Izolacija i pročišćavanje feniletanoidnih glikozida iz Cistanche Deserticola brzom protivstrujnom hromatografijom

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Li a,b, Rong Tsao b,*, Raymond Yang b, Chunming Liu a, J. Christopher Young b, Honghui Zhu b

Abstract

Pet feniletanoidnih glikozida (PhGs), ehinakozida, cistanozida A, akteozida, izoakteozida i 20-acetilakteozida, izolovano je i pročišćeno izCistanche deserticolapo prvi put protivstrujnom hromatografijom velike brzine (HSCCC) koristeći dva dvofazna sistema, jedan koji se sastoji od etil acetat-etanol-voda (5:0.5:4.5, v/v/v) i drugi etil acetat–n-butanol–etanol–voda ({{10}}.5:0.5:0.1:1, v/v/v/v). Ukupno 28,5 mg ehinakozida, 18,4 mg cistanozida A, 14,6 mg akteozida, 30,1 mg izoakteozida i 25,2 mg 20-acetilakteozida je prečišćeno iz po 1412 mg ekstrakta n-butanicola C. na preko 92,5 posto čistoće kako je utvrđeno HPLC. Strukture su identificirane prema vremenu retencije, UV, LC–ESI-MS u načinu negativnih jona i potvrđene NMR eksperimentima. Razmatran je karakterističan obrazac fragmentacije LC–ESI-MSn za pet jedinjenja i utvrđeno je da je to vrlo specifično i korisno sredstvo za strukturnu identifikaciju PhG iz ove važne ljekovite biljke.

Ključne riječi:Cistanche deserticola; feniletanoid; Echinacoside; Cistanoside A; Acteoside; izoakteozid; 20-Acetilakteozid; HSCCC; LC–ESI-MS; NMR

1. Uvod

Cistanche deserticola YC Maje dobro poznati kineski biljni lijek i naširoko se koristi u tradicionalnim preparatima sličnim današnjim funkcionalnim sastojcima hrane ili dodacima ishrani (Wong, Li, Cheng, & Chen, 2006). Glavni bioaktivni sastojci u C. deserticola su feniletanoidni glikozidi (PhG), uključujući ehinakozid, akteozid, izoakteozid, 20-acetilakteozid i cistanozid A (Kobayashi, Karasawa, & Miyase, 1984; Kobayashi19 i sar.). PhG su široko rasprostranjeni u biljnom carstvu i opsežno su proučavani zbog svojih različitih bioloških funkcija kao što su hepatoprotektivna (Xiong et al., 1998), protuupalna, antinociceptivna aktivnost (Schapoval et al., 1998) i antioksidativna aktivnost ( Cheng, Wei, Guo, Ni, & Liu, 2005; He, Lau, Xu, Li, & But, 2000; Li, Wang, & Wang, 1997; Li, Wang, Zheng, Liu, & Jia, 1993; Wang, Jiang, Wu, & Wang, 2001; Xiong, Kadota, Tani, & Namba, 1996), poboljšanje seksualne funkcije (Xie & Wu, 1993; Zong, He, Wu, & Chen, 1996) i sedativni učinak (Lu, 1998 ).

Zbog gore navedenih značajnih bioaktivnosti, velike količine čistih jedinjenja su hitno potrebne kao referentni standardi i za različite in vitro i in vivo studije vezane za upotrebu tradicionalnih kineskih lijekova. Stoga postaju neophodne efikasne metode za izolaciju, pročišćavanje i strukturnu karakterizaciju PhG. Međutim, takav rad obično zahtijeva korištenje višestrukih hromatografskih koraka za čišćenje i izolaciju uzoraka (Gross, Lahloub, Anklin, Schulten i Sticher, 1988; Nishimura, Sasaki, Inagaki, Chin, & Mitsuhashi, 1991; Ravn, Nishibe , Sasahara, & Li, 1990; Shoyama, Matsumoto, & Nishioka, 1987), što obično rezultira niskim stopama oporavka zbog ireverzibilne adsorpcije PhG-a na čvrstu podlogu tokom separacije (Lei et al., 2001). Nasuprot tome, hromatografija velike brzine protiv struje (HSCCC) postala je efikasna alternativa konvencionalnim hromatografskim tehnikama za odvajanje nekih PhG iz biljnih ekstrakata (Lei et al., 2001; Li et al., 2005). Lei et al. uspješno odvojen od akteozida i 20-acetilakteozidaCistanches salsa(CA Mey.) G. Beck koristeći HSCCC (Lei et al., 2001). Autori ovog rada su ranije izvijestili o razdvajanju akteozida i izoakteozida iz Plantago psyllium L. od strane HSCCC (Li et al., 2005). Međutim, nije objavljen nijedan izvještaj o odvajanju i prečišćavanju više PhG-ova iz C. deserticola korištenjem HSCCC. Zbog nedostatka standarda, LC-MS metode su razvijene i korištene kao moćno analitičko sredstvo za brzu karakterizaciju i identifikaciju nekih PhG u biljnom ekstraktu (Li et al., 2005; Wang et al., 2000).

