Feniletanoidni glikozidi iz Paraboea Martinii štite ćelije feohromocitoma štakora (PC12) od oštećenja ćelija izazvanih vodikovim peroksidom
Mar 04, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Xue Gong†a, Yan Xu†b, Kai Renc, Xiaorong Baid
Poznato je da oksidativni stres igra bitnu ulogu u patogenezi nekoliko bolesti. Povezuje se s etiologijom Alchajmerove bolesti (AD), Parkinsonove bolesti (PD), epilepsije i drugih bolesti [1–3]. Trenutno je ostvaren kontinuirani napredak u proučavanju patogeneze AD, PD i drugih bolesti. Međutim, zbog ograničenog znanja o molekularnim mehanizmima koji leže u osnovi AD, PD i drugih bolesti, efikasne preventivne ili kurativne strategije za ove bolesti nisu realizovane [4]. H2O2 je važna komponenta reaktivnih vrsta kiseonika (ROS). Shodno tome, H2O2-indukovana povreda PC12 ćelija je najčešće korišćeni model oksidativnog stresa i široko se koristi u eksperimentalnim studijama neuroprotektivnih efekata [5]. Hem oksigenaza 1 (HO-1) i glutamat-cistein ligaza-katalitička podjedinica (GCLC) su važni ćelijski antioksidativni enzimi, a oba gena su regulirana nizvodno od nuklearnog faktora eritroida 2 (Nrf2), koji se pojavljuje kao obećavajući terapeutski cilj za neuroprotekciju [6,7]. Feniletanoidni glikozidi, izvedeni iz jedinice C-6-C-3, sadrže mnoge fenolne hidroksilne grupe i imaju značajno antioksidativno djelovanje i djelovanje protiv starenja. U posljednjih nekoliko godina, studije su pokazale da mnoge ljekovite biljke sadrže feniletanoidne glikozide koji pokazuju značajno antioksidativno djelovanje. Na primjer, feniletanoidni glikozidi izvedeni izHerba cistanchepoznato je da imaju zaštitne efekte na kognitivne deficite u AD. Ta studija je istraživala povezani zaštitni mehanizam korištenjem AD-ubrzanog starenja sklone miša 8 (SAMP8). Rezultati su pokazali da bi sposobnost feniletanoidnih glikozida da ublaže kognitivne deficite kod SAMP8 miševa mogla biti povezana sa promocijom sinaptičke plastičnosti koja uključuje antioksidativne procese [8]. U ovoj studiji, dva feniletanoidna glikozida su odvojena i pročišćena iz Tectona grandis (tikovine) čvorova; ovi spojevi su pokazali značajne antioksidativne efekte koji su utvrđeni amperometrijskom metodom [9]. Nadalje, jedinjenja kafeoil feniletanoidnih glikozida iz Lindernia ruellioides ispoljavaju antioksidativne i superoksidne anionske efekte uklanjanja slobodnih radikala u zavisnosti od doze in vitro [10]. Mehanizmi djelovanja feniletanoidnih glikozida povezani su s regulacijom Nrf2/ARE signalnog puta, koji utiče na sintezu SOD, CAT, GSH-PX i drugih antioksidativnih enzima [11]. Porodica Gesneriaceae, koja sadrži 150 rodova i oko 3700 vrsta, prvenstveno je rasprostranjena u tropskim i umjerenim područjima istočne i južne Azije, Okeanije, Južne Amerike, Afrike, južne Evrope i Meksika [12].
Gesneriaceae u Kini. Prijavljeno je da oko 100 vrsta ima medicinsku učinkovitost i da je većina njih uglavnom rasprostranjena u provincijama Guangxi i Guizhou [13]. Posljednjih godina istraživanja na biljkama Gesneriaceae postupno su se povećavala u različitim dijelovima svijeta, a pronađeni su i neki novi sastojci s fiziološkim aktivnostima [14]. Paraboea martinii (Levl.) Burtt pripada Paraboli (Gesneriaceae) i zeljasta je biljka. Na osnovu "The Chinese Traditional Medicine Resource Records", zabilježeno je da se cijela biljka koristi kao lijek. Štaviše, može ispoljiti mnoge farmakološke aktivnosti u uslovima kao što su hematemeza, edem, dizenterija, traumatske povrede i frakture [15]. Bai je dokazao da su feniletanoidni glikozidi jedan od glavnih kemijskih sastojaka biljaka Gesneriaceae [16]. Neki istraživači su također otkrili da feniletanoidni glikozidi imaju značajno antioksidativno djelovanje [17]. Li je pokazao da feniletanoidni glikozidiCistanche deserticola have significant antioxidant activity [18]. In addition, Ju systematically studied the neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides using PC12 cell models. The results indicated that phenylethanoid glycosides significantly attenuate the damage induced by Aβ1-42 [19]. In our studies, we isolated eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) from