Feniletanol glikozidi iz Herba Cistanche poboljšavaju mikrookruženje hipoksičnog tumora i pojačavaju efekte oksaliplatina putem signalnog puta HIF-1

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

LIMEI WEN, JUNPING HU, JIAWEI ZHANG i JIANHUA YANG

Abstract.

Rak jetre je jedan od najčešćih vrsta malignih tumora i karakteriše ga visoka malignost, brza progresija, visok morbiditet i mortalitet. Prijavljeno je da oksaliplatin (OXA) ima izraženu efikasnost protiv uznapredovalog raka jetre sa podnošljivom toksičnošću. Kod solidnih tumora, hipoksično mikrookruženje potiče epitelno-mezenhimsku tranziciju (EMT), što također može izazvati rezistenciju raka jetre na lijekove platine. HerbaCistanche (Cistanche tubulosa) se često koristi u tradicionalnoj kineskoj medicini i feniletanoidni glikozidi iz HerbeCistanche(CPhG) su glavne aktivne komponente. Ova studija je imala za cilj da istraži efekte CPhG na održivost, apoptozu, migraciju i invaziju ćelija raka jetre. HepG2 ćelije raka jetre podijeljene su u kontrolne grupe, DMSO, CoCl2, OXA, OXA plus CoCl2 i CPhGs plus OXA plus CoCl2. Nakon toga, izvršena je kvantitativna PCR reverzna transkripcija i Western blot analiza kako bi se odredili nivoi ekspresije faktora 1 induciranog hipoksijom (HIF-1), lizil oksidaze sličnog 2 (LOXL2) i gena i proteina povezanih s EMT (tj. E -cadherin i Twist), kako bi se istražili efekti CPhG na rak jetre. Rezultati su pokazali da CPhG mogu poboljšati efekte OXA na rak jetre i inhibirati migraciju, invaziju i apoptotičku brzinu stanica raka jetre. Pored toga, tretman CPhGs efikasno je indukovao smanjenje nivoa HIF-1, LOXL2 i Twist-a i povećanje regulacije E-kadherina. Sadašnji nalazi ukazuju na to da CPhG izazivaju značajno povećanje osjetljivosti na OXA i supresiju EMT-a izazvanog hipoksijom u jetri

cistanche korist: anti-Rak jetre

Uvod

Liver cancer is a malignant tumor that usually involves the digestive system, and consists of primary and secondary types. Primary liver cancer is divided into hepatocellular carcinoma and intrahepatic cholangiocarcinoma (1,2). Notably, liver cancer is associated with a high incidence and mortality rate worldwide (3). According to the World Health Organization, it is predicted that there will be >1,000,000 smrtnih slučajeva od raka jetre do 2030. godine, a od novopotvrđenih slučajeva, oni u kontinentalnoj Kini činit će 46,6 posto.

Prijavljeno je da oksaliplatin (OXA) ispoljava inhibitorne efekte na rast raka jetre uz podnošljivu toksičnost u kliničkim uvjetima. Ipak, ukupna efikasnost terapije lijekovima na bazi platine ometa rezistencija tumorskih ćelija (4). Dobro je poznato da rak jetre pokazuje manju osjetljivost na kemoterapiju u poređenju s drugim vrstama raka. Višestruka rezistencija raka jetre doprinijela je njegovoj rezistenciji na brojne terapeutske agense (5). U prethodnoj studiji, Xie i Zhong (6) su izvijestili da su HepG2 ćelije pokazale slabu osjetljivost na adriamicin, 5-fluorouracil i cisplatin u uvjetima hipoksije. Uprkos činjenici da su hemoterapijski agensi na bazi platine glavna opcija za liječenje raka, otpornost na ove lijekove postoji među pacijentima. Nadalje, prognoza pacijenata sa karcinomom jetre ostaje loša (7,8). Do danas su uloženi veliki napori da se ispita rezistencija na lijekove i poboljša osjetljivost na lijekove kod pacijenata s karcinomom jetre.

U uslovima hipoksije dolazi do revaskularizacije u ćelijama raka, što može dovesti do epitelno-mezenhimske tranzicije (EMT) i vaskularne mimikrije (VM). EMT i VM mogu naknadno promovirati invaziju i udaljene metastaze. Štaviše, spekuliše se da EMT služi kao pokretačka snaga za progresiju raka (9). Pored toga, faktori izazvani hipoksijom (HIFs) su uključeni u formiranje novosuđa, energetski metabolizam, ćelijsku proliferaciju, invaziju i metastaze (10).

