Poli- i oligosaharid Ulva Sp. Frakcije ekstrakcije potpomognute enzimima moduliraju metabolizam ekstracelularnog matriksa

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

sažetak:Ulva sp. poznato je da je izvor bioaktivnih jedinjenja kao što su vanovi, ali je njihova biološka aktivnost na ekstracelularnom matriksu humanih fibroblasta (ECM) slabo prijavljena. U ovom radu, regulacija ECM-a je po prvi put istražena i na proteomskom i na transkriptomskom nivou u normalnim dermalnim fibroblastima ljudske kože, nakon 48 h inkubacije sa poli- i oligosaharidnim frakcijama iz Ulva sp. dobiveni nakon ekstrakcije i depolimerizacije potpomognute enzima. Povećanje ćelijske proliferacije (do plus 68 procenata) bez ispoljavanja bilo kakvog citotoksičnog efekta na fibroblaste je pokazano na 50 i 1000 ug/mL od strane obe frakcije. Na proteomskom nivou, frakcije polisaharida od 1000 ug/mL najviše su pojačale sintezu glikozaminoglikana (GAG, do plus 57 posto), ukupnog kolagena, posebno tipova I (do plus 217 posto) i Ⅲ, kao i sintezu i aktivnost MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1, do plus 309 posto). Nasuprot tome, frakcije oligosaharida nisu imale utjecaja na sintezu GAG-a, ali su pokazale sličnosti za kolagen i regulaciju MMP{12}}.puritanski vitamin cNa transkriptomskom nivou, smanjenje ekspresije COL1A1 i COL1A2, te povećanje ekspresije COL3A1 i MMP-1 potvrdilo je modulaciju metabolizma ECM-a od strane obje frakcije. Naše istraživanje naglašava da poli- i oligosaharid Ulva sp. frakcije pokazuju zanimljive biološke aktivnosti i podržavaju njihovu potencijalnu upotrebu u području obnavljanja kože za dermo-kozmetičke primjene protiv starenja.

kliknite ovdje da saznate više

Ključne riječi:kolagen; ekstracelularni matriks; ljudski dermalni fibroblast; matriks metaloproteinaza; morske alge; Ulva sp.

1. Uvod

Velike zelene plime uzrokovane Uloa sp. ponavljaju se u Bretanji (Francuska) zbog eutrofikacije mora. Nasukane zelene morske alge imaju duboke štetne ekološke utjecaje, uključujući promjenu strukture ekosistema, smanjenje autohtonog biodiverziteta i ekonomske gubitke [1,2]. Osim korištenja kao dopuna tla, ishrane za životinje ili jednostavne degradacije propadanjem ili sagorijevanjem uslijed nasukavanja, vrlo se malo zna o valorizaciji Uloa sp. u ljudskom zdravlju [1]. Međutim, Ulloa sp. je važan izvor jedinjenja kao što su ulvani. Evans, vodotopivi sulfatirani polisaharidi stanične stijenke, koji se uglavnom sastoje od ramnoze, uronskih kiselina i ksiloze, mogu predstavljati do 36 posto suhe težine Ulloe [3]. Dvije glavne ponovljene disaharidne jedinice ulvana su aldobiuronske kiseline (ulvanobiuronske kiseline), tip A: -D-glukuronska kiselina (1,4)-vezana za -L-ramnoza 3-sulfat, i tip B: -L- iduronska kiselina (1,4)-vezana za -L-ramnozu 3-sulfat. Manje aldoze disaharida, koje se nazivaju ulvanobioze (tip U) se takođe mogu naći u ulvanu[3.4]. Ekstrakcija ulvana u smislu kvantitativnog prinosa i kvaliteta može značajno varirati u zavisnosti od metoda ekstrakcije i frakcionisanja primenjenih na biomasu. Ulvani se obično ekstrahuju u vodenom rastvoru na visokim temperaturama (80-90 stepeni) što se naziva procesom maceracije. Međutim, Evans se može oporaviti novom zelenom tehnologijom pod nazivom Enzimska ekstrakcija (EAE)[5].EAE omogućava ekstrakciju jedinjenja od interesa bez korištenja uvjeta denaturacije kao što su rastvarači ili visoke temperature ekstrakcije, i pokazuje razne prednosti kao što su visoka katalitička efikasnost, visoka specifičnost, blagi uslovi reakcije i očuvanje bioloških aktivnosti jedinjenja. EAE također poboljšava prinos i smanjuje troškove i potrošnju energije u poređenju sa klasičnim postupkom maceracije [6-9]. Nakon vodene ekstrakcije iz maceracije ili novog procesa kao što je EAE, obogaćivanje ulvanom često se izvodi postupkom etanolne precipitacije [3]. Ulvans je pokazao in vitro i in vivo nekoliko bioloških aktivnosti kao što su imunomodulacija, antioksidans, antikancerogena, antikoagulantna, antihiperlipidemijska ili antivirusna [3,5,10-14].sistancheStrukturna karakteristika Evansa (stepen sulfatacije, obrazac sulfatacije, sastav monosaharida, glikozidne veze, stepen grananja, kao i molekulska težina) utiče na njegovu biološku aktivnost [3]