P. martini [20]. All compounds were isolated from the genus Parabola for the first time, and the compounds paraboside A, paraboside B, p paraboside I, paraboside II, and paraboside III were new compounds [20]. In a continuing search for molecules with antioxidant properties, phenylpropanoid glycosides were examined. However, whether these phenylpropanoid glycosides from P. martini could protect against H2O2-induced PC12 cell injury was previously unclear. In this study, we examined the protective effects of phenylpropanoid glycosides on H2O2-induced damage to PC12 cells. We also examined the effects and preliminary mechanism underlying the activity of phenylpropanoid glycosides with respect to the activation of HO-1 and GCLC in vitro. Materials and methods Materials Paraboea martini (Level.) Burtt was collected from Daxin County, Guangxi Autonomous Region in August 2014 and verified by Dr. Minhui Li (Baotou Medical College). Voucher specimens were deposited at the Laboratory of Pharmacognosy and Phytochemistry. Eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) were extracted and separated from P. martinii (Levl.) Burtt by prof. Xiaoqin Wang [20]. The purity (>98 posto ) od osam fenilpropanoidnih glikozida izmjereno je HPLC metodom normalizacije površine vrha. Kao primjer, hromatografske karte parabozida B i parabozida II prikazane su na slici 1, a njihov relativni sadržaj je 98,23 posto i 99,20 posto, respektivno. Slabo diferencirana ćelijska linija feohromocitoma nadbubrežne žlijezde pacova (PC12) kupljena je od Banke ćelija pri Kineskoj akademiji nauka (Šangaj, Kina). Dulbecco-ov modificirani Eagleov medijum (DMEM) i konjski serum kupljeni su od Gibco-a (Gaithersburg, MD, SAD). Fetalni goveđi serum (FBS) je nabavljen od Thermo Fisher Scientific (Hyclone, Waltham, MA, USA). H2O2 je dobiven od Tianjin Fu Yu Reagent Co., Ltd. (Tianjin, Kina). Trizol je kupljen od Invitrogena (Carlsbad, CA, USA). PrimeScriptTM RT komplet reagensa (Perfect Real Time) nabavljen je od TaKaRa Biotechnology Co. (Dalian, Kina). Prajmere za HO-1, GCLC i GAPDH sintetizovao je Sangon Biotech (Šangaj, Kina). CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit (MTS) je nabavljen od Promega Corp. (Madison, SAD). Inhibitori HO-1 cink protoporfirina (ZnPP) nabavljeni su od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, SAD). Korišteni su i Thermo311 CO2 inkubator (Thermo, SAD), StepOnePlusTM PCR instrument u realnom vremenu Thermo Cycling Block (Thermo), Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo) i xCELLigence RTCA DPlus Analyzer i E-Plate 16 (ACEA Biosciences, SAD) .
Cistanche deserticola
Ćelijska kultura i tretman
PC12 ćelije su uzgajane u DMEM-u koji sadrži 5 procenata FBS i 5 procenata konjskog seruma na 37 stepeni u vlažnoj atmosferi od 5 procenata CO2. PC12 ćelije su podijeljene u tri grupe kako slijedi: kontrolna grupa, modelna grupa i grupa za tretman. Osam fenilpropanoidnih glikozida je rastvoreno u DMSO (< 0.01%)="" and="" then="" diluted="" with="" a="" complete="" culture="" medium.="" to="" study="" the="" effects="" of="" the="" eight="" phenylpropanoid="" glycosides="" on="" h2="" o2-induced="" cell="" injury,="" pc12="" cells="" were="" cultured="" with="" the="" eight="" compounds="" at="" concentrations="" of="" 3.125,="" 6.25,="" 12.5,="" 25,="" and="" 50="" μm="" for="" 12="">
Određivanje H2O2
Odredili smo odgovarajuću koncentraciju H2O2 koristeći ćelijsku analizu u realnom vremenu (RTCA). PC12 ćelije su posađene u mikroploču CIM-ploče-16 u zapremini od 100 µL i zatim inkubirane 12 h na 37 stepeni u atmosferi od 5 procenata CO2. PC12 ćelije su podijeljene u kontrolne i modelne grupe. Zatim je modelskim grupama dodato 10 μL H2O2 (50, 100, 200 i 400 μM), a kontrolne grupe su tretirane sa 10 μL kompletnog DMEM-a, postavljenog u tri kompleksna bunara. E-Plate 16 je stavljen u xCELLigence RTCA, praćen svakih 15 minuta, a rezultati su snimani 32 h. Učinak H2O2 na PC12 ćelije je analiziran korištenjem xCELLigence RTCA softvera za analizu podataka. Vrijednost ćelijskog indeksa (CI) je korištena za određivanje optimalne koncentracije H2O2 i trajanja djelovanja.