Protein 2 (LOXL2) sličan lizil oksidazi (LOX) je član porodice LOX i usko je povezan sa kovalentnim poprečnim povezivanjem kolagena i elastina, što može dovesti do fibroze i ključno je za integritet ekstracelularnog matriksa ( 11). U prethodnoj studiji, smatralo se da je LOXL2 blisko povezan sa metastazama ćelija raka (12). Nadalje, pokazalo se da LOXL2 modulira patogenezu i progresiju brojnih vrsta malignih karcinoma kroz ekstra- i intracelularne puteve, što su bili važni indeksi za procjenu loše prognoze (13,14).Herba Cistancheje tonik biljka koja se obično distribuira u pustinjskim regijama, koja se često koristi u tradicionalnoj kineskoj medicini (15,16).Cistanche tubulosa(C. tubulosa)je prirodni biljni lijek koji se obično sadi u autonomnoj regiji Xinjiang. Feniletanoidni glikozidi iz Herba Cistanche (CPhGs) služe kao jedna od glavnih aktivnih komponenti Herba Cistanche. Ranije su Hu i saradnici (17) ukazali da CPhG mogu ublažiti ozljedu jetre kod miševa koji nose tumor H22 i inhibirati rast ćelija raka. Pretpostavljeno je da bi osnovni mehanizam mogao biti povezan sa smanjenjem serumskog fetoproteina i da bi mogao poboljšati imunitet kod miševa.

U ovoj studiji, hipoksični model HepG2 ćelija raka jetre induciran je korišćenjem CoCl2. Na osnovu toga, ova studija je imala za cilj da istraži efekte OXA na proliferaciju, apoptozu, migraciju i invaziju ćelija raka u prisustvu CPhG u hipoksičnim uslovima. Osim toga, otkriveni su nivoi ekspresije mRNA i proteina HIF-1, LOXL2, E-cadherina i Twista. Štaviše, istraženi su tačni mehanizmi koji leže u osnovi efekata CPhG na patogenezu raka jetre.

Prednost ekstrakta cistanche: liječenje raka jetre

materijali i metode

Ćelijska linija. Ćelijska linija raka jetre HepG2, kako je identificirana korištenjem STR metode, obezbijedila je Institucija za klinička istraživanja, Prva pridružena bolnica Medicinskog univerziteta Xinjiang (Urumqi, Kina). Ćelije su uzgajane u visokoglukoznom DMEM-u (HyClone; Cytiva) koji sadrži 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS; Hyclone; Cytiva) na 37°C u inkubatoru koji sadrži 5 posto CO2.

Preparation of CPhGs. C. tubulosa extraction (CPhGs) was obtained from Hetian Dichen Biotech Co., Ltd.. The content of CPhGs was >80 posto, među kojima je sadržaj ehinakozida 44,5 i verbaskoze 16,1 posto. Stabljike C. tubulosa (Schrenk) Wight sakupljene su u oktobru 2016. iz Xinjianga, Kina. Biljku je identifikovao dr. Junping Hu. Svi ovi uzorci vaučera (br. 201610) deponovani su u Herbarijum biljaka, Farmaceutski fakultet, Medicinski univerzitet Xinjiang, Xinjiang, Kina.

Eksperimentalni dizajn. HepG2 ćelije (5x104/ml) tretirane su različitim koncentracijama CPhGs (5, 25, 50, 100, 200 i 500 µg/ml) 48 h na 37˚C (24 h nakon sjetve) na skrining doze CPhGs‑L/M/H. HepG2 ćelije (5x104/ml) su podeljene u sledeće grupe: i) Kontrolna grupa, uzgajana u DMEM sa visokim sadržajem glukoze; ii) DMSO grupa, uzgajana u 0,1 posto DMSO (v/v); iii) CoCl2 grupa (modelna grupa hipoksije), uzgajana u DMEM-u bez seruma koji sadrži 100 µM CoCl2; iv) OXA

grupa (pozitivna kontrolna grupa), uzgajana u 5 µM OXA (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.); v) OXA plus CoCl2 grupa, uzgajana u 5 µM OXA u kombinaciji sa 100 µM CoCl2; i vi) CPhGs grupe, tretirane sa CPhGs‑L/M/H (25, 50 i 100 µg/ml, respektivno) u kombinaciji sa 5 µM OXA i 100 µM CoCl2.