U ovom radu izvještavamo o HSCCC metodi razvijenoj za pripremu ehinakozida, cistanozida A, akteozida, izoakteozida i 20-acetilakteozida iz C. deserticola. Karakterizacija i analiza pet odvojenih PhG-ova postignuti su upotrebom LC u kombinaciji sa in-line ESI masenom spektrometrijom i NMR eksperimentima. Vrijeme zadržavanja, molekulska težina i karakteristični fragmenti jona pet PhG su prikazani i razmotreni u ovom radu. Strukture pet PhG-ova identifikovanih u ovom istraživanju prikazane su na slici 1.

Efikasni sastojci Cistanche deserticola

2. Eksperimentalno

2.1. Hemikalije i reagensi

Acteoside je kupljen od Sigma-Aldrich (Oak-Ville, ON), ehinakozid je kupljen od ChromaDex-a (Santa Ana, Kalifornija). Izoakteozid je izolovan iz P. psyllium L. (Li et al., 2005). C. deserticola je kupljena u Pekingu TongRenTang Medicinal Store (Kina). Svi rastvarači su bili HPLC kvaliteta i kupljeni su od Caledon Laboratories Ltd. (Georgetown, ON).

2.2. Priprema uzorka

C. deserticola (20 g) ekstrahovana je pet puta na sobnoj temperaturi po 12 h sa 100 mL 80% vodenog etanola. Svaki put ekstrakciona smeša je filtrirana kroz Whatman No.1 filter papir (Whatman International Ltd., Maidstone, Engleska). Kombinovani filter je koncentrisan do 100 mL in vacuo na < 40="" stepeni.="" dobijeni="" vodeni="" rastvor="" je="" dva="" puta="" odmašćen,="" svaki="" sa="" 100="" ml="" heksana,="" a="" zatim="" ekstrahovan="" uzastopno="" pet="" puta,="" svaki="" sa="" 100="" ml="" n-butanola.="" slojevi="" n-butanola="" su="" kombinovani="" i="" koncentrirani="" do="" suva="" u="" vakuumu="" na="">< 40="" stepeni,="" što="" je="" dalo="" 2,2="" g="" ekstrakta="" n-butanola.="" ekstrakt="" je="" pohranjen="" na="" -20="" stepeni="" prije="" hsccc="">

2.3. HSCCC procedura razdvajanja

Preparativna HSCCC je izvedena u modelu CCC{{0}} brze protivstrujne hromatografije (Pharma-Tech Research, Baltimore, Maryland USA). Ovaj aparat je imao tri preparativne spirale, povezane u seriju (ukupni volumen 325 mL). Brzina okretanja aparata mogla se regulisati između 0 i 2000 o/min. HSCCC sistem je bio opremljen HPLC pumpom (Pharma-Tech Research, Baltimore, Maryland, SAD), UV detektorom Model 450 (Alltech, SAD), modelom L 120 E ravnog rekordera (Linseis Inc., Princeton Jct, SAD), kolektor frakcija (Advantec MFS Inc., SAD) i ventil za ubrizgavanje uzorka sa petljom za uzorke 10-mL.

Smjesa etil acetat-etanol-voda (5:0.5:4.5, v/v/v) je snažno promućkana u lijevu za odvajanje i ostavljena da stoji i odvojena na sobnoj temperaturi. Dvije faze su korištene u HSCCC nakon što su dostigle ravnotežu. Cijeli namotani stup je najprije ispunjen gornjim slojem, koji služi kao stacionarna faza. Donji sloj (mobilna faza) je zatim upumpan u glavni kraj kolone pri brzini protoka od 1,5 mL/min. Brzina rotacije je postavljena na 1050 o/min. Uzorak (oko 230 mg svaki put) rastvoren u 8 ml mešavine etil acetat-etanol-voda (5:0,5:4,5, v/v/v) ubačen je u injekcioni ventil nakon što je sistem dostigao hidrodinamiku. ravnoteža. Ovaj dvofazni sistem rastvarača odabran je na osnovu koeficijenta raspodjele (K), koji je bio 0,87, 1,11 i 1,32 za akteozid, izoakteozid i 20 acetilakteozid, respektivno. K vrijednost je bila omjer koncentracija u gornjem i donjem sloju istog spoja kako je određeno HPLC (slika 2). Efluent iz izlaza kolone je kontinuirano praćen UV detektorom na 254 nm i sakupljen u epruvete sa kolektorom frakcija podešenim na 4 min za svaku epruvetu.

2.4. LC uslovi

statički auto-sampler i fotodiodni niz detektora (DAD) korišteni su za analizu PhGs u n-butanol ekstraktu C. deserticola i frakcijama prikupljenim iz HSCCC separacije. Razdvajanje je izvršeno u Phenomenex ODS-C18 koloni (250 × 4,6 mm, 5 lm) sa C18 zaštitnom kolonom. Binarna mobilna faza sastojala se od acetonitrila (rastvarač A) i vode koja sadrži 2 posto sirćetne kiseline (rastvarač B). Svi rastvarači su filtrirani kroz a

{{0}}.45 lm filter prije upotrebe. Brzina protoka je održavana konstantnom na 1.0 mL/min za ukupno vrijeme rada od 25 min. Sistem je pokrenut sa programom gradijenta: 0–20 min: 90 posto B do 60 posto B; 20–22 min: 60 posto B do 0 posto B; i 22–25 min, 0 posto B do 90 posto B. Volumen injekcije uzorka bio je 10 lL. Vrhovi od interesa su praćeni na 320 nm pomoću DAD detektora.

2.5. LC–ESI-MS eksperimenti

LC-MS eksperimenti su izvedeni korištenjem Finnigan LCQ DECA masenog spektrometra za ionsku zamku (Thermo Finnigan, San Jose, CA, SAD) opremljenog izvorom elektrosprej jonizacije (ESI). Uzorci su analizirani u istim hromatografskim uslovima. Za prikupljanje podataka korišten je negativan model. Brzine protoka plina u omotaču i pomoćnog protoka su postavljene na 96 i 7 (proizvoljna jedinica), respektivno. Napon kapilare je postavljen na 29 V, a temperatura mu je kontrolisana na 350 stepeni. Ulazni napon sočiva je fiksiran na 40 V, a višepolna RF amplituda je postavljena na 540 V. Napon ESI igle je kontroliran na 4,5 kV. Pomak cijevnog sočiva bio je 16 V, pomak višepolnog sočiva 1 bio je 8,20 V, a pomak višepolnog sočiva 2 bio je 10,5 V. Napon množenja elektrona je postavljen na 980 V za detekciju jona.

2.6. NMR za identifikaciju

NMR spektri su snimljeni na Bruker Avance{0}} spektrometru (Bruker BioSpin Ltd., Milton, Kanada). Samo jedinjenja 2 i 5 (nema dostupnih standarda) su podvrgnuta NMR eksperimentima. Uzorci su rastvoreni u CD3OD.

Aktivni sastojci cistanchea: ehinakozid i akteozid

3. Rezultati i diskusija

Uspješno odvajanje HSCCC u velikoj mjeri zavisi od odgovarajućeg dvofaznog sistema rastvarača koji obezbeđuje idealan koeficijent raspodele (K) oko 1 za željeno jedinjenje. Takav dvofazni sistem bi takođe trebao dati razumno kratko vrijeme smirivanja (Chen, Games, & Jones, 2003; Foucault & Chevolot, 1998; Oka, Oka, & Ito, 1991). U našem eksperimentu odabrali smo četiri serije sistema rastvarača prema rastvorljivosti ciljnih jedinjenja u C. deserticola. HPLC je korišćen za merenje koncentracije u svakoj fazi, iz koje su izračunate K vrednosti ciljnih jedinjenja. Dva sistema, etil acetat–n-butanol–etanol–voda (4:0,6:0,6:5, v/v/v/v) i etil acetat–voda (1:1, v/v), su prethodno korišćena u HSCCC za odvajanje akteozida i 20-acetilakteozida od