Ekstrakcija i izolacija spojeva
Frakcije su razdvojene na osnovu njihovog polariteta korišćenjem prethodno opisanih metoda. Na zraku osušeni, u prahu P. martini (4 kg) sukcesivno je ekstrahiran tri puta sa 75 posto vodenim rastvorom etanola [20]. Dobijeni ekstrakti su zatim koncentrirani pomoću rotacionog isparivača za uklanjanje etanola i dobiveni su sirovi ekstrakti. Uzorci su rastvoreni u dejonizovanoj vodi i zatim ekstrahovani sukcesivno petroleterom, etil acetatom, n-butanolom i vodom. Ekstrakt n-butanola (400 g) frakcioniran je korištenjem kolone AB-8 makroporozne smole i otopine etanol-H2O2 (0, 1{{47} }, 30, 50, 70 i 95 posto ). Konačno je dobijeno šest frakcija (frakcije 1-6). Frakcije 3 i 4 su podvrgnute razdvajanju koristeći MCI kolonu sa stepenastim gradijentom MeOH-H2O2 (10-100 posto). Zatim su proizvodi izolovani upotrebom Sephadex LH-20 sa 50% MeOH kao eluentom. Jedinjenja 1 (41,0 mg) i 6 (15,6 mg) su izolovana iz frakcije 3. Jedinjenja 2 (62,0 mg), 3 (34,7 mg), 7 (11,0 mg) i 8 (26,0 mg) su dobijena iz frakcije 4 upotrebom Sephadexa LH{49}} hromatografija sa 50% MeOH kao eluentom. Konačne izolacije su izvedene polupripremnim HPLC-om reverzne faze (Merck LiChrosorb, RP-18, RP-18, 250 × 10 mm) sa 50 posto MeOH i UV detekcijom na 280 nm da bi se dobila jedinjenja 4 (39,0 mg) i 5 (9,0 mg) [20].
Test vitalnosti ćelija
PC12 ćelije su zasijane u 96-ploče sa jažicom u gustini od 2 × 1{{10}}4 ćelije po jažici pri konačnoj zapremini od 100 µL . PC12 ćelije su inkubirane na 37 stepeni sa 5 procenata CO2 tokom 12 sati. Zatim su ćelije tretirane različitim koncentracijama sirovih ekstrakata (0.025, 0.05, 0.1, 0.2 i 0.4 mg/mL) i jedinjenja 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8 u pet koncentracija (3,125, 6,25, 12,5, 25 i 50 μM). Nakon prethodnog tretmana od 24 h, vitalnost ćelija je određena MTS testovima. PC12 ćelije su prethodno inkubirane sa ili bez HO-1 inhibitora bez ZnPP (15 μM) 30 minuta, zatim inkubirane sa ili bez kaleolariozida B, parabozida B i parabozida II (3,125 μM) 12 h i na kraju inkubirane sa 400 μM H2O2 još 6 h. Nakon tretmana, broj preživjelih ćelija određen je MTS testom [6].
Zaštitni efekti sirovih ekstrakata i monomernih jedinjenja na PC12 ćelije tretirane H2O2-
Ćelije su kultivisane u {{0}}ploči sa jažicom pri konačnoj zapremini od 100 µL. Tretiranoj grupi dodana su serijska razrjeđenja sirovih ekstrakata (0.025, 0,05, 0,1, 0,2 i 0,4 mg/mL). Nakon prethodnog tretmana od 12 h, 400 μM rastvora H2O2 (optimalne koncentracije) dodano je tretiranoj grupi i H2O2 grupi svake jažice tokom 6 h. MTS rastvor je zatim dodat u svaki bunar, a ploče su inkubirane 3 h na 37 stepeni C. Ploče su oscilovane malom brzinom 5 minuta na sobnoj temperaturi dok se svi kristali nisu potpuno rastvorili. Zaštita ćelija određena je na osnovu rezultata MTS testa prema proizvođačevom 2204 X. GONG ET AL. Preuzeto sa https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145 od strane gosta 27. avgusta 2021. uputstva. Optička gustina je određena pri talasnoj dužini apsorbancije od 490 nm. Dalje smo pratili aktivnost jedinjenja 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8 izolovanih iz frakcija 3 i 4. Serijska razblaženja jedinjenja 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8 (3.125, 6.25, 12.5, 25 i 50 μM) su dodani tretiranoj grupi da bi se odredili njihovi zaštitni efekti na H2O{57}}indukovane PC12 ćelije.
feniletanoidni glikozidi iz Cistanche deserticola: Štiti neurone i protiv starenja
Kvantitativni PCR u realnom vremenu (qRT-PCR)
PC12 ćelije su sakupljene 12 h nakon tretmana sa 3,125 μM kaleolariozidom B, parabozidom B i parabozidom II. Ukupna RNK je ekstrahirana korištenjem TRIzol reagensa, a alikvoti ukupne RNK su reverzno transkribovani korištenjem Primescript RT Master Kita prema uputama proizvođača. Sljedeći prajmeri su korišteni za eksperimente u skladu s prethodnim izvještajem [21]. HO-1: Naprijed 5′ -GC CTGCTAGCCTGGTTCAAG-3′, nazad 5′ -AGC GGTGTCTGGGATGAACTA-3′; GCLC: Naprijed 5′ - GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3′, Nazad 5′ -TG TTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3′; GAPDH: Naprijed 5′-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3′, nazad 5′- GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3′. Alikvoti dobijenih cDNK su zatim amplificirani PCR-om. Reakcioni uslovi su bili sledeći: početna denaturacija na 95 stepeni (30 s), zatim 40 ciklusa na 95 stepeni (5 s), 60 stepeni (34 s) i 72 stepena (35 s). Svi prajmeri su testirani i detektovan je FL fluorescentni signal; zatim je izračunata vrijednost △Ct i relativne vrijednosti su upoređene sa onima iz kontrolne grupe koristeći sljedeću jednačinu: △Ct=Ct (uzorak) − Ct (endogena kontrola), △△Ct {{36} } △Ct (uzorak) −△Ct (netretirano), i preklopna promjena=2−△△Ct. Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH) je korištena kao interna kontrola.
Ekstrakcija proteina
PC12 ćelije su zasijane na posudama od 100- mm pri 1 × 107 ćelija po posudi. Nakon vezivanja, ćelije su tretirane kaleolariozidom B, parabozidom B i parabozidom II (3,125 µM) tokom 12 sati. Glikozidi su zatim uklonjeni, a ćelije su inkubirane sa H2O2 još 6 h. Nakon inkubacije, ćelije su dva puta isprane hladnim PBS-om i sastrugane sa posuda sa 1 mL PBS-a. Ćelijski homogenati su centrifugirani na 1500 rpm tokom 10 min. Nakon tretmana, ćelijski proteini su ekstrahovani korišćenjem Beyotime RIPA pufera za lizu ćelija sa 1 mM PMSF prema uputstvima proizvođača. Osim toga, izolirani su citoplazmatski i nuklearni proteini kako je opisano u Beyotime protokolu kompleta za nuklearnu i citoplazmatsku ekstrakciju. Koncentracije proteina u uzorcima detektovane su upotrebom Beyotime BCA proteinskog kompleta, a svi uzorci su pohranjeni na -80 stepeni za Western blotting analizu [6].
Western blot analiza
SDS-PAGE elektroforeza je izvedena nakon ekstrakcije i naknadne denaturacije ukupnog proteina iz različitih grupa. Nakon elektroforeze, protein je prebačen na PVDF membrane, koje su zatim blokirane 5% obranog mlijeka u prahu 4 h. Nakon pranja, primarno antitijelo (zečje poliklonsko antitijelo GAPDH (1:10,000 razrjeđenje), zečje poliklonsko antitijelo HO-1 (1:1000 razrjeđenje) ili zečje poliklonsko antitijelo GCLC (1:1000 razrjeđenje) Membranama je dodato, koje su inkubirane preko noći na 4 stepena.Sljedećeg dana, PVDF membrane su isprane tri puta u TTBS-u. Zatim je sekundarno antitijelo (konjugirani afinitet čisti kozji anti-zečji IgG (1:1000 razrjeđenje) označeno sa membranama je dodana peroksidaza hrena, koje su zatim inkubirane na sobnoj temperaturi 2 h. PVDF membrane su isprane i podvrgnute ECL hemiluminiscencionom detekcijskom reagensu za signaliziranje ekspozicije na rendgenskom filmu, koji je zatim fiksiran i skeniran [22].
Statistička analiza
Podaci su analizirani pomoću SPSS 19.0, a rezultati su predstavljeni kao srednje vrijednosti sa standardnom devijacijom (SD) tri nezavisna eksperimenta. Smatra se da vrijednosti p < 0.05="" ukazuju="" na="" statistički="" značajne="">
Rezultati Uspostavljanje H2O2 modela
Kao što je prikazano na slici 2, H2O2 pri 50, 100 i 200 μM nije uzrokovao odgovarajući nivo ćelijske smrti. Međutim, 400 μM H2O2 djelovalo je na PC12 ćelije u roku od 2-6 h, a oksidativno oštećenje stanica bilo je stabilno. Stoga smo smatrali da je indukcija s H2O2 u koncentraciji od 400 μM tijekom 6 h bila prikladna za oponašanje ozljede PC12 stanica uzrokovane oksidativnim stresom.
Zaštitni efekti sirovih ekstrakata na PC12 ćelije tretirane H2O2
U poređenju sa onim u grupi modela H2O2 (slika 3), ekstrakt n-butanola u koncentracijama od 0.05, 0.1, {{10} }.2 i 0.4 mg/mL značajno su poboljšali oksidativno oštećenje PC12 ćelija izazvano H2O2 (p < 0.05)="" na="" način="" ovisan="" o="" koncentraciji.="" ovi="" podaci="" sugeriraju="" da="" frakcija="" n-butanola="" sadrži="" snažniju="" zaštitnu="" aktivnost.="" međutim,="" ekstrakti="" petrolej="" etera="" i="" etil="" acetata="" pokazali="" su="" zaštitnu="" aktivnost="" samo="" pri="" visokim="" koncentracijama="" (petroleter:="" 0.1="" i="" 0.2="" mg/ml,="" p="">< 0.{{31}="" }5;="" etil="" acetat:="" 0,2="" i="" 0,4="" mg/ml,="" p="">< 0,05).="" osim="" toga,="" različite="" koncentracije="" ekstrakta="" vodene="" faze="" nisu="" pokazale="" zaštitne="" efekte="" (p=""> 0,05). Nadalje, dodali smo podatke iz validacijske studije koristeći SH-SY5Y ćelijske linije humanog neuroblastoma (SH-SY5Y) u Dodatni fajl. Tretman sa 250 μM H2O2 rezultirao je smanjenom vitalnošću ćelija; međutim, tretman kaleolariozidom B, parabozidom B i parabozidom II (3,125, 6,25, 12,5, 25 i 50 μM) značajno je oslabio smrt ćelije SH-SY5Y. Rezultati eksperimenta su dokazali da kaleolariozid B, parabozid B i parabozid II štite SHSY5Y ćelije od H2O2-indukovane povrede ćelija.
Strukture spojeva izoliranih iz frakcije n-butanola
Da bismo potvrdili da ekstrakt n-butanola sadrži aktivne komponente, dalje smo frakcionirali osam spojeva iz ekstrakcije. Strukture jedinjenja 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8 identifikovane su različitim spektralnim podacima (1 H-NMR, 13C-NMR i ESI-MS) na osnovu poređenja sa objavljenim podacima za parabozid A , parabozid B, parabozid I, parabozid II, parabozid III, nuomiozid A, kaleolariozid B i izonuomiozid A [20]. Na primjer, podaci za parabozid B bili su sljedeći: smeđa guma; ½ 20 D −55,7 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (logε): 220 (3,61), 291 (3,54), 330 (3,66) [20]; IRKBr max cm−1 : 3392, 2943, 2885, 1699, 1683, 1606, 1521, 1361, 1282, 1163, 1114, 1039, 995, 817 cm−1 [20]; za 1H i 13C NMR spektroskopske detaljne podatke prikazane u referenci 20; HR-ESI-MS (negativno) m/z 741,2231 [MH]− (izračunato za C33H41O19, 741,2242) [20]. Podaci za parabozid II bili su sljedeći: bijeli amorfni prahovi; ½ 20 D −80,5 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (logε): 229 (3,74), 322 (3,73) [20]; IRKBr max cm−1 : 3419, 1699, 1625, 1596, 1515, 1456, 1419, 1263, 1159, 1139, 1068, 1022, 808 cm−1 [20]; za 1H i 13C NMR spektroskopske detaljne podatke prikazane u referenci 20; ESI-MS (negativno) m/z 637
Zaštitni efekti izolovanih jedinjenja protiv toksičnosti izazvane H2 O2-u PC12 ćelijama
MTS testovi su korišćeni da se ispita efekat izolovanih jedinjenja na vitalnost PC12 ćelija izloženih toksičnosti izazvanoj H2O2-. Kao što je prikazano na slici 5, u poređenju sa onom u kontrolnoj grupi, PC12 ćelije prethodno tretirane sa pet različitih koncentracija kaleolariozida B, parabozida B, parabozida II ili parabozida A (3.125, 6.25, 12.5, 25 i 50 μM) tokom 24 h nisu pokazale značajne razlike u vijabilnosti ćelija (p > 0,05). Dakle, predtretman PC12 ćelija kaleolariozidom B, parabozidom B i parabozidom II nije rezultirao citotoksičnošću. Kao što je prikazano na slici 6, 400 µM H2O2 značajno je smanjilo vitalnost ćelija u poređenju sa onom u kontrolnoj grupi. Štaviše, vitalnost ćelija PC12 tretiranih H2O2- značajno se povećala nakon prethodnog tretmana PC12 ćelija različitim koncentracijama kaleolariozida B, parabozida B i parabozida II; nadalje, vitalnost ćelija bila je najveća nakon tretmana sa 50 µM kaleolariozidom B, 50 µM parabozidom B i 12,5 µM parabozidom II. Ostalih pet jedinjenja nije pokazalo značajne zaštitne efekte na PC12 ćelije tretirane H2O2-. Da bismo ilustrirali ovaj nalaz, razmatramo jedan od njih kao primjer, dok ostali nisu opisani u rukopisu.
Nivoi transkripcije HO-1 i GCLC
Zatim smo testirali nivoe transkripcije HO{{0}} i GCLC u PC12 ćelijama tretiranim kaleolariozidom B, parabozidom B i parabozidom II. Ukupna mRNA je sakupljena iz tretiranih i netretiranih PC12 ćelija tokom 12 sati, a zatim podvrgnuta analizi ekspresije pomoću qRT-PCR. Kao što je prikazano na slici 7(a,c,e), nivoi transkripcije HO-1 značajno su porasli nakon što su PC12 ćelije prethodno tretirane naznačenim koncentracijama kaleolariozida B, parabozida B i parabozida II tokom 12 h (p < 0.05).="" kao="" što="" je="" prikazano="" na="" slici="" 7(b),="" nivoi="" transkripcije="" gclc="" su="" takođe="" značajno="" porasli="" u="" pc12="" ćelijama="" prethodno="" tretiranim="" naznačenim="" koncentracijama="" kaleolariozida="" b="" tokom="" 12="" h.="" međutim,="" nivoi="" gclc="" u="" pc12="" ćelijama="" prethodno="" tretiranim="" parabozidom="" b="" tokom="" 12="" sati="" značajno="" su="" se="" smanjili="" u="" poređenju="" sa="" onima="" u="" grupi="" modela="" (p="">< 0,05;="" slika="" 7(d)).="" nadalje,="" uz="" tretman="" parabozidom="" ii,="" nivoi="" gclc="" u="" pc12="" ćelijama="" nisu="" se="" značajno="" razlikovali="" od="" onih="" u="" grupi="" modela="" (p=""> 0,05; Slika 7(f)).
Izraz HO-1 i GCLC
HO{{0}} i GCLC su važni ćelijski antioksidativni enzimi, i oba su Nrf2-regulisani nizvodni geni. Ekspresija proteina HO-1 i GCLC također je uočena nakon tretmana [6]. Slika 8 prikazuje nivoe proteina HO-1 i GCLC u PC12 ćelijama nakon tretmana sa 400 μM H2O2; rezultati su pokazali da su FL fluorescentni intenziteti HO-1 u grupama kaleolariozida B i parabozida B veći od onih u grupama tretiranim H2O2- (Slika 8(a,c)). Međutim, ekspresija GCLC nije značajno promijenjena od strane jedinjenja, osim kaleolariozida B (Slika 8(b)). Zatim su korišteni hemijski inhibitori HO-1 za daljnju procjenu uloge antioksidativnih enzima u regulaciji zaštitnih efekata kaleolariozida B, parabozida B ili parabozida II protiv citotoksičnosti izazvane H2O{17}}. Kaleolariozid B, parabozid B i parabozid II (3,125 µM) spriječili su citotoksičnost izazvanu H2O2-, ali su takvi zaštitni efekti poništeni inhibitorom HO-1 ZnPP (p < 0,01)="" na="" 15="" µm="" (slika="" 8="">
Prednosti Cistanchea: Povećajte reprodukciju muškaraca
Diskusija
Starenje stanovništva je ozbiljan globalni problem. Mnoge bolesti su povezane sa senilnošću, kao što su AD i PD, koje predstavljaju ozbiljne prijetnje javnom zdravlju. AD i PD su se pojavile kao treće najsmrtonosnije bolesti u svijetu, nakon kardiovaskularnih bolesti i raka. Stoga je neurodegeneracija postala hitna tema istraživanja širom svijeta. Međutim, patogeneza AD i PD, neurodegenerativnih bolesti centralnog nervnog sistema, do danas je ostala nejasna. Nadalje, postoji samo nekoliko lijekova koji mogu efikasno liječiti AD ili PD zbog svojih složenih patogenih mehanizama [23]. Prethodne studije su pokazale da su ROS, kao što su superoksidni anjon (O2−) i H2O2, glavni faktori koji doprinose neurodegenerativnim bolestima. Patološke promjene tokom PD uključuju neuronsku degeneraciju i smrt supstancije nigre i striatalnog dopamina [24,25]. U skladu s tim, važno je razviti učinkovite antioksidativne lijekove za liječenje PD, a takvo otkriće lijekova postalo je važan smjer istraživanja [26]. Trenutno se čini da je signalni put Nrf2/ARE najvažniji put endogenog antioksidativnog stresa [27]. Ares se nalazi u rangiranim regionima gena 5′-ispuna, kao što su HO-1 i GCLC [28,29]. HO-1 i GCLC su Nrf2-srodni geni koji su regulisani nizvodno od ovog proteina [6]. ARE mogu naknadno uticati na nivoe antioksidanata i aktivirati ekspresiju HO-1 i drugih zaštitnih gena, što može poboljšati aktivnosti zaštite ćelija [30,31]. Nadalje, nalazi sugeriraju da se zaštitni efekti resveratrola protiv A {{2{{50}}}} izazvane toksičnosti u PC12 ćelijama javljaju kroz pojačanu regulaciju HO{22}} ekspresije putem aktivacije Nrf2 intracelularnog signalni put [32].PC12 ćelije su prihvaćeni model neuralnih ćelija i intenzivno se koriste u studijama neuroprotektivnih efekata [33]. H2O2 može lako proći kroz staničnu membranu i spojiti se sa željezom kako bi formirao visoko aktivne slobodne radikale, koji induciraju oksidativni stres i ozljede stanica [34]. H2O2 je važan ROS, a slobodni radikali se lako stvaraju i relativno su stabilni, pa se obično koriste za uspostavljanje