Starenje kože je složen proces sa dva komplementarna procesa: unutrašnjim (genetski, ćelijski metabolizam, itd.) i ekstrinzičnim (izloženost UV zračenju, zagađenje, pušenje, itd.)[15-17]

Cistanche može protiv starenja

Novo se pojavila upotreba bioaktivnih sastojaka morskih algi kao izvora proizvoda visoke dodane vrijednosti za dermokozmetičku industriju. Među ovim bioaktivnim jedinjenjima, ulvani imaju veliki potencijal. Zaista, potražnja potrošača za prirodnim proizvodima je u porastu posljednjih godina, što morske proizvode, a posebno morske alge, čini zanimljivim izvorom prirodnih sastojaka koji ciljaju na ljepotu i zdravlje kože [18-22]. Koža, meta kozmetičkih proizvoda, sastoji se od tri glavna sloja koji se preklapaju: epiderma, dermisa i hipoderme.šta je cistancheDermis podržava epidermu i sadrži važne ćelije kože poznate kao fibroblasti. Fibroblasti, glavne ćelije papilarnog dermisa koje se nalaze odmah ispod epiderme, u suštini sintetiziraju i organiziraju ekstracelularni matriks (ECM). ECM se sastoji od različitih makromolekula uključujući kolagene (70 posto suhe težine) uglavnom tip I i ​​III, elastin (2-4 posto), glikoproteine ​​(fibronektin, laminin, itd.), glikozaminoglikane (GAG) ili sulfatirane (heparan sulfat, dermatan sulfat, keratan sulfat, hondroitin sulfat) i nesulfat (hijaluronska kiselina), proteoglikani i degradativne komponente kao što su MMP (matrične metaloproteinaze)[23,24]. Kolagen tipa I predstavlja do 80 posto ukupnog kolagena [25] i jedan je od glavnih sastojaka ECM dermisa kože; uključen je u elastičnost, fleksibilnost i napetost kože. Kolagen tipa I je heterotrimer, trostruki heliks protein, sastavljen od dva cl lanca i jednog c2 lanca koji su kodirani genima COL1Al i COL1A2 [26]. Fibrilarni kolageni tipa I i II predstavljaju preko 90 posto ukupnog kolagena i usko su povezani u koži [27,28]. Kolagen tipa II je zastupljeniji u mladoj koži nego u starijoj koži i posebno je uključen u zacjeljivanje rana [29,30]. Da bi se uspostavila molekularna mreža za sklapanje ECM-a, GAG-ovi su povezani s proteinima i formiraju proteoglikane (npr. dekorin ili versikan) koji stupaju u interakciju s kolagenom tipa I [31]Unutar ECM-a, MMP, koji su enzimi ECM kataboličkog puta, su povezani, u latentnom ili aktivnom obliku, za svoj tkivni inhibitor metaloproteinaza poznatih kao TIMP, koji regulišu njihovu aktivnost [32]. MMP-1(kolagenaza-1) je glavni enzim odgovoran za razgradnju kolagena tipa I, a TIMP-1 je njegov odgovarajući inhibitor [334]. Fibroblasti su ključni regulatori ECM homeostaze. Ravnoteža i spajanje sinteze između ECM komponenti kože uključenih u anabolizam, kao što su kolagen tipa I i II, GAG ili TIMP, i u katabolizmu kao što su MMP, omogućava obnavljanje i kontinuirano remodeliranje ovog ECM-a[25]. U starenju kože , glavna posljedica je neravnoteža regulacije ECM-a sa smanjenjem proliferacije fibroblasta, modulacijom nivoa komponenti ECM-a uz značajno smanjenje sinteze kolagena tipa I, sekrecije GAG-a i sinteze TIMP-1, te povećanje MMP-1 nivo [24,35].

