Efekat urolitina A protiv starenja na goveđe oocite in vitro

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

sažetak:Oksidativni stres i mitohondrijska disfunkcija povezani su sa padom kvaliteta oocita koji je povezan sa starenjem i trenutno se traže strategije za njihovu prevenciju. Urolitin A (UA) je prirodni metabolit s pro-apoptotičkim i antioksidativnim djelovanjem, sposoban spriječiti nakupljanje disfunkcionalnih mitohondrija u stanicama različite starosti. UA nikada nije testiran na goveđim oocitima. Naš cilj je bio proučavanje uticaja UA na razvojni potencijal ekspresije kumulus-oocita-kompleksa (COC) i granuloza ćelija (GC) važnih gena koji se odnose na reproduktivnu sposobnost. Procijenjeni su napredovanje sazrijevanja jedra, potencijal mitohondrijalne membrane (MMP) i razvojna kompetencija fiziološki zrelih (22 h) i in vitro ostarjelih oocita (30 h IVM) dobijenih od prepubertetskih i odraslih ženki, uz dodatak UA ili ne. Dodatno, količina mRNA nekoliko gena (NFE2L2, NQO1 i mt-DN5) i broj kopija mt-ND5 DNK kvantificirani su u kultiviranim GC-ima od prepubertetskih i odraslih ženki, bilo dopunjenih UA ili ne. Naša studija je potvrdila štetan učinak starenja oocita na progresiju sazrijevanja jezgre, MMP, razvojnu kompetenciju i nivoe ekspresije gena. Tretman UA tokom in vitro sazrevanja je poboljšan (str<0.05) the="" maturation="" rate="" and="" subsequent="" developmental="" capacity="" of="" aged="" oocytes.="" a="" positive="" effect="">< 0.05)="" of="" ua="" on="" physiological="" maturation,="" mmp,="" and="" embryonic="" development="" was="" also="" identified.="" ua="" also="" interfered="" with="" the="" expression="" profile="" of="" nfe2l2="" and="" nqo1="" genes="" in="" gcs="" cultures.="" our="" findings="" demonstrate="" that="" ua="" supplementation="" is="" an="" effective="" way="" to="" prevent="" oocyte="" aging="" and="" improves="" the="" subsequent="" bovine="" embryonic="">

KSL01

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Ključne riječi:oocit; starenje; Urolitin A; potpomognute reproduktivne tehnologije

1. Uvod

Smanjenje ženske reproduktivne sposobnosti jedna je od prvih fizioloških funkcija na koju negativno utječe starenje i stoga se smatra zdravstvenim problemom u nastajanju širom svijeta [1,2]. Pored nekoliko patoloških problema, smanjenje plodnosti žena povezano sa godinama uglavnom se pripisuje padu ovarijalne rezerve oocita [1,3-5] udruženom sa vremenski zavisnim pogoršanjem njihovog kvaliteta [2]. Ovaj proces pogoršanja može nastati zbog izlaganja oocita ostarjelom mikrookruženju jajnika prije ovulacije. Osim toga, ženska gameta je često podvrgnuta postovulacijskom starenju kada se proces oplodnje ne dogodi u najboljem optimalnom periodu, a neoplođena jajna stanica ostaje u jajovodu ili in vitro prije inseminacije duže vrijeme [6]Oštećenje Kvalitet oocita je kritičan faktor povezan s neuspjehom potpomognutih reproduktivnih tehnologija (ART) jer je njihov kvalitet glavna determinanta razvojnog potencijala embrija nakon oplodnje [7,8]. Često se navodi da asinhronija ovulacije i starenje oocita umanjuju uspjeh vještačke oplodnje i programa proizvodnje embriona kod kobila, goveda i ovaca, što implicira značajne ekonomske gubitke[1,9,10]. Stoga je od iskonske važnosti proučavati mehanizme koji stoje u osnovi starenja jajnih stanica, kako bi se osmislili bolji terapijski pristupi za spašavanje plodnosti kod nekoliko vrsta, uključujući i ljude, te kao alat za genetsko poboljšanje kod stoke.cistanche wirkungPosebna pažnja se mora posvetiti poboljšanju razvojnog kapaciteta jajnih ćelija goveda u prepubertetskom periodu, koje se često koriste za ubrzavanje genetskog dobitka i skraćivanje intervala generacija.