Test vitalnosti ćelija. Vijabilnost ćelija određena je upotrebom Cell Counting Kit-8 (CCK-8) testa prema uputstvima proizvođača (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) i kao što je prethodno opisano (18). Ćelije (2.0x103 ćelije/jamicu) su zasijane u ploče sa 96 jažica. Nakon toga, ~24 h nakon zasijavanja, ćelije su tretirane 48 h prema uslovima tretmana u svakoj grupi. Podloga je zatim zamijenjena sa 100 µl DMEM visoke glukoze, nakon čega je dodat 10 µl CCK-8 reagensa; ćelije su inkubirane 1 h na 37˚C. Optička gustina je izmjerena pomoću čitača mikroploča s više detekcija (Thermo Fisher Scientific, Inc.) na 450 nm. Pripremljeno je šest replika za svako stanje.

Određivanje brzine apoptoze. Stopa apoptoze je određena korištenjem Annexin V/PI Apoptotic Detection Kit (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.). HepG2 ćelije (5x105) su inokulirane u ploče sa 6 jažica na 37˚C u 5% CO2. Nakon toga, ~24 h nakon tretmana, ćelije su kultivisane u DMEM-u bez seruma 4 h. Ćelije su zatim digestirane upotrebom 0,25 posto tripsiniziranog (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), nakon čega su uslijedila najmanje tri ispiranja s prethodno ohlađenim PBS. Nakon centrifugiranja na 167,7 xg tokom 5 minuta na 4˚C, ćelije su resuspendirane sa 1X puferom za vezivanje i koncentracija je podešena na 1~5x106/ml, a zatim obojena sa 5 µl Annexin V‑FITC i 5 µl PI tokom 15 min. na sobnoj temperaturi. Ćelije su zatim podvrgnute protočnoj citometriji koristeći BD LSRFortessa protočni citometar (BD Biosciences) i FlowJo

10.6.2 softver (Tree Star, Inc.).

Test zacjeljivanja rana. Inhibicijski efekti CPhG-a na migraciju ćelija ispitani su testom zarastanja rana (19). Ćelije su posađene u ploče sa 6 jažica dok se ne dobije 1{{4}0 posto konfluentnog monosloja. Nakon toga, ćelije su ranjene pomoću vrha pipete od 200 µl, isprane PBS-om i inkubirane uz tretmane u mediju bez seruma. Nakon tretmana lijekom, brzina zacjeljivanja rane je izmjerena na 0, 12, 24 i 48 h. Slike rane su dobijene pomoću fluorescentnog mikroskopa (Nikon Ti‑S, Japan) pod uvećanjem od x10. Zatvaranje rane je mjereno udaljenosti rane u svakom periodu i izraženo kao postotak početne udaljenosti rane u 0 h.

Transwell testovi. Invazija ćelija je procenjena Transwell testovima. Ćelije (1x105 ćelija/ml) su suspendovane u 200 µl DMEM visoke glukoze bez FBS. Ćelije su zatim posađene u gornje jažice obložene Matrigelom prekrivene polietilen tereftalatnom filter membranom (veličina pora, 8,0 µm). Ukupno 500 µl DMEM sa visokim sadržajem glukoze koji sadrži 10 posto FBS stavljeno je u donju komoru. Pamučni štapići su korišćeni za uklanjanje ćelija na gornjoj površini filtera nakon 48 h na 37˚C. Ćelije koje su prodrle kroz membranu su fiksirane sa 4 posto paraformaldehida na 30 minuta. Nakon toga, ćelije su obojene sa 0,1 posto kristalno ljubičaste boje 15 minuta na sobnoj temperaturi. Invazivne ćelije su posmatrane pod fluorescentnim mikroskopom (Nikon Ti‑S) pri uvećanju od x100.

Kvantitativni PCR reverzne transkripcije (RT-qPCR). Ukupna RNK je ekstrahovana iz HepG2 ćelija korišćenjem TRIzol® reagensa (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), a sinteza cDNA je izvedena korišćenjem PrimeScript RT kompleta reagensa (Takara Bio, Inc.) prema protokolu proizvođača. qPCR je izveden na 7500 PCR sistemu u realnom vremenu (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) koristeći TB green™ Premix Ex Taq™ (Takara Bio, Inc.) prema protokolu proizvođača. Prajmeri koji se koriste za qPCR navedeni su u tabeli I. PCR uslovi su se sastojali od denaturacije na 95˚C tokom 30 sekundi, nakon čega je usledilo 40 ciklusa denaturacije na 95˚C tokom 5 sekundi i žarenja na 60˚C tokom 30 sekundi. Konačno, rezultati amplifikacije su analizirani metodom 2‑ΔΔCq (20).

Western blot analiza. Proteini su ekstrahovani iz ćelija tretiranih 48 h homogenizacijom u RIPA puferu za lizu (Thermo Fisher Scientific, Inc.) koji sadrži inhibitore proteaze i fosfataze. Sadržaj ćelijskih proteina određen je BCA metodom. Proteini (40 µg) su zatim razdvojeni pomoću SDS-PAGE na 10-postotnom gelu i prebačeni na PVDF membranu. Membrana je blokirana u 5% nemasnog mlijeka 1 h na 4˚C i inkubirana sa sljedećim primarnim antitelima: ‑aktin (1:5,000; kat. br. bs‑0061R; BIOSS), HIF ‑1 (1:1,000; kat. br. ab179483; Abcam), LOXL2 (1:500; kat. br. ab179810; Abcam), E-cadherin (1:1,000 ; kat. br. bs‑10009R; BIOSS) i Twist1 (1:500; kat. br. bs‑2441R; BIOSS) preko noći na 4˚C. Membrana je zatim inkubirana sa kozjim anti-zečjim IgG H&L sekundarnim antitelima (1:2,000; kat. br. ab205718; Abcam) 4 h na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja sa TBS-0,05 posto Tween-20, mrlje su vizualizirane korištenjem Enhanced Chemiluminescence sistema (Amersham; Cytiva). Relativni intenzitet traka je polukvantificiran denzitometrijskom analizom korištenjem softvera ImageJ2x (verzija 2.1.4.7; Rawak Software Inc.), a denzitometrijski dijagrami rezultata su normalizirani na intenzitet ‑aktina.

Statistička analiza. Za analizu podataka korišten je softver SPSS 19.0 (SPSS, Inc.). Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna devijacija i analizirani su jednosmjernom ANOVA-om praćenom Tukeyjevim post hoc testom. P<0.05 was="">smatra se da ukazuje na statistički značajnu razliku. Svi eksperimenti su izvedeni najmanje u tri primjerka.

Rezultati

Efekti CPhG na vitalnost ćelija. HepG2 ćelije su tretirane različitim koncentracijama CPhGs (5, 25, 50, 100, 200 i 500 µg/ml) tokom 48 h (24 h nakon zasijavanja). Kao što je prikazano na slici 1, došlo je do značajnog pada vitalnosti ćelija tretiranih sa 200 i 500 µg/ml CPhGs u poređenju sa kontrolnom grupom (P<0.05). these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" could="" modulate="" cell="" viability="" in="" a="" dose‑dependent="">

CPhG pojačavaju efekte OXA na rak jetre. Učinci CPhG-a na vitalnost ćelija HepG2 moduliranih OXA su naknadno procijenjeni (slika 2). Nakon ~48 h, kombinacija CPhGs i OXA značajno je smanjila vitalnost HepG2 ćelija u poređenju sa onim u OXA plusCoCl2 grupa. Konkretno, CPhGs‑M plus OXA plus CoCl2 i CPhGs‑H plus OXA plus CoCl2 značajno su inhibirali vitalnost HepG2 ćelija u poređenju sa OXA plus CoCl2 grupom (P<0.05 and=""><0.01,>

CPhG inhibiraju migraciju i invaziju ćelija raka jetre. Da bi se dalje proučavao invazivni potencijal i migraciona sposobnost ćelija raka jetre nakon tretmana CPhGs i OXA, izvršeni su testovi zarastanja rana i Transwell. Test zarastanja rana je pokazao da je, u poređenju sa onim u DMSO grupi, migracija HepG2 ćelija smanjena nakon tretmana sa CoCl2, OXA i CPhGs (200 ili 500 µg/ml) (P<0.05; fig.="" 3a="" and="" b).="" for="" the="" transwell="" assay,="" the="" invasive="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="" inhibited="" in="" the="" co-treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2)="" compared="" with="" that="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 3c="" and="" d).="" conversely,="" in="" the="" co‑treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2),="" the="" invasive="" potential="" and="" migratory="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="">

Efekti CPhGs i OXA na apoptozu. Nakon tretmana kombinacijom CPhG i OXA za

48 h, HepG2 ćelije su obojene aneksinom V-FITC i PI, nakon čega je uslijedila protočna citometrija kako bi se odredila ćelijska apoptoza. Kao što je prikazano na slici 4A, grupe za ko-tretman (CPhGs‑L/M/H plus OXA plus CoCl2) pokazale su postepeno povećanje udjela apoptotičkih ćelija s povećanjem koncentracije CPhGs. Većina ćelija tretiranih CPhGs i OXA lokalizovana je u Q4 regionu, što ukazuje da je kombinacija CPhGs i OXA izazvala apoptozu u ranoj fazi. U poređenju sa grupom OXA plus CoCl2, značajno povećanje apoptotske stope ćelija otkriveno je u grupama tretiranim OXA, CoCl2 i umjerenim ili visokim dozama CPhGs (P<0.01; fig.="" 4b).="" these="" findings="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" oxa="" and="" cphgs="" may="" contribute="" to="" the="" apoptosis="" of="" hepg2="">

mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist following CPhGs and OXA co‑incubation. There were no statistical differences in the mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist between the control and DMSO groups (P>0.05; Slika 5A‑D). Suprotno tome, CoCl2 je izazvao značajno povećanje nivoa ekspresije mRNA za LOXL2, HIF-1 i Twist u poređenju sa onima u DMSOgrupa (P<0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group,="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" loxl2,="" hif‑1α="" and="" twist="" were="" significantly="" enhanced="" in="" the="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups=""><0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" by="" contrast,="" cocl2="" induced="" a="" significant="" downregulation="" in="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" dmso="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" all="" concentrations="" of="" cphgs="" combined="" with="" oxa="" and="" cocl2="" were="" able="" to="" upregulate="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" these="" results="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" cphgs="" and="" oxa="" effectively="" inhibited="" the="" emt="" under="" hypoxic="">

Nivoi ekspresije proteina HIF-1, LOXL2, E-cadherin i Twist nakon CPhG i OXA koinkubacije. Rezultati western blotinga su otkrili da su nivoi ekspresije proteina HIF-1, LOXL2 i Twist povećani u hipoksičnim uslovima u poređenju sa onima u DMSO grupi. U kontrastu,

nivoi ekspresije proteina E-kadherina su smanjeni u uslovima hipoksije (P<0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" notably,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" hif‑1α,="" loxl2,="" and="" twist="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" cphgs‑m="" +="" oxa="" +="" cocl2="" or="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" compared="" with="" dmso="" group,="" cocl2="" treatment="" significantly="" decreased="" the="" expression="" level="" of="" e‑cadherin.="" in="" the="" cphgs="" groups,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6b).="" these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" treatment="" could="" effectively="" inhibit="" the="" downregulation="" of="" e‑cadherin,="" and="" the="" upregulation="" of="" hif‑1α,="" loxl2="" and="" twist="" induced="" by="">

Diskusija

Hipoksija je uobičajena karakteristika u mikrookruženju raka; ovo je uglavnom povezano sa činjenicom da je proliferacijaćelija raka je brža u poređenju sa vaskularnim formiranjem aberantnih novosuđa. Osim toga, hipoksija utiče na druge biološke procese, uključujući proliferaciju, metastaze i osjetljivost na lijekove (21). Hipoksično mikrookruženje tumora ključno je za patogenezu i progresiju karcinoma, a važno je i za rezistenciju na lijekove i vaskularizaciju karcinoma jetre (22).

U ovoj studiji, HepG2 ćelije su tretirane različitim koncentracijama CPhGs, među kojima CPhGs (200 µg/ml) mogu značajno inducirati smanjenje vitalnosti ćelija. Značajno je da CPhG mogu modulirati staničnu održivost na način koji ovisi o dozi. U uslovima hipoksije, kombinacija OXA i CPhGs (50 ili 100 µg/ml) značajno je inhibirala vitalnost HepG2 ćelija u poređenju sa samo tretmanom OXA. Sličan trend ovisan o dozi primijećen je u testovima migracije i invazije stanica raka jetre. Trenutno su provedene opsežne studije kako bi se istražila uloga apoptoze stanica raka u patogenezi bolesti jetre (23-26). Razvijeno je nekoliko strategija za liječenje raka jetre promicanjem apoptoze (27-29); dakle, smetnje u

Apoptoza HepG2 stanica može poslužiti kao obećavajući kandidat za prevenciju i liječenje raka jetre. Apoptoza HepG2 ćelija je značajno poboljšana nakon tretmana kombinacijom CPhGs‑M/‑H i OXA u poređenju sa onom u ćelijama tretiranim samo sa OXA. Stoga je naznačeno da CPhG mogu značajno pojačati antitumorske efekte OXA.

HIF-1 može povećati nivoe ekspresije E-kadherina, N-kadherina i Vimentina, kao i nekih faktora transkripcije, kao što su Snail1/2, Zeb1 i Twist1. Posljedično, to može dovesti do gubitka ćelijskog polariteta, labavljenja staničnih spojeva, promjena u proteinu citoskeleta i migracije i invazije ćelija raka, što može rezultirati translokacijom ćelija raka u krvožilni sistem kroz bazilarnu membranu. i kasnije metastaze (30). U ovoj studiji, CoCl2 je korišten za induciranje modela hipoksije, koji je pokrenuo povećanje vitalnosti HepG2 ćelija, kao i migraciju i invaziju ćelija. Nadalje, nivoi ekspresije mRNA i proteina HIF-1 su značajno povećani, što ukazuje da je CoCl2 inducirao stvaranje

hipoksično mikrookruženje. Tretman kombinacijom CPhG i OXA značajno je inhibirao nivoe ekspresije mRNA i proteina HIF-1 izazvane hipoksijom. Ovi nalazi sugeriraju da bi CPhG-ovi mogli ublažiti mikrookruženje raka jetre na način koji ovisi o dozi.

E-kadherin je molekul adhezije ovisan o Ca2 plus, koji ima ključnu ulogu u adheziji između stanica, održavanju integriteta strukture tkiva i prijenosu signala. U slučajevima smanjene regulacije ili čak gubitka adhezione funkcije, ćelije raka mogu pokazati nekontrolisanu proliferaciju i dediferencijaciju, što može potaknuti povećanu invaziju ćelija raka i naknadne metastaze (31). Osim toga, E-kadherin je ključan za inhibiciju EMT stanica raka, što je usko povezano s diferencijacijom, invazijom, metastazama i prognozom višestrukih malignih epitela. Transkripcijski faktori koji induciraju EMT (EMT-TF), kao što su Twist, Puž i Zeb, ključni su za EMT. Prijavljeno je da hipoksija aktivira signalne puteve koji induciraju ekspresiju EMT-TF; posebno, mogao bi direktno promovirati EMT putem transkripcione aktivacije ovih faktora (32). Twist je visoko očuvan heliks-prsten-heliks

transkripcijski faktor koji je nedavno identifikovan poslednjih godina. Visoka ekspresija Twist-a je otkrivena u brojnim tipovima ćelija raka (33). Stoga je bitno istražiti povezanost između Twist ekspresije i migracije ili metastaze ćelija raka, kao i kliničke prevencije i liječenja metastaza (34). U ovoj studiji otkriveno je da su nivoi ekspresije mRNA i proteina E-kadherina smanjeni u prisustvu hipoksije, dok su nivoi ekspresije mRNA i proteina Twist-a bili povišeni. Ovi nalazi su bili u skladu s rezultatima testova invazije i migracije, koji su implicirali da hipoksija može doprinijeti pojavi EMT-a. Nakon tretmana sa OXA, nivoi ekspresije proteina E-kadherina su smanjeni; ovo je pokazalo da je OXA pokazala slabu efikasnost u inhibiciji rasta ćelija raka jetre, dok bi mogla promovirati EMT. Međutim, u kombinaciji sa CPhGs, osjetljivost HepG2 ćelija na OXA pokazala je značajno poboljšanje u prisustvu hipoksije. Nadalje, zajednički tretman sa CPhGs i OXA može inhibirati staničnu održivost, migraciju i invaziju HepG2 ćelija. Ova studija je samo otkrila

Twist i E-cadherin ekspresija; stoga, buduće studije imaju za cilj da se fokusiraju na više markera povezanih sa EMT, kako bi se procenio inhibitorni efekat CPhG na EMT izazvan hipoksijom kod raka jetre.

Prijavljeno je da HIF-1 podstiče ekspresiju LOXL2 i da pojačava migraciju i invaziju ćelija raka jetre, što može biti usko povezano sa lošom prognozom raka jetre (30). U prethodnoj studiji, nivoi ekspresije LOXL2 u susednim tkivima raka jetre bili su značajno povećani u poređenju sa onima u tkivima raka (35). Osim toga, bio je usko povezan s invazijom i metastazama raka jetre. Utišavanje gena LOXL2 malom interferirajućom RNK inhibiralo je proliferaciju HepG2 i SMCC-7721 ćelija, što je rezultiralo zaustavljanjem ćelijskog ciklusa ćelija raka i povećanom apoptozom (36). Shao i saradnici (35) su istraživali korelaciju između LOXL2 u uzorcima karcinoma jetre i kliničko-patoloških faktora, VM i prognoze među 201 slučajem koji je operisan radi liječenja. Pretpostavlja se da LOXL2 ima važnu ulogu u patogenezi i progresiji raka jetre, što može poslužiti kao meta za razvoj lijekova. Nadalje, Peng i saradnici (37) su pokazali da LOXL2 može aktivirati signalne puteve puževa/E-kadherina i Src kinaze/fokalne adhezione kinaze, što može doprinijeti patogenezi i progresiji EMT ćelija raka želuca. U ovoj studiji, u uslovima hipoksije, nivoi ekspresije mRNA i proteina LOXL2 su povećani, dok je njegova ekspresija smanjena nakon tretmana sa OXA. Nadalje, liječenje kombinacijom CPhG i OXA rezultiralo je očiglednom smanjenjem ekspresije LOXL2, što može djelotvorno pomoći antitumorskim efektima OXA na rak jetre.