Za sada, samo nekoliko studija je istraživalo učinak Ulva sp. frakcije na metabolizam ćelija kože fibroblasta i na proteomskom i na transkriptomskom nivou[36-39]i, do danas, nije provedena potpuna studija na proteomskom i transkriptomskom nivou na Ulua poli- i oligosaharidnim frakcijama izvedenim iz EAE procesa.Cistanche protiv starenjaU ovoj perspektivi, ova studija istražuje, in vitro, efekte poli- i oligosaharidnih frakcija iz Ulva sp. izvedeno iz nove zelene tehnologije EAE na metabolizam ljudskih dermalnih fibroblasta. Proučavani su njihovi efekti na proliferaciju i održivost fibroblasta i na anabolizam i katabolizam ECM na proteomskom i transkriptomskom nivou kako bi se istaknuo njihov potencijal u njezi kože (npr. protiv starenja).

2. Rezultati

2.1. Poli- i oligosaharidne frakcije Ulva sp.

iz EAE pokazuju različit biohemijski sastav i distribuciju molekularne težine

Mehanizmi proizvodnje poli- i oligosaharidnih frakcija su detaljno opisani u odjeljku Materijal i metode: "4.2 Proizvodnja i karakterizacija frakcija poli- i oligosaharida". Prethodne detaljne analize biohemijske karakterizacije (ugljikohidrati, uronske kiseline, sulfatne grupe i proteini) i molekularne masena raspodjela poli- i oligosaharidnih frakcija iz Ulloa sp. izvedeni iz EAE [36]. Podaci su objedinjeni u tabeli 1.

Ukratko, polisaharidne frakcije sirovih ulvana (UE) i dijaliziranih ulvana (DS-UE) sastoje se od ulvana visoke molekularne težine (sirovih vanova) sa 23.5-37.4 posto ugljikohidrata,18.5-37. 0 posto uronskih kiselina,29.9-49.1 posto sulfatne grupe i 10.5-12.8 posto proteina. Sastav ugljikohidrata je uglavnom bio ramnoza (50 posto) i glukuronska kiselina (11 posto). DS-UE frakcija je značajno bogatija ulvanima od UE frakcije. Oligosaharidne frakcije, depolimerizovani van iz HzO2 (DEP-HD PP-UE) i depolimerizovani van od Amberlite smole (DEP-AD PP-UE), sastoje se od niskomolekularnih van sa 24.4-30.4 posto ugljikohidrata ( ramnoza 44.9-55.4 posto i glukuronska kiselina 7.5-11.0 posto ), 21.6-30.8 posto uronske kiseline i 12.8-16.8 posto proteini.

Međutim, proces depolimerizacije doveo je do djelomičnog gubitka sulfata (nije otkriven u DEP-ADPP-a samo 6,6 posto u DEP-HD PP-UE). Raspodjela molekularne težine (Mw) frakcija oligosaharida pokazala je prosječnu nisku Mw od 8 kDa za DEP-HD PP-UE i nižu za DEP-AD PP-U sa 1,5 kDa.

2.2. Poli- i oligosaharidne frakcije Ulva sp. Stimuliše metaboličku aktivnost, ali ne utiče na održivost fibroblasta

Metabolička aktivnost normalnih humanih dermalnih fibroblasta (NHDF), 48h izloženih frakcijama poli- i oligosaharida Ulloa (50 i 100 ug/mL tokom 48 h), procijenjena je pomoću WST-1 (Slika 1). U ovim eksperimentima (n=9), frakcije Ullva iz EAE povećale su proliferaciju fibroblasta do plus 68 posto u poređenju sa kontrolom.cistanche benefíciosZnačajno povećanje metaboličke aktivnosti (str<0.001)were observed="" for="" both="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 50="" and="" 1000="" ug/ml.="" oligosaccharide="" fractions="" exhibited="" a="" higher="" and="" more="" significant="" rise="" of="" metabolic="" activity="" at="" 100="" ug/ml="" (p=""><0.001) than="" at="" 50="" ug/ml(no="" significance="" for="" dep-hd="" pp-ue="" and="" lower="" significance,=""><0.05, for="" dep-ad="">