Jedan od glavnih uzroka poremećene razvojne kompetencije kod ostarjelih oocita je povećanje oksidativnog stresa, koji inducira mitohondrijalnu disfunkciju, oštećenje DNK i greške u formiranju vretena, što utječe na kvalitetu oocita [1]. Dobro je poznato da je povećana proizvodnja slobodnih radikala uzrok ćelijskog starenja u nekoliko kroničnih bolesti, kao iu reproduktivnoj biologiji, što rezultira lošim ishodima plodnosti [12]. Mikrookruženje jajnika, koje uključuje oocite i granulozne ćelije (GC), pruža antioksidativni odbrambeni mehanizam koji može regulisati oksidativna stanja i održavati ravnotežu oksidans/antioksidans [13]. Međutim, tokom procesa starenja, efikasnost antioksidativne odbrane za neutralizaciju reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) je oslabljena, čime se povećava nivo oksidativnog stresa. Faktor 2 povezan s nuklearnim faktorom E2-(Nrf2 ili NFE2L2), također poznat kao Nrf2/Kelch-poput ECH-povezanog proteina 1 (Keap1), je dominantna kaskada odgovora aktivirana oksidativnim stresom[14]. Ovaj put je ćelijski odbrambeni mehanizam koji su ćelije razvile da se nose sa štetnim efektima oksidativnog stresa. U normalnim uslovima, Keap1 negativno reguliše Nrf2, zadržava se u citoplazmi i održava na niskim nivoima. Kada je izložen oksidansima, Nrf2 se odvaja od Keapl, omogućavajući njegovu translokaciju u jezgru gdje se vezuje za specifične sekvence DNK. Ove sekvence, nazvane antioksidativni elementi odgovora (ARE), dovode do transkripcione aktivacije citoprotektivnih gena, kao što su NAD(P)H:kinon-oksidoreduktaza-1 (NQO1), hem oksigenaza-1 (HMOX1) i katalitička podjedinica glutamat-cistein ligaze (GCLC)[15,16]. Prethodne studije su pokazale da aktivacija Nrf2-Keapl signalnog puta smanjuje oštećenje oksidativnim stresom podižući nivoe antioksidansa u ljudskim GC i mišjim jajnicima[17,18]. Međutim, njegova uloga u procesu starenja ženskih gameta ostaje nedostižna, iako je jasno utvrđeno da su mitohondrije glavno mjesto proizvodnje za ROS tokom ovog procesa [9,10].

KSL02

Cistanche može protiv starenja

Suprotno tome, mitohondrije su uključene u nekoliko kritičnih ćelijskih funkcija i ključne su za zadovoljavanje potreba za proizvodnjom energije potrebne tokom sazrevanja oocita i kasnijeg embrionalnog razvoja [19]. Kompetentna mitohondrijalna aktivnost je visoko povezana sa većim sadržajem mitohondrijalne DNK (mt-DNK) i generisanjem ATP-a [20], većim potencijalom mitohondrijske membrane [21] i održavanjem kvaliteta i kvantiteta mitohondrija putem mitofagije [22]. Štaviše, sugerirano je da je aktivnost mitohondrija u direktnoj korelaciji s održivošću embrija i boljim ishodima plodnosti [23]. Sve je više dokaza koji potvrđuju da promjene mitohondrija koje su povezane sa starenjem dovode do starenja jajnika i posljedično smanjene vitalnosti embrija i potencijala za implantaciju. Ove promjene uključuju smanjen broj kopija mt-DNK, smanjeno stvaranje ATP-a [20], promjene u ekspresiji mitohondrijalnog gena [24, oštećenje mt-DNK [25] i smanjen potencijal mitohondrijalne membrane [26].

KSL03

Terapijski pristupi usmjereni na mitohondrije izazvali su veliko zanimanje za nekoliko patologija povezanih sa starenjem zbog njihovog velikog potencijala u poboljšanju mitohondrijalne funkcije [27]. Unutar ovog okvira, pokazalo se da urolitin A (UA)—prirodni metabolit dobijen nakon uzimanja hrane kao što je šipak, nakon čega slijedi njegova konverzija u crijevnoj mikrobioti—sprečava nakupljanje disfunkcionalnih mitohondrija s godinama, izazivajući mitofagiju i također održavajući mitohondrijalni biogeneza i respiratorni kapacitet [28,29]. UA je primijenjen kao obećavajući terapeutski lijek za prevenciju nekih karcinoma, poput kolorektalnog karcinoma i raka prostate[30,31]. Osim toga, UA također ima protuupalna [32], anti-gojaznost [33], antioksidativna [34] i svojstva protiv starenja [35].bioflavonoidi citrusaNedavna studija je istakla efekte suplementacije UA na fibroblaste stare ljudske kože na aktivaciju Nrf2-Keapl puta čime se povećava njihov antioksidativni kapacitet. Ova aktivacija Nrf2-Keapl puta efektivno ublažava nivo ROS, kroz regulaciju ekspresije Nrf2 nizvodnih ARE-odgovornih gena (SOD, NQO1, GCLC i HMOX1), što ukazuje na obećavajući efekat protiv starenja [ 35].