modela oksidativnog stresa pomoću PC12 ćelija [5]. U ovoj studiji, predtretman PC12 ćelija netoksičnim koncentracijama biljnog ekstrakta štiti ćelije od H2O2-indukovane citotoksičnosti smanjujući stvaranje ROS. Feniletanoid glikozidi sadrže mnoge fenolne hidroksilne grupe koje imaju antioksidativno djelovanje i djelovanje protiv starenja. U ovoj studiji smo otkrili da ekstrakcija n-butanola daje bolju zaštitu od ostalih frakcija polariteta (Slika 3). Stoga smo dalje pregledali zaštitne aktivnosti osam spojeva izolovanih iz frakcije n-butanola. Rezultati su po prvi put pokazali da Slika 8. Analiza nivoa HO-1 i GCLC proteina na PC12 ćelijama. (a) Western blot analiza ekspresije HO-1 i GCLC i GAPDH korištena je kao kontrola opterećenja. (b) Western blot analiza Ekspresija GCLC proteina. (c) Western blot analiza Ekspresija proteina HO{45}}. (d) HO-1 inhibitor ZnPP je smanjio neuroprotektivni efekat. Podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± SD, n=3. ***p < 0.001="" u="" odnosu="" na="" kontrolnu="" grupu;="" #p="">< 0,05="" naspram="" h2o2="" grupe="" (bez="" tretirane="" znpp),="" ##p="">< 0,01="" naspram="" h2o2="" grupe="" (bez="" tretirane="" znpp),="" ###p="">< 0,001="" naspram="" h2o2="" grupe="" (bez="" tretirane="" znpp);="" i="" p="">< 0,01,="" naspram="" h2o2="" grupe="" (sa="" tretiranim="" znpp),="" i="" &p="">< 0,001,="" naspram="" h2o2="" grupe="" (sa="" tretiranim="" znpp).="" (kontrolna="" grupa;="" grupa="" modela:="" h2o2;="" znpp="" negativna="" grupa:="" kaleolariozid="" b="" plus="" h2o2,="" parabozid="" b="" plus="" h2o2,="" parabozid="" ii="" plus="" h2o2;="" znpp="" pozitivna="" grupa:="" znpp="" plus="" kaleolariozid="" b="" plus="" h2o2,="" znpp="" plus="" parabozid="" b="" plus="" h2o2,="" znpp="" plus="" parabozid="" ii="" plus="" h2o2).="" 2210="" x.="" gong="" i="" dr.="" preuzeto="" sa="" https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145="" od="" strane="" gosta="" 27.="" avgusta="" 2021.="" kaleolariozid="" b,="" parabozid="" b="" i="" parabozid="" ii="" imaju="" značajne="" zaštitne="" efekte="" protiv="" oksidativnog="" djelovanja="" izazvanog="" h2o{92}}="" oštećenja="" u="" pc12="" ćelijama.="" rezultati="" su="" takođe="" pokazali="" da="" tretman="" h2o2="" izaziva="" značajnu="" povredu="" ćelija="" pc12="" i="" smanjuje="" vitalnost="" ćelija,="" dok="" tretman="" kaleolariozidom="" b,="" parabozidom="" b="" i="" parabozidom="" ii="" značajno="" ublažava="" ove="" efekte="" (slika="" 6).="" prethodna="" studija="" je="" objavila="" da="" je="" put="" nrf2/are="" jedan="" od="" najvažnijih="" endogenih="" antioksidativnih="" puteva="" i="" da="" može="" povećati="" ekspresiju="" nizvodnih="" markera,="" kao="" što="" je="" ho-1,="" kako="" bi="" zaštitio="" ćelije="" [7].="" rezultati="" qrt-pcr="" i="" western="" blotting="" analiza="" pokazali="" su="" da="" kaleolariozid="" b,="" parabozid="" b="" i="" parabozid="" ii="" značajno="" povećavaju="" nivoe="" ho{102}}.="" međutim,="" nivoi="" transkripcije="" gclc="" značajno="" su="" se="" povećali="" u="" pc12="" ćelijama="" prethodno="" tretiranim="" kaleolariozidom="" b,="" ali="" su="" se="" smanjili="" kod="" onih="" prethodno="" tretiranih="" parabozidom="" b="" u="" poređenju="" sa="" onima="" u="" modelnoj="" grupi.="" nadalje,="" parabozid="" ii="" nije="" promijenio="" ekspresiju="" ovog="" markera,="" u="" poređenju="" sa="" onom="" u="" grupi="" modela="" (slike="" 7="" i="" 8="" (a–c)).="" pored="" toga,="" zaštitni="" efekti="" kaleolariozida="" b,="" parabozida="" b="" i="" parabozida="" ii="" protiv="" h2o2-indukovane="" povrede="" pc12="" ćelija="" su="" poništeni="" ho-1="" inhibitorom="" znpp="" (slika="" 8(d)).="" u="" zaključku,="" feniletanoidni="" glikozidi="" kaleolariozid="" b,="" parabozid="" b="" i="" parabozid="" ii="" efikasno="" su="" štitili="" pc12="" ćelije="" od="" h2o2-indukovanog="" oksidativnog="" oštećenja.="" u="" skladu="" s="" tim,="" ova="" jedinjenja,="" izolirana="" iz="" p.="" martini,="" mogu="" predstavljati="" potencijalne="" kandidate="" za="" lijekove="" za="" liječenje="" neurodegenerativnih="">
Prednosti Cistanchea:liječenje neurodegenerativnih bolesti
Reference
[1] Butterfield DA. Perspektive oksidativnog stresa kod Alchajmerove bolesti i predviđanja budućih naglasaka u istraživanju. J Alzheimers Dis. 2018;64:1–11.
[2] Chignon C, Tomas M, Bonnefontrousselot D, et al. Oksidativni stres i amiloid-beta peptid u Alchajmerovoj bolesti. Redox Biol. 2018;14:450–464.
[3] Guo JD, Zhao X, Li Y, et al. Oštećenje dopaminergičkih neurona oksidativnim stresom kod Parkinsonove bolesti (pregled). Int J Mol Med. 2018;41:1817–1825.
[4] Bai Y, Dong LH, Huang XH, et al. Povezanost polimorfizama rs823128, rs1572931 i rs823156 sa smanjenim rizikom od Parkinsonove bolesti. Neuroreport. 2017;27:936–941.
[5] Han XH, Zhu SL, Wang BX, et al. Antioksidativno djelovanje 7,8-dihidroksiflflavona štiti ćelije PC12 od 6-citotoksičnosti izazvane hidroksidopaminom. Neurochem Int. 2014;64:18–23.
[6] Li MQ, Xu T, Zhou F, et al. Neuroprotektivni efekti četiri feniletanoidna glikozida na H2O2-indukovanu apoptozu na PC12 ćelijama putem Nrf2/ARE puta. Int J Mol Sci. 2018;19:1135.
[7] Buendia I, Michalska P, Navarro E, et al. Nrf2-ARE put: nova meta protiv oksidativnog stresa i neuroinflamacije kod neurodegenerativnih bolesti. Pharmacol Therapeut. 2016;157:84–104.
[8] Jia XJ, Yan XS, Cai ZP, et al. Efekti feniletanoidnih glikozida, izvedeni izHerba cistanche, o kognitivnim deficitima i antioksidativnim aktivnostima kod mužjaka SAMP8 miševa. J Toxicol Env Heal A. 2017;80:1180–1186.
[9] Tsvetkov DE, Dmitrenok AS, Tsvetkov YE, et al. Feniletanoidni glikozidi iz čvorova tikovine i njihovo antioksidativno djelovanje. J Biol Active Prod Nat. 2016;6:272–281.
[10] Zhang YQ, Gao EY, Liang CQ, et al. Antioksidativna aktivnost jedinjenja kafeoil feniletanoidnih glikozida iz Lindernia ruellioides in vitro. Cent South Pharm. 2017;15:1687–1690.
[11] Wu ZH, Ma YF, Zhao L, et al. Uloga Nrf2-ARE puta u ozljedi oksidativnog stresa i njegov odnos s drugim signalnim putevima. Anim Husbandry Feed Sci. 2016;37:42–48.
[12] Zheng XK, Li J, Feng WS, et al. Napredak u proučavanju Gesneriaceae. Chin J Nova droga. 2003;12:261–263.
[13] Wen F, Li ZD. Napredak u istraživanju biljke Gesneriaceae. Chin Wild Plant Resour. 2006;25:1–6.
[14] Yan WY, Chen L, Wang JM, et al. Napredak istraživanja triterpenoida biljaka Gesneriaceae. Nat Prod Res Dev. 2012;24:698–701.
[15] Kineska kompanija za biljnu medicinu. Izvori kineske tradicionalne medicine. Kina: Science Press; 1994.
[16] Bai ZF, Wang XQ, Xiao PG, et al. Distribucija feniletanoidnih glikozida u ljekovitim biljkama Gesneriaceae. Chin J Chin Mater Med. 2013;38:4267–4270.
[17] He ZD, Lau KM, Xu HX, et al. Antioksidativna aktivnost feniletanoidnih glikozida iz Brandisia hancei. J Ethnopharmacol. 2000;71:483–486.
[18] Li L, Shi DF, Gui YG, et al. Studija o antioksidativnim aktivnostimafeniletanoidni glikozidi iz Cistanche deserticola. J Anhui Agri Sci. 2009;32:15835–15836.
[19] Ju BW, Yang JH, Yan Y, et al. Zaštitni efektiglikozidi cistanheo oštećenju PC12 ćelija PARABOLA MARTINI ZAŠTITI PC12 ĆELIJE OD POVREDE OD H2O2-INDUCIRANIH 2211