Da bi se utvrdilo da li su ovi efekti povezani sa toksičnošću ćelija, održivost ćelija tretiranih ekstraktom Ulou procenjena je merenjem otpuštanja LDH (laktat dehidrogenaze) korišćenjem CytoTox96 stepena testa nakon 48 h inkubacije (n=3)(Slika 2). Test citotoksičnosti je pokazao da sve frakcije nisu pokazale značajnu citotoksičnost u poređenju sa kontrolom.

2.3. Poli- i oligosaharidne frakcije Ulva sp. Stimulirajte metabolizam ekstracelularnog matriksa u fibroblastima

Efekat frakcija poli- i oligosaharida Ulloa na sintezu sulfatiranih i nesulfatnih glikozaminoglikana (GAG) fibroblasta procijenjen je bojenjem u Alcian blue nakon 48 h inkubacije (n=4) (Slika 3). Značajno povećanje sinteze uočeno je samo za UE i DS-UE pri 100 ug/mL uzimajući u obzir oba sulfata (p<0.01,+39% and="" +51%,respectively)="" and="" non-sulfated="" gags=""><0.05,+44% and="" +57%="">

Zanimljivo je napomenuti da je DS-UE, najbogatija frakcija ulvana, najviše poboljšala sintezu GAG-a. Pri 50 ug/mL, UE i DS-UE su povećali sintezu nesulfatnih GAG-ova, ali ne značajno (plus 14,2 posto i plus 22,7 posto respektivno). Frakcije oligosaharida DEP-AD PP-UE pri 1000 ug/mL blago su smanjile sintezu nesulfatiranih GAG-a, ali ne značajno (-3 posto), a DEP-HD PP-UE je blago poboljšala, ali ne značajno sintezu GAG-a pri 100 ug/ mL ( plus 4,1 posto za sulfatirane i plus 10,9 posto za nesulfate).

Ukupna sinteza kolagena (Slika 4) procijenjena je Red Sirius testom nakon 48 h izloženosti fibroblastima frakcijama poli- i oligosaharida Ulloa (n=7 pri 100 ug/mL i n=6 pri 50 ug/mL) .

Sve frakcije su pokazale povećanje sinteze kolagena ovisno o koncentraciji. Granični i ne značajan pad sinteze kolagena zabilježen je za sve frakcije na 50 ug/mL u poređenju sa kontrolom. Nasuprot tome, pri 1000 ug/mL, sve frakcije su povećale ukupnu sintezu kolagena i na značajan način za UE ( plus 22 procenta ,p<><0.01),and dep-hd=""><>

Poli- i oligosaharid Efekat EAE frakcije dobijene na sintezu kolagena tipa I (n=6) i sintezu MMP-1 (n=4) procijenjen je ELISA testovima (Slika 5).

Sve frakcije su poboljšale sintezu kolagena tipa I i sintezu MP-1, ali ne uvijek značajno. Povećanje sinteze kolagena tipa I zavisilo je od koncentracije. Utvrđeno je da frakcije polisaharida, UE i DS-UE, pri 1000 ug/mL značajno （p<05）increase type="" i="" collagen="" synthesis="" (+122%,="" and="" +217%="" respectively)="" and="" mmp-1="" synthesis="" (+309%="" and="" +169%="">

Efekti frakcija poli- i oligosaharida Ulloa pri 100 ug/mL, nakon 48 h izlaganja fibroblastima, na sintezu kolagena tipa I(n=5) i tipa Ⅲ(n=4) na proizvodnja MMP-1(n=6) i TIMP-1(n=5) ​​procijenjena je Western blot (WB) analizom sa metodom normalizacije korištenjem metode totalnog proteina trake ( Slika 6).