C. salsa, te akteozid i izoakteozid iz P. Psyllium,

(Lei et al., 2001; Li et al., 2005). Iako je prvi sistem imao relativno kratko vrijeme taloženja, imao je slab učinak u odvajanju PhG-a C. deserticola, zbog niskih vrijednosti K za jedinjenja 1 i 2, i visokih vrijednosti K za jedinjenja 3-5. Vrijednosti K su bile vrlo niske za jedinjenja 1-4 u drugom sistemu, ali vrlo visoke za jedinjenje 5 (Tabela 1). Modifikovani sistem koji sadrži etil acetat-etanol-voda (5:0,5:4,5, v/v/v), dao je idealnu K vrednost za jedinjenja 3-5 na 0,87, 1,11 i 1,32, respektivno, i rezultirao je dobrim odvajanjem od ova tri jedinjenja (sl. 3A i B). Ovaj sistem je, međutim, proizveo

premala K vrijednost za jedinjenja 1 i 2, što uzrokuje da se dva jedinjenja koeluiraju blizu fronta rastvarača (frakcija 1 na slici 3A). Daljnja modifikacija sistema (etil acetat–n-butanol–etanol–voda (0.5:0.5:0.1:1, v/v/v/ v) podigao K vrijednosti za jedinjenje 1 i 2 na 0.52 i 0.92, respektivno, i doveo do potpunog odvajanja (slika 3C). Slika 3A prikazuje HSCCC razdvajanje a uzorak koji sadrži 230 mg n-butanol ekstrakta C. deserticola koristeći etil acetat-etanol-vodu (5:0.5:4.5, v/v/v). Frakcije koje su potvrđene pomoću HPLC-a da sadrže samo jedinjenja 3, 4 ili 5 su kombinovani odvojeno, a oni koji sadrže jedinjenja 3 i 4 su spojeni, osušeni smrzavanjem i ponovo podvrgnuti HSCCC radi daljeg odvajanja (slika 3B). Gore opisano odvajanje HSCCC dalo je ukupno 14,6 mg, 30,1 mg i 25,2 mg jedinjenja 3-5 iz 1412 mg ekstrakta n-butanola. Slika 3C prikazuje HSCCC odvajanje uzorka koji sadrži jedinjenja 1 i 2 (frakcija 1 u prvom odvajanju) korištenjem etil acetat–n-butanol–etanol–voda (0.5:0,5:0,1:1, v/v/ v/v). Ukupno 28,5 i 1 Dobijeno je 8,4 mg jedinjenja 1 i 2. Hromatografske čistoće liofiliziranih jedinjenja 1–5 bile su preko 92,5 posto, koje su direktno korištene za LC–ESI-MS i NMR analize.

Probna identifikacija jedinjenja 1, 3 i 4 postignuta je kongruentnim vremenima zadržavanja i UV spektralnim podacima sa onima autentičnog ehinakozida, akteozida i izoakteozida (slika 2). Jedinjenja 2 i 5 su bila nepoznata, međutim, UV spektri svih pet jedinjenja bili su veoma slični, što ukazuje na slične strukturne karakteristike.

Da bi se dalje istražile strukture ovih pet jedinjenja, pokušani su eksperimenti LC–ESI-MSn i rezultati su prikazani na slici 4 i tabeli 2. Jedinjenja povezana sa pikovima (1–5) na slici 2 su pokazala intenzivne deprotonirane molekularne jone. [MH]— na m/z 785, 799, 623, 623 i 665, respektivno, u negativnom modu. Dimerni [2M H]— joni su takođe uočeni za pikove 1-4 na slici 2. Oni su potvrdili da su molekulske težine pikova 1-5 786, 800, 624, 624 i 666, respektivno. LC-MSN podaci (Tablica 2) dali su vrlo korisne strukturne informacije za pet PhG, kao što je neutralni gubitak eksperimentalne procedure: otprilike 1 mg svakog uzorka je izvagano u epruveti od 10 mL u koju je po 1 mL svake faze dodat je prethodno uravnotežen dvofazni sistem rastvarača. Epruveta je zatvorena i snažno mućkana 1 min i ostavljena da stoji dok se potpuno ne odvoji. Alikvot od 100 l svakog sloja je izvađen i odvojeno uparen do suha u vakuumu na<40 °c.="" the="" residue="" was="" dissolved="" in="" 10="" ll="" methanol="" and="" analyzed="" by="" hplc="" for="" determining="" the="" partition="" coefficient="" (k)="" of="" compounds="" 1–5.="" the="" k="" value="" was="" expressed="" as="" the="" peak="" area="" of="" the="" target="" compound="" in="" the="" upper="" phase="" divided="" by="" that="" in="" the="" lower="">

LC-ESI-MS pika 1 prikazan je na slici 4A. Deprotonirani molekularni jon [MH]— na m/z 785 sa velikom zastupljenošću i dimernim deprotoniranim molekulom.jon [2M H]— na m/z 1571 uočen je u negativnom modu, što ukazuje na molekulsku težinu od 786, što je bilo isto kao i ehinakozida. Dalje istraživanje u LC-MS2 eksperimentu m/z 785 jona dalo je jedan glavni ion kćer na m/z 623 (slika 4B) proizveden direktno iz m/z 785 gubitkom kafeoilnog dijela ili heksozne skupine kao [M 162 H]—. LC-MS3 spektar m/z 623 pokazao je dva glavna jona na m/z 477 i 461, i dva manja jona na m/z 315 i 179 (slika 3C, tabela 2). Razlike u mase između m/z 623 i fragmentiranih jona m/z 477 i 461 bile su 146 i 162, respektivno, što odgovara gubitku ramnozne jedinice i glukoznog dijela ili dijela kafeoila [M 162 H]—. Joni m/z 623 također su izgubili dio kofeoila i dio ramnoze da bi proizveli jone m/z 315. Jon na m/z 179 nastao je cijepanjem kafeoilnog dijela, pri čemu je negativni naboj ostao na dijelu kafeoilnog dijela. LC-ESI-MSN eksperiment na autentičnom ehinakozidu pokazao je isti uzorak fragmentacije. Stoga je potvrđeno da je vrh 1 ehinakozid.

Za vrh 2, LC–ESI-MS je pokazao m/z 799 kao deprotonirani molekularni ion [MH]— i m/z 1599 kao njegov dimerni ion, što ukazuje na molekulsku masu od 800. Tokom MS2 eksperimenata, m/z 799 jona formiralo je tri kćeri na m/z 637, 623 i 475 (Tablica 1). Jon na m/z 637 je proizveden direktno iz matičnog jona m/z 799 ponovo zbog neutralnog gubitka kafeoila [M—162—H]— ili ostatka glukoze [M—162—H]—. Jon na m/z 623 nastao je gubitkom CH2 radikala. Jon na m/z 475 nastao je iz neutralnog gubitka i kafeoilnog dijela [M 162 H]— i glukoznog dijela iz matičnog jona. Eksperiment MS3 na m/z 637 proizveo je tri jona na m/z 619, 491 i 475, što odgovara gubicima jedne vode, jedinice ramnoze i dijela glukoze, respektivno. Kćerki jon m/z 623 proizveo je m/z 461 i 315 u studiji MS3, koja je pratila iste puteve fragmentacije kao i ehinakozid kao što je gore diskutovano. Podaci LC–ESI-MSN podržali su probnu identifikaciju za pik 2 kao cistanozid A. Oba pika su pokazala isti [MH]—jon na m/z 623 i dimer na m/z 1247 u negativnom modu (Tabela 1), što ukazuje oni su vjerovatno izomeri sa istom molekulskom težinom

624, isto što i akteozid i izoakteozid. MS2 spektri [MH]— jona su takođe pokazali jedan isti ćerki jon od m/z 461, što je ukazivalo na gubitak kafeoilnog dela iz matičnog jona m/z 623 (Tabela 1). Slični MS3 spektri su dobijeni za dva spoja. Za pik 3, MS3 spektar jona na m/z 461 formirao je tri jona na m/z 315, 161 i 135. m/z 315 se formira nakon gubitka ramnoze kao što je ranije diskutovano. Jon m/z 161 nastao je cijepanjem kafeoilnog dijela, nakon čega je uslijedio daljnji gubitak jedne vode; naboj je ostao na dijelu kafeoilnog dijela. Jon na m/z 135 [aglikon 18 H]— nastao je cijepanjem glikozidne veze na poziciji C1 uz dodatni gubitak jedne vode, ostavljajući naboj na dijelu aglikonskog dijela. MS3 spektar pika 4 prati isti put fragmentacije kao i vrh 3 osim jona koji nedostaje na m/z 135. Molekularni ion i obrasci fragmentacije ova dva jedinjenja su u skladu sa literaturnim podacima o akteozidu i izoakteozidu (Wang et al. ., 2000), iako je pronađen dodatni jon m/z 153, a podaci protonskog NMR cistanozida A i 20-acetilakteozida su dodijeljeni kao [aglikon H]— od strane Wang et al. (Wang et al., 2000). Ovaj ion je možda bio nestabilan i izgubio je vodu da bi dao m/z 135 u našem eksperimentu. Na osnovu MS podataka i kongruentnih vremena zadržavanja pikova 3 i 4 sa standardima, oni su stoga identifikovani kao akteozid i izoakteozid, respektivno.

Podaci LC-ESI-MS za pik 5 prikazani su u tabeli 2. Deprotonirani molekularni jon [MH]— (m/z 665) bio je jedini ion pronađen u negativnom modu, što implicira molekulsku masu od 666. Tri jona kćeri uočene su na m/z 623, 503 i 461 u eksperimentu MS2 (Tabela 2). Ćerki joni na m/z 623 i 503 formirani su direktno od matičnog jona gubitkom COCH2 grupe i kafeoil ostatka, respektivno. Jon na m/z 461 nastao je gubitkom i kafeoila i COCH2 dijela [M 162 42 H]— iz matičnog jona. U MS eksperimentu, m/z 623 je proizveo m/z 461, a m/z 503 dao je tri jona na m/z 485, 461 i 315. MS3 spektar ćerki jona m/z 461 dao je dva jona na 443 i 315. Upoređujući LC–MSN obrazac fragmentacije vrha 5 sa drugim jedinjenjima prijavljenim u ovoj studiji i sa ostalim prijavljenim (Li et al., 2005; Wang et al., 2000), zaključili smo da je vrh 5 strukturno visoko povezan na akteozid sa jedinom razlikom što je COCH3 jedinica na R3 poziciji. Stoga je probni identitet dat piku 5 kao 20-acetilakteozid (Slika 1).

Strukture dva uslovno identifikovana jedinjenja, pika 2 (kao cistanozid A) i pika 5 (kao 20-acetil-akteozid) su potvrđene njihove strukture pomoću 1H NMR. Hemijski pomaci i konstante spajanja svih protona u jedinjenjima 2 i 5, kao što je prikazano u tabeli 3., poklapaju se sa prijavljenim NMR podacima za cistanozid A i 20-acetilakteozid, respektivno (Kobayashi et al., 1984, 1987) . 2D NMR eksperimenti (korelacija dugog dometa COSY, ROESY i CH) su također provedeni u ovoj studiji i oni su dodatno potvrdili identifikaciju (podaci nisu prikazani).

Acteoside iz Cistanche deserticola

4. Zaključak

U ovom radu, HSCCC je uspješno korišten za izolaciju i pročišćavanje ehinakozida, cistanozida A, akteozida, izoakteozida i 20-acetilakteozida iz n-butanol ekstrakta C. deserticola. Stoga je dokazano sredstvo za polupreparativno odvajanje bioaktivnih tvari. U međuvremenu, strukture pet PhG u C. deserticola su istražene pomoću LC–ESI-MSN; pronađene su neke karakteristične karakteristike PhG-a, što nam je omogućilo da odredimo funkcionalne grupe u strukturama. LC–ESI-MSN metoda je stoga moćno sredstvo za brzu identifikaciju feniletanoida i njihovih glikozida u ekstraktima C. deserticola, posebno kada je to potkrijepljeno NMR podacima.

Priznanje

Autori se žele zahvaliti Jun Gu iz Centra za nuklearnu magnetnu rezonancu Univerziteta Guelph, Ontario, Kanada za njenu pomoć u NMR eksperimentima. Ovaj projekat je djelimično podržan sredstvima iz provincije Jilin, Kina (br. 20060904).

Reference

Chen, LJ, Games, DE, & Jones, J. (2003). Izolacija i identifikacija četiri flavonoidna sastojka iz sjemena Oroxylum Indicum brzom protustrujnom hromatografijom. Journal of Chromatography A, 988, 95–105.

Cheng, XY, Wei, T., Guo, B., Ni, W., & Liu, CZ (2005). Suspenzirane kulture ćelija Cistanche deserticola: biosinteza feniletanoidnih glikozida i antioksidativna aktivnost. Process Biochemistry, 40, 3119–3124.

Foucault, AP, & Chevolot, L. (1998). Protivstrujna hromatografija: instrumentacija, odabir rastvarača i neke novije primjene u prečišćavanju prirodnih proizvoda. Journal of Chromatography A, 808, 3–22.

Gross, G.-A., Lahloub, MF, Anklin, C., Schulten, H.-R., & Sticher, O. (1988). Teucrioside, fenilpropanoidni glikozid iz Teucrium Chamaedrys. Phytochemistry, 27, 1459–1463.

He, ZD, Lau, KM, Xu, HX, Li, PC, & But, PPH (2000). Antioksidativna aktivnost feniletanoidnih glikozida iz Brandisia šanse. Časopis za etnofarmakologiju, 71, 483–486.

Kobayashi, H., Karasawa, H., & Miyase, T. (1984). Studije o sastojcima Cistanchis Herba. III. Izolacija i strukture novih fenilpropanoidnih glikozida, Cistanozid A i B. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 32, 3009–3014.

Kobayashi, H., Oguchi, H., Takizawa, N., Miyase, T., Ueno, A., Usmanghani, K., et al. (1987). Novi feniletanoidni glikozidi iz Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. FI. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 35, 3309–3314.

Lei, L., Yang, FQ, Zhang, TY, Tu, PF, Wu, LJ, & Ito, Y. (2001). Preparativna izolacija i pročišćavanje akteozida i 2'-acetil akteozida iz Cistanches salsa (CA Mey) G. Beck kontrastrujnom hromatografijom. Journal of Chromatography A, 912, 181–185.

Li, L., Tsao, R., Liu, ZQ, Liu, SY, Yang, R., Young, JC, et al. (2005). Izolacija i pročišćavanje akteozida i izoakteozida iz Plantago psyllium L. brzom protivstrujnom hromatografijom. Journal of Chromatography A, 1063, 161–169.

Li, LL, Wang, XW, & Wang, XF (1997). Antilipidna peroksidacija i antiradikalno djelovanje glikozida u herba Cistanches. China Journal of Chinese Materia Medica, 22, 364–367.

Li, J., Wang, PF, Zheng, RL, Liu, ZM, & Jia, ZJ (1993). Zaštita fenilpropanoidnih glikozida iz Pedicularisa od oksidativne hemolize in vitro. Planta Medica, 59, 315–317.

Lu, MC (1998). Studije o sedativnom dejstvu Cistanche deserticola. Časopis za etnofarmakologiju, 59, 161–165.

Nishimura, H., Sasaki, H., Inagaki, N., Chin, M., & Mitsuhashi, H. (1991). Devet glikozida fenetil alkohola iz Stachys szeboldzz. Phytochemistry, 30, 965–969.

Oka, F., Oka, H., i Ito, Y. (1991). Sistematsko traženje odgovarajućih dvofaznih sistema rastvarača za brzu protivstrujnu hromatografiju. Journal of Chromatography, 538, 99–108.

Ravn, H., Nishibe, S., Sasahara, M., & Li, X. (1990). Fenolna jedinjenja iz Plantago Asiatica. Phytochemistry, 29, 3627–3631.

Schapoval, EES, Winter de Vargas, MR, Chaves, CG, Bridi, R., Zuanazzi, JA, & Henriques, AT (1998). Protuupalno i antinociceptivno djelovanje ekstrakata i izoliranih spojeva iz Stachytarpheta cayennensis. Časopis za etnofarmakologiju, 60, 53–59.

Shoyama, Y., Matsumoto, M., & Nishioka, I. (1987). Fenolni glikozidi iz oboljelog korijena Rehmannia glutinosa Var. Purpurea. Phyto Chemistry, 26, 983–986.

Wang, XW, Jiang, XY, Wu, LY i Wang, XF (2001). Utjecaj glikozida Cistanche deserticola na slobodne radikale i njegova zaštita od oštećenja DNK izazvanih OH in vitro. Journal of Chinese Pharmacology, 36, 29–31.