KSL04

Provedeno je nekoliko studija s ciljem odgađanja starenja jajnika, posljedično poboljšanja kvalitete oocita i plodnosti. Zbog doprinosa oksidativnog stresa procesu starenja jajnika, kao i mitohondrijalnoj disfunkciji, suplementacija antioksidansima se pokazala kao obećavajuća terapija [36,37]. Međutim, nije poznato može li suplementacija urolitinom A obnoviti oštećenje koje se javlja tokom starenja jajnika, doprinoseći sprječavanju problema neplodnosti. Stoga je cilj ove studije bio: (1) pokazati da starenje može promijeniti razvojni potencijal kumulus-oocitnih kompleksa (COC) i ekspresiju važnih gena uključenih u signalni put Nrf2; (2) utvrditi može li UA spasiti plodnost žena koja pokazuje učinak protiv starenja kod ostarjelih COC i GC; i (3) da se proceni efekat UA na nivo ekspresije gena uključenih u Nrf2 signalni put, kao i na kvalitet oocita.

2. Materijali i metode

2.1. Eksperimentalni dizajn

Ovu studiju je odobrio Komitet za brigu o životinjama Nacionalne veterinarske uprave (N stepen 08965DGAV), slijedeći smjernice Evropske unije (br..86/609/EEC). Da bi se istražio učinak starenja na promjenu kvalitete oocita i potencijalni učinak UA protiv starenja, model koji koristi COC prikupljene od prepubertetskih i odraslih krava podvrgnutih starenju in vitro (30 h sazrijevanja) ili fiziološkom sazrijevanju (22 h) primijenjeni su procesi.

2.1.1. Prethodni test—studija doza-odgovor

Prethodni test za određivanje koncentracije UA koju treba koristiti tokom procesa sazrevanja COC goveda izveden je na osnovu studije o dozi i odgovoru u četiri sesije. Budući da UA nikada nije testirana u goveđim oocitima, korištene su prethodne doze uspješno primijenjene za prevenciju i ublažavanje nekih karcinoma i za demonstriranje efekta UA protiv starenja u različitim ćelijskim linijama [28,39]. COC dobiveni od prepubertetskih i zrelih odraslih krava (n=978) su odabrani i zatim nasumično podijeljeni u pet grupa za testiranje različitih doza UA: kontrolne, 1,10,25 i 50 uM tokom fiziološkog in vitro sazrijevanja. Nakon perioda sazrijevanja, neke oocite (n=154) su obojene da bi se odredila hromozomska konfiguracija i faze sazrijevanja. Preostale zrele jajne ćelije su podvrgnute in vitro inseminaciji smrznutim/otopljenim sjemenom. Pretpostavljene zigote su kultivisane, a cijepanje i stope blastocista su određene 2. i 7. dana kulture, respektivno. Na osnovu dobijenih rezultata, odnosno odsustva štetnih efekata i podsticanja sazrevanja i razvoja blastocista, odabrana je koncentracija od 1 uM UA.

2.1.2. Eksperiment1

U ovom eksperimentu, sprovedenom u šest sesija, oba COC-a od predpuberteta (prosječna starost=9 mjeseci,n=660) i odraslih (prosječna starost =39mjeseci,n=674) krave su sakupljene kako bi se procijenio kvalitet oocita i razvojni potencijal ostarjelih i fiziološki zrelih oocita, kao i učinak UA za spašavanje plodnosti ženke. COC su nasumično podijeljeni u 8 grupa: (1) kontrolna prepubertetska grupa, COC od prepubertetskih teladi sazreli 22h (n=148); (2) UA prepubertetska grupa, COC iz prepubertetske teladi sazreli u mediju sa dodatkom 1 uM UA za 22 h (n=155); (3) kontrolna grupa od 30 h prepuberteta, COC od prepubertetske teladi starosti do 30 h in oitro sazrevanja (n=149); (4) UA od 30 h prepubertalna grupa, COC od prepubertetske teladi stare in vitro 30h u mediju za sazrijevanje sa dodatkom 1 uM UA(n=144);(5) kontrolna odrasla grupa, COC od odraslih krava sazrela 22h (n=155 );(6) UA odrasla grupa, COC od odraslih krava zrelih u mediju sa dodatkom 1 uM UA tokom 22 h (n=129); (7) kontrolna grupa odraslih od 30 h, COC od odraslih krava starosti do 30 h in oitro sazrevanja (n=148); i (8) UA od 30 h odrasla grupa, COC od odraslih krava starih in oitro 30 h u mediju za sazrijevanje sa dodatkom 1 uM UA(n=138).cynomorium prednostiNakon odgovarajućih perioda sazrevanja in vitro, jajne ćelije su oplodene odmrznutim kapacitiranim sjemenom bikova. Nakon toga je procijenjen embrionalni razvoj, procjenjujući kako stopu cijepanih i proizvedenih embriona, tako i njihov kvalitet.

Dodatno, u ovom eksperimentu, COC iz svake grupe su uzeti da bi se procijenila njihova nuklearna faza sazrijevanja (kontrolna prepubertalna grupa,n=7;UA prepubertetna grupa, n =7; kontrolna prepubertalna grupa od 30 h, n{ {3}}; UA od 30 h prepubertetska grupa, n=6; kontrolna grupa odraslih, n=16; UA grupa odraslih, n=21; kontrolna grupa odraslih od 30 h, n{ {9}}; UA od 30 h odrasla grupa, n=18). Procijenjen je i potencijal mitohondrijske membrane (MP) COC-a (kontrolna prepubertetna grupa, n=10; UA prepubertetna grupa, n{ {13}};kontrolna grupa od 30 h prepuberteta,n=9;UA od 30h pretpubertetska grupa,n=9;kontrolna grupa odraslih, n=15; UA grupa odraslih, n{ {19}}; kontrolna grupa odraslih od 30 sati, n=10; UA grupa odraslih od 30 sati, n=14).

2.1.3. Eksperiment2

Kako GC igraju bitnu ulogu u rastu folikula i razvoju oocita, izveden je drugi eksperiment u pet sesija kako bi se dalje proučavao uticaj starosti i UA na ekspresiju NFE2L2, NQO1 i mt-ND5. Procijenjen je i broj kopija mt-ND5 gena. GC su dobijeni nakon centrifugiranja folikularne tekućine aspirirane iz jajnika prepubertetskih (srednja starost=10 mjeseci) i odraslih krava (srednja starost =62 mjeseci). Ove ćelije su uzgajane u sledećim uslovima: (1) prepubertalna kontrola, kultura GC teladi u prepubertetu; (2) prepubertalni UA, kultura GC teladi u prepubertetu sa dodatkom 1 uM UA; (3) kontrola odraslih, kultura GC odraslih krava; i (4) odrasla UA, kultura GC odraslih krava sa dodatkom 1 uM UA. Nakon spajanja GC-a 5. dana kulture, oni su brzo zamrznuti u tekućem dušiku, a kasnije su ekstrahovani DNK i RNK, što je omogućilo naknadnu kvantifikaciju transkripata mRNA NFE2L2, NQO1 i mt-ND5, kao i broja kopija mt-ND5.

2.2. Sakupljanje jajnih ćelija i sazrevanje in vitro

Jajnici odraslih i predpubertetskih krava (prethodni test, n {{0}} i exp. 1, n=1334) su sakupljeni u lokalnoj klaonici, i čuvani na 35-37 stepenu, u fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom (PBS) sa dodatkom 0.15 procenata goveđeg serumskog albumina (w/v, BSA) sa dodatkom 0,05 mg mL-l kanamicina. U laboratoriji su folikuli jajnika prečnika 2-8 mm aspirirani 19-iglom. Samo COC sa najmanje tri sloja kompaktnih kumulusnih ćelija i homogenom ooplazmom su isprani i odabrani za sazrijevanje prema eksperimentalnom dizajnu.pustinjski zumbulSazrevanje je obavljeno u inkubatoru na 38,8 stepeni ,5 procenata CO2 u vlažnom vazduhu tokom 22 ili 30 h u medijumu za sazrevanje sastavljenom od medijuma za kulturu tkiva 199 (TCM) sa 10 procenata fetalnog goveđeg seruma, 0,2 mM natrijuma piruvat, 10 ng mL-l epidermalnog faktora rasta i 10 μL mL-l gentamicina【40】.