Na slici 6a,e, i WB ističu, respektivno, povećanje sinteze zrelog kolagena tipa I (≈130kDa) i zrelog kolagena tipa III (≈190 kDa) za sve frakcije. Kvantifikacija proteina na slici 6c kolagena tipa I i slici 6g kolagena tipa III otkrila je NS (ne statistički značajno) povećanje njihove sinteze u prisustvu poli- i oligosaharida Ulloa sp. razlomci. U međuvremenu, WB na slici 6b,d nam je omogućio da kvantifikujemo značajan （p<05）increase of="" mmp-1="" production="" （≈50kda）for="" polysaccharide="" fractions="" and="" not="" significant="" for="" oligosaccharide="" ulloa="" eae-derived="" fractions="" dep-ad="" pp.="" ue="" and="" dep-hd="" pp-ue.="" wb="" quantification="" of="" timp-1="" production="" （≈20kda）,="" available="" in="" figure="" 6f,h,="" showed="" only="" a="" significant="" increase="" in="" presence="" of="" the="" dep-hd="" pp-ue="" fraction=""><0.05), while="" other="" fractions="" had="" no="" significant="">

Aktivnost MMP-1 kolagenaze određena je zimografskim testom u prisustvu frakcija poli- i oligosaharida Ulloa pri 100 ug/mL (slika 7a), kvantificirana i upoređena sa kontrolom (slika 7b), nakon 48 sati izlaganja fibroblastima (n =4).

Rezultati su otkrili da i poli- i oligosaharid Ulva sp. frakcije nisu značajno povećale MMP{1}} aktivnost fibroblasta.

2.4. Poli- i oligosaharidne frakcije Ulva sp. Diferencijalno modulirajte ekspresiju ECM gena fibroblasta

Učinak frakcija koje potiču od poli- i oligosaharida Ulloa EAE je proučavan na nivoe mRNA u stabilnom stanju nekoliko komponenti ekstracelularnog matriksa (COL1A1, COL1A2, COL3A1, MMP-1 i TIMP-1)(n =4)(Slika 8).

Primijetili smo da su se sve frakcije na 1000 ug/mL značajno smanjile (str<0.01 and=""><05)col1a1 mrna="" steady-state="" levels="" (figure="" 8a).="" in="" contrast,="" we="" noted="" that="" all="" fractions="" increased="" mmp-1="" mrna="" level="" expression="" significantly="" (p="" <="" 0.05)="" for="" ue="" at="" both="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml="" only="" (figure="" 8c).="" timp-1="" mrna="" steady-state="" level="" was="" not="" significantly="" changed,="" but="" dep-hd="" pp-ue="" and="" dep-ad="" pp-ue="" reduced="" it="" not="" significantly="" at="" 50="" ug/ml="" (figure="" 8e).="" the="" col1a2="" mrna="" steady-state="" level="" (figure="" 8b)="" is="" enhanced="" (ns)="" for="" both="" ue="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml.="" however,="" it="" is="" lower="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" ds-ue="" (ns),="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue="" (only="" significant="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" the=""><0.05). polysaccharide="" fractions,="" ue="" and="" ds-ue,="" raised="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" significantly=""><0.05) at="" 1000="" ug/ml="" and="" at="" 50="" ug/ml="" for="" ue="" (ns="" for="" ds-ue)(figure="" 8d).="" oligosaccharide="" fractions,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" at="" 1000="" ug/ml="" raised="" not="" significantly="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" and="" reduced="" it="" at="" 50="" μg/ml（significant="" only="" for="" dep-ad=""><>

Tabela 2 prikazuje kombinovane rezultate na nivou stabilnog stanja genske mRNA nakon izlaganja fibroblastima frakcijama od 1000 ug/mL.

Tabela 2 pokazuje da se UE značajno smanjio (str<0.01)col1al and="" increased="" signifi-cantly=""><0.05) mmp-1="" and="" col3a1,="" and="" not="" significantly="" col1a2mrna="" steady-state="" levels.="" for="" ds-ue,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" similar="" mrna="" steady-state="" levels="" with="" a="" decrease="" in="" col1a1=""><0.01), in="" col1a2(only="" significant=""><0.05 for="" dep-ad="" pp-ue),="" increase="" in="" col3a1="" (only="" significant=""><0.05 for="" ds-ue),="" increase="" in="" mmp-1(ns),="" and="" no="" significant="" change="" in="" timp-1="" mrna="" expression="" were="">

Ovaj članak Mar. Drugs 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs