja Cistanche glikozida

UV vidljiva spektrofotometrija je korištena za detekciju ekstrakta 8 uzoraka glikozida cistanche. Rezultati su prikazani na slici 1, a postoje značajne razlike u sadržaju cistanche glikozida između različitih regija ili sorti. Među njima, Shanxi Beiqi ima najveći sadržaj cistanche glikozida, dok Shanxi Heipi Qi ima najniži sadržaj cistanche glikozida AA.

Slika 1 Određivanje različitih vrsta Cistanche glikozida

2.3 HPLC detekcija Cistanche glikozida

Prema hromatografskim uslovima određenim u Odjeljku 1.2.3, HPLC dijagram Cistanche glikozida je prikazan na slici 2. Vrijeme zadržavanja Cistanche glikozida je 10.64 minuta, a masena koncentracija je 1.{{ 7}}.0 μ G/mL, sa dobrom linearnošću i R-vrijednošću od 0.999 8.

Slika 2 HPLC dijagram Cistanche glikozida

2.4 Preciznost i stabilnost

Uzmite istu seriju test rastvora glikozida Cistanche i ubrizgajte 6 uzastopnih puta da biste odredili površinu vrha Cistanche glikozida. Rezultati su pokazali da je preciznost RSD Cistanche glikozida manja od 2,5 posto (n=6), što ukazuje na dobru preciznost Cistanche glikozida.

Uzmite istu seriju otopine za ispitivanje glikozida Cistanche i izmjerite površinu vrha Cistanche glikozida na {{0}}, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, odnosno 24 sata. Rezultati su pokazali da je RSD stabilnost glikozida Cistanche bila manja od 2,0 posto (n=6), što ukazuje da je Cistanche glikozid imao dobru stabilnost u roku od 24 sata.

2. 5 Utjecaj glikozida Cistanche na tjelesnu težinu starijih modelnih miševa

Referenca [17-19] otkrila je da doza glikozida Cistanche korištena u ovoj studiji nije izazvala sistemsku toksičnost kod miševa. Kao što je prikazano na slici 3, težina svih grupa miševa se povećala prije 6. sedmice. U poređenju sa kontrolnom grupom, težina miševa modelne grupe značajno se smanjila tokom istog perioda (P<0.01), while the weight of the positive control group and astragalus group mice slightly decreased. After the 6th week, the weight of the control group mice continued to increase, while the weight of the model group mice no longer increased. The positive control group and the Cistanche glycoside group slightly increased.

Slika 3. Utjecaj glikozida Cistanche na tjelesnu težinu starijih modelnih miševa

2.6 Rezultati eksperimenta u ponašanju

2. 6. Promatranje efekta glikozida Cistanche Cistanche na miševe koji stare modele kroz eksperiment izbjegavanja tame

Kao što je prikazano na slici 4A, period latencije miševa u svakoj grupi bio je produžen drugog dana u odnosu na prvi dan. U poređenju sa kontrolnom grupom, vrijeme latencije miševa modelne grupe je značajno smanjeno (P<0.05); Compared with the model group, the latency time of mice in the positive control group and the Cistanche glycoside group was significantly increased (P<0.05). As shown in Figure 4B, the number of errors in each group of mice decreased on the second day compared to the first day. Compared with the control group, the number of errors in the model group mice significantly increased (P<0.05); Compared with the model group, the positive control group and the Cistanche glycoside group significantly reduced the number of errors in mice (P<0.05).

2. 6. Promatranje efekta glikozida Cistanche Cistanche na starenje modelnih miševa kroz eksperiment na platformi u dva koraka

Kao što je prikazano na slici 5, vrijeme latencije platforme za skakanje u svakoj grupi miševa je produženo drugog dana u odnosu na prvi dan. U poređenju sa kontrolnom grupom, vrijeme skakanja kod miševa modelne grupe je značajno smanjeno (P<0.05); Compared with the model group, the latency time of the jumping platform in the positive control group and the Cistanche glycoside group of mice was significantly increased (P<0.05). As shown in Figure 4B, the number of errors in each group of mice decreased on the second day compared to the first day. Compared with the control group, the number of errors in the model group mice significantly increased (P<0.05); Compared with the model group, the positive control group and the Cistanche glycoside group significantly reduced the number of errors in mice (P<0.05).

U poređenju sa kontrolnom grupom, P<0.05; Compared with the control group, P<0.01; Compared with the model group, the '#' is P<0.05; Compared with the model group, P<0.01, the same below

Slika 4 Eksperimenti izbjegavanja mraka za promatranje efekta glikozida Cistanche na miševe koji su stari. Vrijeme kašnjenja （A）; Broj grešaka （B）

Slika 5. Efekat glikozida Cistanche na miševe modela starenja uočen eksperimentom skakanja s platforme. Vrijeme kašnjenja （A）; Broj grešaka

2. 6. 3 Morrisov eksperiment u vodenom lavirintu kako bi se promatrao učinak Cistanche glikozida na starenje modelnih miševa

Kao što je prikazano na slici 6, kako se broj dana treninga povećava, vrijeme za svaku grupu miševa da pronađe platformu postepeno se smanjuje. U poređenju sa kontrolnom grupom, vrijeme za miševe modelske grupe da pronađu platformu značajno se povećalo (P<0.05), while the time for the positive control group and the Cistanche glycoside group mice to find the platform slightly increased.

U poređenju sa kontrolnom grupom, P<0.05

Slika 6. Utjecaj glikozida Cistanche na miševe modela starenja uočen eksperimentom pozicioniranja navigacije

Kao što je prikazano na slici 7, kako se broj dana treninga povećava, postepeno se povećava broj puta kada svaka grupa miševa pređe platformu. U poređenju sa kontrolnom grupom, značajno se smanjio broj puta kada su miševi modelske grupe prešli platformu (P<0.05), while the number of times the positive control group and the Cistanche glycoside group mice crossed the platform slightly decreased.

Slika 7. Utjecaj glikozida Cistanche na miševe modela starenja uočen eksperimentom istraživanja svemira

2. 7 Učinak glikozida Cistanche na nivoe antioksidansa u moždanom tkivu starijih modela miševa

Kao što je prikazano na slici 8, u poređenju sa kontrolnom grupom, aktivnosti enzima SOD i CAT u moždanom tkivu miševa modelne grupe su značajno smanjene (P<0.05). The SOD and CAT enzyme activities in the brain tissue of the positive control group and the Cistanche glycoside group mice were slightly increased, while the MDA content in the brain tissue of the model group mice was significantly increased (P<0.05). The MDA content in the brain tissue of the positive control group and the Cistanche glycoside group mice was slightly reduced.

Kineska trava cistanche

3 Zaključak

Ova studija koristila je brzinu ekstrakcije Cistanche glikozida kao indikator evaluacije i ekstrahirala Cistanche glikozid metodom enzimske hidrolize. Sadržaj Cistanche glikozida je određen HPLC. Izvedeni su sljedeći zaključci:

1) Kada je odnos materijala i tečnosti 1:1{{10}}, frekvencija ekstrakcije je 3 puta, temperatura ekstrakcije je 80 stepeni, a reagens za ekstrakciju je 1 minut , stopa ekstrakcije Cistanche glikozida je najveća. Sadržaj cistanche glikozida u 8 različitih varijanti određen je UV vidljivim spektrofotometrom. Rezultati su pokazali značajne razlike u sadržaju glikozida cistanhe između različitih regija ili sorti. Među njima, Shanxi Beiqi je imao najveći sadržaj cistanche glikozida, dok je Shanxi Heipi Qi imao najmanji sadržaj cistanche glikozida u AA razredu. Kako bi se dalje uspostavio sistem odvajanja i prečišćavanja za Cistanche glikozid, HPLC je utvrdio otisak prsta Cistanche glikozida. Rezultati su pokazali da je vrijeme zadržavanja Cistanche glikozida 10,64 minuta, masena koncentracija 1,0~40,0 μ G/mL, sa dobrom linearnošću i R-vrijednošću od 0.999 8, a HPLC metoda ima dobru stabilnost i preciznost.

2) Učinak glikozida Cistanche deserticola pripremljenog enzimskom hidrolizom na starenje modelnih miševa, promatranje sposobnosti učenja i pamćenja miševa modela starosti i otkrivanje nivoa oksidacije moždanog tkiva. Rezultati su pokazali da su u poređenju sa kontrolnom grupom, Cistanche glikozidi značajno poboljšali sposobnost učenja i pamćenja kod miševa starosnog modela nakon tretmana (P<0.05); Compared with the control group, the activity of SOD and CAT enzymes in the brain tissue of aging model mice significantly increased (P<0.05) after treatment with Cistanche glycosides, while the content of MDA significantly decreased (P<0.05).

referenca:

［1］ Wang Xiaoju. Ekstrakcija, odvajanje i proučavanje aktivnosti aktivnih komponenti glikozida Cistanche ［D］. Xi'an: Univerzitet Shanxi, 2005.

［ 2 ］ Wang Guangzhong, Hu Di, Chen Jingbing. Ortogonalni dizajn za optimizaciju procesa ekstrakcije ukupnih flavonoida i ukupnih saponina Cistanche glikozida ［J］. Kineska patentna medicina, 2004, 26（10）: 3-4.

［ 3］ Liu Jinhua, Chen Jingran, You Guangfu. Napredak u farmakološkim istraživanjima zaštite miokarda Astragalusa ［J］. Kineska patentna medicina, 2002, 24（8）: 623-626.

［ 4］ Guo Wei. Pregled farmakologije i kliničkih istraživanja tradicionalne kineske medicine Cistanche glycoside ［J］. Shanxi Traditional Chinese Medicine, 2011, 27（11）: 52-54.

［ 5 ］ Lu Yanqi, He Xueli. Pregled hemijskih sastojaka i farmakoloških efekata Cistanche glikozida ［J］. Journal of Baoding Teachers College, 2004, 17（4）: 40-42.

［ 6］ Li Qin, Liu Hong. Farmakološki efekti i klinička primjena Cistanche glikozida ［J］. Kineska medicina tradicionalne kineske medicine, 2004, 10（10）: 633-635.

［7］ Jin Jizi. Napredak istraživanja farmakoloških učinaka i kliničke primjene Cistanche glikozida ［J］. Kineska medicina tradicionalne kineske medicine, 2008, 17（20）: 134-135. ［ 8 ］ Chen Jianzhen, Lv Guiyuan, Ye Lei. Napredak u istraživanju hemijskih sastojaka i farmakoloških efekata flavonoida glikozida Cistanche ［J］. Medical Herald, 2009, 28（10）: 1314-1316.

［ 9 ］ Liang Liansheng, Yu Jing. Farmakološki efekti flavonoida u glikozidu Cistanche ［J］. Časopis za integrativnu kinesku i zapadnu medicinu kardiovaskularne i cerebrovaskularne bolesti, 2005, 3(12): 1085-1087.

［10］ Zhang Dongqing, Wang Deqing. Napredak istraživanja biološke aktivnosti ukupnih flavonoida Cistanche glikozida ［J］. China Important Journal, 2010, 35（2）: 253-256.

［11］ Li Y, Guo S, Zhu Y, Yan H, et al. Cvjetovi Cistanche glycoside membranaceus var. mongholicus kao novi proizvod visokog potencijala: fitokemijska karakterizacija i antioksidativna aktivnost ［J］. Molekuli, 2019, 24(3): 434.

［12］ Butkutė B, Dagilytė A, Benetis R, et al. Mineralni i fitokemijski profili i antioksidativna aktivnost biljnog materijala iz dvije umjerene vrste Cistanche glikozida ［J］. Biomed. Res. Int., 2018.

［13］ Sharifi-Rad M, Pohl P, Epifano F, et al. Zelena sinteza nanočestica srebra korištenjem Cistanche glycoside tribuloides delile. Ekstrakt korijena: karakterizacija, antioksidativno, antibakterijsko i protuupalno djelovanje ［J］. Nanomaterijali (Bazel), 2020, 10(12): 2383.

［14］ Wang D, Zhuang Y, Tian Y, et al. Proučavanje efekata ukupnih flavonoida Cistanche glikozida na formiranje ateroskleroze i potencijalne mehanizme ［J］. Oksid. Med. Cell. Longev., 2012.