2.3. Sakupljanje i kultura granuloznih ćelija

Granulozne ćelije su dobijene iz obnovljene folikularne tečnosti nakon centrifugiranja u trajanju od 10 min na 200x g[41]. Pelet je suspendiran u 1 mL medija za kulturu (TCM199 plus 10 posto seruma) da bi se izvršilo još jedno centrifugiranje u trajanju od 5 minuta. Nova peleta je resuspendirana u 1 mL podloge za kulturu ili dopunjena sa 1 uM UA ili ne u skladu s eksperimentalnim dizajnom i homogenizirana štrcaljkom pričvršćenom na 19G-iglu, najmanje 30 puta da bi se ćelije odvojile. Nakon procjene vitalnosti GC-a (tripan plava boja, 0,4 posto w/v), ćelije su zasijane u koncentraciji od 2×105 vijabilnih ćelija mL-1 i uzgajane pet dana na 38,8 stepeni ,5 posto CO2 u vlažnoj atmosfera do ušća. Na svakih 48 sati, podloga za kulturu je ispražnjena i osvježena novom. Za ekstrakciju DNK i RNK, GC su sakupljeni i isprani centrifugiranjem na 200x g tokom 10 minuta. Ćelijske pelete su resuspendovane u 1 mL PBS-a, odmah zamrznute u tečnom azotu i pohranjene na -80 stepeni.

2.4. Nuklearno sazrevanje oocita

Faze sazrevanja jezgre su procenjene nakon perioda od 22h ili 30h in vitro sazrevanja.metoda ekstrakcije flavonoida pdfOgoljene jajne ćelije su fiksirane u rastvor sirćetne kiseline/etanola (1:3, v/v) i održavane na 4 stepena 48 h. Potom su oociti obojeni 1 posto aceto-lakmoidnim rastvorom, postavljeni u Neubauerovu komoru i posmatrani pod faznim kontrastnim mikroskopom (Olympus BX41). Oociti su klasifikovani na sljedeći način: Germinalni vezikuli (GV), kondenzacijski hromozomi I (CCI), kondenzacijski hromozomi II (CCII), dijakineza, anafaza-I/telofaza-I (AI/TI) i MII (metafaza-II) . U obzir su uzete samo oocite sa vidljivim bojenjem hromatinom [42].

2.5. Procjena potencijala mitohondrijske membrane

Za mjerenje potencijala mitohondrijske membrane (MP), indikatora mitohondrijalne aktivnosti, mitohondrije su obojene 5, 6, 6'-tetrakloro-1, 1', 3, 3'tetraetilbenzimidazolkarbocijanin jodidom (JC-1 , Invitrogen, Waltham, MA, SAD). Denudirane oocite su inkubirane sa 5 ug mL-l JC-1 [37] u mediju za sazrijevanje 30 min na 38,8 stepeni i 5 posto CO2 u vlažnom zraku u mraku. Oociti su dva puta isprani u PBS-u i odmah prebačeni u prethodno zagrijano staklo i posmatrani pod fluorescentnim mikroskopom (Olympus BX51) koristeći plavi fluorescentni filter (BP 470-490 cilj UPlanFI 20×/0,50). Potencijal mitohondrijske membrane je zatim izračunat kao omjer izmjerene crvene/zelene fluorescencije pomoću softvera Image] (Nacionalni institut za zdravlje, Bethesda, MD, SAD). 2.6. Vantjelesna oplodnja i kultura embriona

Vantjelesna oplodnja obavljena je smrznutom-odmrznutom spermom bika Holstein-Frisian, prethodno podvrgnutom kapacitaciji metodom Percoll gradijent (45 i 90), u koncentraciji 2 x 10 stepeni spermatozoida mL-4. COC i spermatozoidi su koinkubirani 20 h na 38,8 stepeni i 5% CO2 u vlažnom vazduhu. Pretpostavljene zigote su zatim prebačene u kapljice medijuma sintetičke jajovodne tečnosti (SOF) sa dodatkom BME i MEM aminokiselina, glutamina, glutationa i BSA [40]. Nakon 48 sati osjemenjivanja, prošla je stopa cijepanja (cijepani embrioni po ukupno oplodnjenim oocitima), a cijepani embrioni su održavani u SOF-u dopunjenom BSA i 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS). Embrioni su kultivisani 12 dana [41,43] kako bi se procijenila stopa razvoja blastocista (7,9 i 12 dana; D7 embrioni po cijepanom embrionu) i stopa izleglih embrija (izleženi embrioni po D7 embrionima) i njihov kvalitet [43]. Embrioni 7. dana su klasifikovani kao stepen 1 (dobar kvalitet), 2 (pristojan kvalitet) i stepen 3 (loš kvalitet)[4].