Postoje neka ograničenja za ovu studiju. Ova studija je trebala koristiti još dvije ćelijske linije raka jetre, uključujući SMCC-7721 ćelijsku liniju, ali one nisu mogle biti korištene jer nije bilo moguće kupiti ove ćelijske linije jer su pogrešno identificirane i izvedene su iz HeLa ćelija. Pored toga, ova studija nije analizirala antioksidativne efekte različitih koncentracija CPhG u ćelijama.

U zaključku, CPhG bi mogli mijenjati mikrookruženje hipoksičnog tumora ćelija raka jetre kroz modulaciju HIF-1 signalnog puta. Osim toga, osjetljivost ćelija raka jetre na OXA je značajno povećana kao odgovor na liječenje kombinacijom CPhG i OXA. Ovi nalazi mogu pružiti novu strategiju liječenja za poboljšanje osjetljivosti raka jetre na kemoterapiju.

Priznanja

Nije primjenjivo.

Finansiranje

Ova studija je podržana od strane Ključne laboratorije Xinjiang za prirodne aktivne komponente i tehnologiju oslobađanja lijekova (grant br. XJDX1713), projekat rezervnog kandidata za lidera naučnih i tehnoloških inovacija u autonomnoj regiji Xinjiang Uygur (grant br. 2019XS1), Nacionalna fondacija za prirodne nauke Kine (grant br. 81860735) i Bethune Charitable

Fondacija 'Bethune·Quest-izgradnja kapaciteta za farmaceutsko naučno istraživanje' (grant br. B‑19‑H‑20200622).

Dostupnost podataka i materijala

Skupovi podataka korišteni i/ili analizirani tokom tekuće studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.

Doprinosi autora

LMW i JWZ izveli su eksperimente, izradili rukopis i potvrdili autentičnost svih sirovih podataka. JPH i JHY dizajnirali su ovu studiju. Svi autori su pročitali i odobrili konačni rukopis.

Etičko odobrenje i saglasnost za učešće

Nije primjenjivo.

Pristanak pacijenata za objavljivanje

Nije primjenjivo.

Konkurentni interesi

Autori izjavljuju da nemaju suprotstavljene interese.

Reference

1. Hepatocelularni karcinom. Nat Rev Dis Primers 2: 16019, 2016.

2. Gingold JA, Zhu D, Lee DF, Kaseb A i Chen J: Genomsko profiliranje i metabolička homeostaza kod primarnih karcinoma jetre. Trendovi Mol Med 24: 395‑411, 2018.

3. McGuire S: Svjetski izvještaj o raku 2014. Ženeva, Švicarska: Svjetska zdravstvena organizacija, međunarodna agencija za istraživanje raka, WHO press, 2015. Adv Nutr 7: 418‑419, 2016.

4. Gholamreza K, Jadidi-Niaragh F, Jahromi AS, Zandi K i Hojjat-Farsangi M: Mehanizmi otpornosti tumorskih ćelija na trenutne agense ciljane terapije. Tumor Biol 37: 10021‑10039, 2016.

5. Dong X i Mumper RJ: Nanomedicinske strategije za liječenje tumora rezistentnih na više lijekova: Trenutni napredak. Nanomedicina (Lond) 5: 597‑615, 2010.

6. Xie Y i Zhong DW: AEG-1 je povezan sa hemorezistencijom hepatocelularnog karcinoma izazvanom hipoksijom putem regulacije PI3K/AKT/HIF-1alfa/MDR-1 puta. EXCL J 15: 745‑757, 2016.

7. Xiong H, Ni Z, He J, Jiang S, Li X, He J, Gong W, Zheng L, Chen S, Li B, et al: LncRNA HULC pokreće autofagiju putem stabilizacije Sirt1 i smanjuje hemoosjetljivost HCC ćelija. Oncogene 36: 3528‑3540, 2017.

8. Gade TPF, Tucker E, Nakazawa MS, Hunt SJ, Wong W, Krock B, Weber CN, Nadolski GJ, Clark TWI, Soulen MC, et al: Ishemija inducira mirovanje i ovisnost o autofagiji kod hepatocelularnog karcinoma. Radiologija 283: 702‑710, 2017.

9. Siegel RL, Miller KD i Jemal A: Statistika raka, 2017. CA Cancer J Clin 67: 7-30, 2017.

10. Dong LQ, Shen BQ i Ma Y: Napredak istraživanja mikrookruženja hipoksije u hepatocelularnom karcinomu. Zhong Guo Pu Wai Ji Chu Yu Lin Chuang Za Zhi 25: 1254‑1258, 2018. (na kineskom).

11. Moon HJ, Finney J, Ronnebaum T i Mure M: Ljudska lizil oksidaza slična 2. Bioorg Chem 57: 231-241, 2014.

12. Ferreira S, Saraiva N, Rijo P i Fernandes AS: LOXL2 inhibitori i progresija raka dojke. Antioksidansi (Bazel) 10: 312, 2021.

13. Philp CJ, Siebeke I, Clements D, Miller S, Habgood A, John AE, Navaratnam V, Hubbard RB, Jenkins G i Johnson SR: Unakrsno povezivanje ekstracelularnog matriksa povećava rast fibroblasta i štiti od proteolize matriksa u fibrozi pluća. Am J Respir Cell Mol Biol 58: 594‑603, 2018.

14. Galván JA, Zlobec I, Wartenberg M, Lugli A, Gloor B, Perren A i Karamitopoulou E: Ekspresija represora E-kadherina SNAIL, ZEB1 i ZEB2 tumorskim i stromalnim stanicama utječe na fenotip pupanja tumora i sugerira heterogenost stromalne ćelije kod raka gušterače. Br J Cancer 112: 1944-1950, 2015.

15. Gu C, Yang X i Huang L: Cistanches herba: Pregled neurofarmakologije. Front Pharmacol 7: 289, 2016.

16. Fu Z, Fan X, Wang X i Gao X: Cistanches Herba: Pregled njegove hemije, farmakologije i farmakokinetike. J Ethnopharmacol 219: 233‑247, 2018.

17. Hu Q, You SP, Liu T, Wang B, Liu X i Jiang Y: Istraživanje o efektu cistanchea protiv raka jetre. Carcinog Teratog Mutagena 30: 194‑199, 2018.

18. Mao J, Tian Y, Wang C, Jiang K, Li R, Yao Y, Zhang R, Sun D, ​​Liang R, Gao Z, et al: CBX2 reguliše proliferaciju i apoptozu putem fosforilacije YAP u hepatocelularnom karcinomu. J Cancer 10: 2706‑2719, 2019.

19. Qin Y, Liu HJ, Li M, Zhai DH, Tang YH, Yang L, Qiao KL, Yang JH, Zhong WL, Zhang Q, et al: Salidrozid poboljšava mikrookruženje hipoksičnog tumora i preokreće otpornost na lijekove platine putem HIF-1 signalni put. EBioMedicine 38: 25-36, 2018.

20. Livak KJ i Schmittgen TD: Analiza podataka o relativnoj ekspresiji gena korištenjem kvantitativne PCR u realnom vremenu i 2(‑Delta Delta C(T)) metode. Metode 25: 402-408, 2001.

21. Vaupel P: Fiziologija mikrookoliša tumora i njegove implikacije na onkologiju zračenja. Semin Radiat Oncol 14: 198‑206, 2004.

22. Chen C i Lou T: Hipoksija-inducibilni faktori u hepatocelularnom karcinomu. Oncotarget 8: 46691‑46703, 2017.

23. Schwabe RF i Luedde T: Apoptoza i nekroptoza u jetri: Pitanje života i smrti. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 15: 738‑752, 2018.

24. Kanda T, Matsuoka S, Yamazaki M, Shibata T, Nirei K, Takahashi H, Kaneko T, Fujisawa M, Higuchi T, Nakamura H, et al: Apoptoza i nealkoholne bolesti masne jetre. World J Gastroenterol 24: 2661‑2672, 2018.

25. Pittala S, Kremlin Y i Shoshan-Barmatz V: Ciljanje raka jetre i povezanih patologija kod miševa sa mitohondrijalnim peptidom zasnovanim na VDAC1. Neoplasia 20: 594‑609, 2018.

26. Jing ZT, Liu W, Xue CR, Wu SX, Chen WN, Lin XJ i Lin X: AKT aktivator SC79 štiti hepatocite od apoptoze posredovane TNF-om i ublažava d-Gal/LPS-indukovanu ozljedu jetre. Am J Physiol Gastrointest Fiziol jetre 316: G387‑G396, 2019.