2.7. Ekstrakcija i kvantifikacija DNK i RNK

Ukupna DNK i RNK su izolovane iz GC-a koristeći High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Basel, Switzerland) i PureLinkTM RNA Mini Kit (InvitrogenTM, Waltham, MA, USA), prema uputstvima proizvođača. Ti protokoli su uključivali upotrebu spin kolona koji se koriste za izolaciju visokokvalitetne ukupne DNK i RNK i Dnaze kao tretman za uklanjanje genomske DNK iz RNK[40]. Nakon ekstrakcije, uzorci su pohranjeni na -80 stepeni. Koncentracija i kvalitet DNK i RNK određivani su pomoću NanoDropTM One/OneC spektrofotometra (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA).

2.7.1. Komplementarna sinteza DNK

Sinteza komplementarne DNK (cDNA) iz RNK izolata izvedena je korištenjem Xpert cDNA Synthesis Mastermix kita (GRiSP, Porto, Portugal, prema uputama proizvođača. RNA je reverzno transkribirana korištenjem 500 ng ekstrahirane RNK iz svakog uzorka za sintezu cDNK, koji je izveden pomoću termociklera (T100 Thermal Cycler, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Dobijeni cDNK su pohranjeni na -20 stepenu do upotrebe za daljnje analize. 2.7.2.Primer Design

Za ovu studiju, prajmeri za ciljani (NFE2L2 i NQO1) i endogeni kontrolni gen (6-aktin) su dizajnirani korištenjem Primer-BLAST softvera Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) (http://www. .ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/, pristupljeno 6. marta 2020.). Sekvence prajmera za referentne gene i ciljne gene prikazane su u tabeli 1. Pored toga, mt-ND5 gen je korišćen u ovom radu, a detalji o mt-ND5 prajmerima su preuzeti iz prethodne studije [45].

2.7.3.Kvantitativna lančana reakcija polimeraze reverzne transkripcije

PCR analize u realnom vremenu izvedene su korištenjem Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X sa ROX-om u termocikleru QuantStudio 3 (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA), koristeći cDNA u koncentraciji od 25 ng uL-l. Procjena broja kopija mitohondrijalne DNK (mt-DNK) gena ND5 izvršena je qPCR-om kroz prethodno ekstrahiranu DNK, koristeći istu opremu kao i za kvantifikaciju gena. Izvedena je svaka optimizirana reakcija, koja se sastojala od Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X sa ROX-om, prajmera (naprijed i nazad) svakog ciljnog gena, uzorka (cDNA/DNK) i vode bez RNaze koja čini ukupnu zapreminu od 10 μL. Uzorci su analizirani u duplikatu i reakcije koje sadrže vodu umjesto šablona uključene su kao negativne kontrole. Uzorci su podvrgnuti protokolu amplifikacije koji se sastojao od početnog ciklusa na 95 stepeni tokom 2 minuta faze denaturacije, nakon čega je usledilo 40 ciklusa denaturacije na 95 stepeni za 55s, 40 ciklusa žarenja u trajanju od 30 s na 60 stepeni (u zavisnosti od temperature topljenja prajmer sekvence), i faza ekstenzije na 72 stepena u trajanju od 30 s i, na kraju, krajnji period produženja na 72 stepena u trajanju od 10 minuta.

Za kvantifikaciju ekspresije gena korišćena je relativna metoda kvantifikacije. Ova metoda relativne kvantifikacije ekspresije gena sprovedena je sa nivoima ekspresije ciljnih gena koji su proučavani, a koji su normalizovani sa genima za domaćinstvo, CT komparativnom metodom. Kako je amplifikacija pomoću RT-qPCR izvedena u duplikatu, srednje CT vrijednosti za svaki gen su određene i nivoi ekspresije su izračunati korištenjem sljedeće formule:

gdje je △Ct=Ct ciljni gen -Ct endogeni kontrolni gen.

Za kvantifikaciju broja kopija mt-DNK korištena je relativna kvantifikacija normalizirana prema metodi jedinične mase. Ova metoda je provedena sa CT vrijednostima GC-a tretiranih UA (nazvanim kao test), koje su normalizirane kontrolnim uzorcima (trenutno označenim kao kalibrator). Kako je broj kopija mt-ND5 procijenjen qPCR-om i izveden u duplikatu, određene su srednje CT vrijednosti za uzorke testova i kalibratora, a omjeri su izračunati korištenjem sljedeće formule: