Pentraxin-3-posredovana aktivacija komplementa u svinjskom modelu bubrežne ishemije/reperfuzijske ozljede

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Chiara Divella i dr

SAŽETAK

Pentraksini su porodica evolucijski očuvanih molekula za prepoznavanje obrazaca sa ključnom ulogom u urođenom imunitetu i upali, kao što je opsonizacija patogena tokom bakterijskih i virusnih infekcija. Konkretno, pokazalo se da dugi Pentraxin 3 (PTX3) reguliše nekoliko aspekata upale krvnih sudova i tkiva tokom transplantacije čvrstih organa.

Naša studija je istraživala ulogu PTX3 kao mogućeg modulatora aktivacije komplementa u svinjskom modelu bubrežne ishemije/reperfuzije (I/R) ozljede. Pokazali smo da su rane depozite PTX3 izazvane I/R ozljedom na peritubularnom i glomerularnom kapilarnom nivou. Konfokalna laserska skenirajuća mikroskopija otkrila je naslage PTX3 koje su lokalizovane sa CD31 plus endotelnim ćelijama. Pored toga, PTX3 je bio povezan sa infiltrirajućim makrofagima (CD163), dendritskim ćelijama (SWC3a) i miofibroblastima (FSP1). Konkretno, pokazali smo značajnu PTX{10}}posredovanu aktivaciju klasičnih (posredovano C1q) i lektinom (posredovano MBL) puteva komplementa. Zanimljivo je da su depoziti PTX3 ko-lokalizirani sa aktivacijom terminalnog kompleksa komplementa (C5b-9) na endotelnim ćelijama, što ukazuje da se PTX3-posredovana aktivacija komplementa dogodila uglavnom na nivou bubrežnih krvnih sudova. U zaključku, ovi podaci ukazuju na to da bi PTX3 mogao biti potencijalni terapeutski cilj za sprječavanje I/R ozljede izazvane komplementom.

Dopisivanje sa:Giuseppe Castellano

Ključne riječi:ishemija/reperfuzijska povreda, sistem komplementa, pentraxin 3,bubreg, klasični put

Cistanche tubulosa sprječava bolest bubrega, kliknite ovdje da biste dobili uzorak

UVOD

Ishemijsko-reperfuziona (I/R) povreda predstavlja glavni uzrok akutnebubregpovredanakon transplantacije i karakteriše ga značajna aktivacija sistema komplementa [1, 2]. U ovom scenariju, endotelne ćelije (EC) igraju ključnu ulogu u maladaptivnoj popravci nakon I/R, što dovodi do rane fibroze endotelnom u mezenhimsku tranziciju (EndMT) [3]. Tokom faze reperfuzije, komplement orkestrira imunološke i upalne procese, doprinoseći različitim imunološkim i upalnim bolestima [2–5]. Druge bitne komponente humoralnog kraka urođenog imunog sistema predstavljaju pentraksini za koje se smatra da igraju ključnu ulogu u vaskularnoj biologiji [6].

Pentraksini su porodica multimernih rastvorljivih proteina [6] koji su klasifikovani u kratke i duge porodice na osnovu njihove strukture [7]. Ovi evolucijski konzervirani proteini su efektori akutne faze, koji služe kao senzori za inicijaciju upale i brzo povećanje u plazmi tokom infekcije [8]. Dugi pentraxin 3 (PTX3) je rastvorljivi molekul za prepoznavanje obrazaca koji je ključan u urođenoj imunološkoj zaštiti i može aktivirati sistem komplementa [9-11].

Konkretno, PTX3 je inducirao aktivaciju klasičnog i lektinskog puta vezujući se za C1q, MBL, Ficolin-2 i može utjecati na alternativni put putem CFH [10–12].

Za razliku od drugih pentraksina proizvedenih u jetri u krvotoku (tj. CRP), PTX3 mogu osloboditi rezidentne stanice unutar mjesta upale, na primjer iz mononuklearnih fagocita, dendritskih ćelija, fibroblasta i EC [9] koji djeluju na parakrini način [13]. PTX3 se također skladišti u gotovom obliku u neutrofilima, lokaliziran u specifičnim granulama i izlučuje se kao odgovor na prepoznavanje mikrobnih dijelova [14]. U EC ekspresiju PTX3 lako induciraju TNF- i IL-1, dajući prijelaz iz mirnog, protuupalnog fenotipa u prokoagulantno i proinflamatorno stanje, čime se snažno regulira mikrovaskularna funkcija [7, 8 ]. Iz tog razloga, nivoi PTX3 su opisani kaohroničnobubregbolest, povećanje nivoa proteina PTX3 je u korelaciji sa padom GFR i kardiovaskularnim komplikacijama, međutim, još uvek se malo zna o ulozi PTX3 u ranim okruženjima kao I/R-indukovanim akutnimbubregpovreda [15, 16].

Uloga PTX3 u bubrežnim inflamatornim bolestima je dvovalentna, sa strane protein može aktivirati klasične i lektinske puteve promovišući početnu upalu i ozljedu [10–12]. S druge strane, N-terminalni domen PTX3 modulirane aktivacije komplementa oslabio je regrutaciju leukocita i inhibirao intersticijalnu fibrozu kod akutne ozljede bubrega promovišući popravak tkiva [17–20].

Komplement igra ključnu ulogu u patofiziologiji akutne povrede izazvane I/R ozljedom.bubregpovreda[21, 22]. U modelu bubrežne I/R ozljede kod svinja, pokazali smo ključnu ulogu aktivacije sistema komplementa u izazivanju EndMT-a i rane fibroze, uz uključivanje klasičnih i lektinskih puteva [23]. Štaviše, pokazali smo da terapeutska inhibicija ovih puteva komplementa rekombinantnim C1-INH (rhC1INH) dovodi do značajnog smanjenja taloženja komplementa, sa smanjenim regrutacijom infiltrirajućih inflamatornih ćelija i tubulointersticijskim oštećenjem [23]. Ove rezultate potvrdili su i Delpech PO et al [24]; značajna modulacija u C1q, MASP i C4d glomerularnoj i tubularnoj depoziciji procijenjena je nakon 30 minuta nakon reperfuzije, što ukazuje na centralnu ulogu C1-INH u suzbijanju klasičnih i lektinskih puteva.

U ovoj studiji smo istraživali moguću uključenost PTX3 u posredovanju rane aktivacije komplementa u bubrežnoj I/R ozljedi, karakterizirajući različite ćelijske izvore PTX3.

REZULTATI

PTX3 se izražava endotelnim stanicama i imunološkim infiltrirajućim stanicama u svinjskom modelu I/R ozljede

Prvo smo istražili prisustvo PTX3 u svinjskom modelu tople I/R-inducirane povrede bubrega. Uočili smo vrlo ograničene naslage PTX3 u normalnom tkivu (Slika 1A). I/R povreda je izazvala difuzno taloženje PTX3 već 15 minuta nakon reperfuzije (Slika 1B, 1C) u tubulointersticijskom području (Slika 1E), u peritubularnim kapilarama (Slika 1D; strelica) i na glomerularnim nivoima (Slika 1D). Depoziti PTX3 su i dalje bili detektovani 1 sat nakon reperfuzije na nivou peritubularnih kapilara (Slika 1G). U našem prethodnom radu [23] pokazali smo da su glavne karakteristike I/R ozljede apoptoza tubularne epitelne stanice i regrutiranje infiltrirajućih inflamatornih stanica kao što su monociti, dendritske ćelije i limfociti. Ipak, rutinskom histološkom evaluacijom (dopunska slika 1), pokazali smo da je 30 minuta tople ishemije praćeno 15 minuta ranog intersticijalnog oštećenja tubula izazvanog reperfuzijom, karakteriziranog većom kapilarnom kongestijom i fokalnom citoplazmatskom vakuolacijom bubrežnog epitela, u usporedbi s epitelnim tubulom bubrega. stanje.

Da bismo dalje karakterizirali ćelijsku lokalizaciju PTX3 naslaga i procijenili njegov potencijalni učinak na modulaciju upalnog odgovora i ozljede, izvršili smo analizu dvostrukog imunobojenja i konfokalnu mikroskopsku analizu. Ekspresija PTX3 proteina je otkrivena u većini EC na peritubularnom (Slika 2A) i glomerularnom (Slika 2B) kapilarnom nivou, 15 minuta nakon reperfuzije.

Dobro je poznato da I/R ozljedu karakterizira povećana aktivacija urođenih i adaptivnih imunih odgovora, uključujući promet upalnih ćelija u oboljeli organ koji dalje pogoršava ozljedu putem imunoloških ćelija i sistema komplementa [25]. U našem modelu svinja također smo primijetili, već 15 minuta nakon reperfuzije, gust inflamatorni infiltrat sastavljen uglavnom od makrofaga i dendritskih stanica u tubulsko-intersticijskom području. Otkrili smo da su obe ove ćelije koje predstavljaju antigen karakterisane povećanom ekspresijom PTX3 u poređenju sa T0 jer smo primetili povećan broj CD163 plus /PTX3 plus (Slika 2E, 2F, 2K) i SWC3a plus /PTX3 plus (Slika 2G, 2H, 2L) ćelije na intersticijalnim nivoima tubula na T15.

Ekspresija PTX3 može doprinijeti EndMT kod I/R ozljede

U prethodnim zapažanjima, pokazali smo da je I/R ozljeda odgovorna za EndMT [26, 27], koju karakterizira stjecanje mezenhimskog fenotipa EC uz gubitak specifičnih endotelnih markera i povećanje mezenhimskih markera, kao što su fibroblast-specifični protein 1 (FSP-1), neuronski kadherin (N-kadherin) i alfa-aktin glatkih mišića (alfa-SMA). Stoga smo istražili da li ekspresija PTX3 od strane EC može utjecati na ovaj proces. Kao što se i očekivalo, kada smo istraživali ekspresiju alfa-SMA, kao markere aktiviranog miofibroblasta, nismo pronašli nikakvu ko-lokalizaciju između alfa-SMA i PTX3 (Slika 2C, 2D). Naprotiv, primetili smo povećanje tubulointersticijalnog FSP1 plus /PTX3 plus miofibroblasta tokom perioda posmatranja (Slika 2K-2M).

Depoziti PTX3 su povezani sa aktivacijom sistema komplementa

Konačno, istražili smo da li su depoziti PTX3 povezani sa aktivacijom komplementa. Zaista, kao i kod drugih komponenti porodice pentraksina, PTX3 može regulisati aktivaciju klasičnog puta komplementa [7]. Da bismo definirali odnos između PTX3 i aktivacije komplementa, izvršili smo imunofluorescenciju sa dvostrukom oznakom kako bismo procijenili ekspresiju PTX3 i terminala. Kompleks komplementa, C5b-9, koristeći antitijelo usmjereno protiv C9-neoepitopa. Uočili smo značajnu ko-lokalizaciju PTX3 i C5b-9 depozita (Slika 3A, 3B). Terminalni kompleks komplementa bio je lokalizovan na peritubularnom nivou kao i unutar peritubularnih kapilara zajedno sa slojem endotelnih ćelija, kao što smo prethodno pokazali [23, 28]. Budući da PTX3 može aktivirati sistem komplementa putem klasičnih i lektinskih puteva, procijenili smo taloženje C1q i MBL u bubrežnom parenhima. Zanimljivo je da su naslage C1q (Slika 3E, 3F) i MBL (Slika 3C, 3D) uglavnom pronađene na intersticijskom i kapilarnom nivou (Slike 3C do 3F), kao što je prethodno opisano [23] i kolokalizirane sa PTX3 naslagama.

C1-inhibitor ometa PTX3 vezivanje na endotelnim ćelijama

U našem prethodnom radu [23] pokazali smo da je primjena inhibitora C1- dovela do značajnog smanjenja taloženja komplementa, sa smanjenim regrutacijom infiltrirajućih inflamatornih stanica i tubulointersticijskim oštećenjem. Stoga smo ispitali nivo ekspresije PTX3 kod životinja tretiranih rhC1-INH. Otkrili smo da je infuzija inhibitora C1- smanjila depozite PTX3 na peritubularnim kapilarama i intersticijskom nivou nakon 15 minuta nakon reperfuzije (Slika 4A).

Štaviše, kako bismo podržali hipotezu da je smanjenje depozita PTX3 kod životinja tretiranih rhC1-INH povezano sa inhibicijom oštećenja endotela, izveli smo in vitro eksperimente i procijenili vezivanje rhC1-INH i PTX3 na kultivisan EC u normalnim uslovima ili u prisustvu ćelijskog stresa (Slika 4B). FACS analiza je pokazala da EC u normalnim uslovima ne vezuje i rhC1-INH i PTX3. U skladu sa našom prethodnom studijom [26], uočili smo povećano ćelijsko vezivanje rhC1-INH na H2O2-stimulisanu EC u poređenju sa bazalnim uslovima. Štaviše, u odsustvu rhC1-INH, PTX3 bi mogao vezati aktivirani EC. Zanimljivo, kada je H2O2-aktivirani EC inkubiran sa PTX3 i rhC1-INH, primijetili smo da je C1INH mogao zaštititi EC nakon blokiranja vezivanja PTX3.

DISKUSIJA

U ovoj studiji smo demonstrirali taloženje PTX3 u ranoj fazi bubrežne I/R ozljede i njegov mogući doprinos razvoju EndMT-a. Zanimljivo je da smo otkrili da se PTX3-posredovana aktivacija komplementa događa uglavnom na vaskularnom nivou, ko-lokalizujući sa C1q i MBL, molekulima za prepoznavanje klasičnih i lektinskih puteva kaskade komplementa.

I/R ozljeda izaziva izraženu inflamatornu reakciju koju karakterizira aktivacija komplementa, radikali bez kisika i proizvodnja proinflamatornih citokina, što rezultira aktivacijom vaskularnog endotela i perifernih leukocita [29, 30]. Tokom I/R ozljede, aktivacija komplementa dovodi do taloženja komponenata komplementa na površinskoj membrani oštećenog i disfunkcionalnog EC, uz istovremenu generaciju anafilatoksina i pojačavanje upalnog procesa [31]. Tokom upale, PTX3 se brzo povećava i može imati centralnu ulogu u modulaciji endotelnog odgovora. Zaista, PTX3 je indiciran kao potencijalni biomarker vaskularne endotelne disfunkcije kod nekoliko bolesti, uključujući kroničnebubregbolesti, preeklampsije i nekoliko vaskularnih bolesti [7, 16, 17, 32]. Također smo pokazali da je PTX3 uključen u druge vaskularne komplikacije kao što je neuspjeh arteriovenske fistule kod pacijenata na hemodijalizi [33]. Ova zapažanja sugeriraju da bi PTX3 mogao biti most između inflamatornog odgovora i endotelne disfunkcije [34]. U skladu sa ovim studijama, uočili smo depozite PTX3 na nivou endotela već nakon 15 minuta nakon reperfuzije (Slika 2A, 2B). Naši rezultati su također pokazali da se u ranoj fazi I/R ozljede, PTX3 kolokalizirao sa markerom miofibroblasta, FSP-1 (Slika 2I, 2J), ali ne i sa alfa-SMA, markerom izraženim aktiviranim miofibroblastom (Slika 2C, 2D). Uzeti zajedno, ovi podaci mogu ukazivati ​​na to da su se endotelna disfunkcija i EndMT proces [35], uočeni kod I/R životinja [26], prvo javili u EC koji eksprimira PTX3.

Veza između PTX3 i upalnih stanica je široko poznata. U ovom radu smo se posebno fokusirali na inherentne efekte PTX3 u intersticijskoj infiltraciji leukocita koji su glavni izvor PTX3 [36]. Konkretno, pronašli smo makrofage i dendritske ćelije, nakon 15 minuta nakon reperfuzije, koji eksprimiraju više razine PTX3 (Slike 2E do 2H). Ovi podaci su u skladu sa sve većim brojem dokaza koji ukazuju na relevantnu ulogu urođenog imuniteta u posredovanju ranog oštećenja kod I/R ozljede [23]. Rana aktivacija komplementa u bubrežnom tkivu nakon I/R ozljede dovodi do stvaranja nekoliko inflamatornih medijatora koji povećavaju regrutaciju imunih stanica [21, 23, 37, 38]. Nedavne studije su identificirale PTX3 kao jednu od glavnih komponenti mreže koja orkestrira upalni odgovor izazvan I/R ozljedom [39]. U različitim eksperimentalnim modelima I/R ozljede, PTX3 može imati dvostruke suprotne uloge na specifičnim tkivima [40, 41]. Rana proizvodnja PTX3 povezana je s oštećenjem bubrega jer inducira ranu ekspresiju endotelnih adhezivnih molekula i hemokina koji ubrzavaju lokalni neprilagođeni inflamatorni odgovor.

Naprotiv, produžena lokalna proizvodnja PTX3 sprječava pretjeranu upalu i disfunkciju organa [41].

PTX3 je komplementni kaskadni modulator [9, 42]; ovo je u skladu sa pleiotropskim svojstvima PTX3, što ukazuje na dvostruku ulogu PTX3 kao modulatora ili pojačavača urođenog imunološkog odgovora [39]. U početku, PTX3 aktivira komplement vezivanjem C1q i MBL [43]; međutim, rano pojačana upala mora biti ograničena na ciljno područje. Stoga, PTX3, regrutacijom faktora H ili inhibicijom angiogeneze, također može smanjiti inflamatorni odgovor i aktivaciju komplementa, čuvajući bubrežni parenhim od upalnog oštećenja [43]. Iako je aktivacija komplementa u I/R kod glodara uglavnom lokalizirana na tubularnom nivou [44], tokom faze reperfuzije, endotel je primarna meta različitih proinflamatornih agenasa, uključujući medijatore komplementa [2]. Prethodno smo pokazali da se u svinjskom modelu I/R ozljede, kao i kod pacijenata sa DGF, aktivacija sistema komplementa javlja u ranoj fazi, na peritubularnim kapilarama, unutar intersticijuma i na glomerularnom endotelu [23]. Naši podaci su pokazali jasnu ko-lokalizaciju depozita C5b-9 na PTX3 plus EC nakon 15 minuta nakon reperfuzije (Slika 3A, 3B). Stoga se čini da je endotel bubrega preovlađujuće mjesto PTX3-posredovane aktivacije komplementa u ranoj fazi I/R ozljede iu pretkliničkom iu kliničkom okruženju.

Interakcija pentraksina sa C1q i njegova uloga u aktivaciji klasičnog puta komplementa su dobro opisani [45–47]. U kontekstu urođenih imunoloških odgovora, PTX3 može vezati različite komponente komplementa i modulirati aktivaciju komplementa [43, 48]. PTX3 aktivira komplement C1q vezivanjem [49]. Naši rezultati na životinjskom modelu jasno su pokazali da PTX3 može posredovati u klasičnoj aktivaciji puta interakcijom sa C1q (Slika 3E, 3F). Štaviše, PTX3 takođe modulira lektinski put komplementa, kao što je prikazano na slici 3C, 3D. MBL se vezuje za PTX3 preko svoje domene nalik kolagenu [45], a kompleksi MBL/PTX3 regrutuju C1q i izazivaju taloženje C3 i C4 na površini ciljnih ćelija.

Sve u svemu, ovi rezultati ukazuju na centralnu ulogu PTX3 u posredovanjububregoštećenje u I/R ozljedi, što bi moglo imati važne implikacije za komplementarno usmjerene terapije kod bubrežne I/R ozljede.

U našoj prethodnoj studiji [26], istražili smo učešće komplementa u posredovanju EC aktivacije upotrebom rekombinantnog oblika C1-INH, snažnog inhibitora proteaza klasičnog i lektinskog komplementa (C1r, C1 s, i MASP2). U istom životinjskom modelu pokazali smo (Slika 4A) da terapijska inhibicija oba puta od strane rhC1INH smanjuje depozite PTX3 na peritubularnim kapilarama i intersticijskom nivou nakon 15 minuta nakon reperfuzije. Ovi podaci potvrđeni in vitro rezultatima na EC (Slika 4B), doveli su nas do hipoteze da bi rhC1INH mogao zaštititi oštećeni EC nakon blokiranja vezivanja PTX3. U literaturi postoje dokazi o vezivanju C1-INH za endotelne adhezione molekule, izražene na aktiviranom endotelu, nazvane selektini, posebno P i E-selektini [50, 51]. Ovo vezivanje za EC može ometati interakciju endotela i leukocita tokom upale i predstavlja još jedan važan antiinflamatorni mehanizam [50, 51]. Stoga smo pretpostavili da rh-C1INH može vezati aktivirani EC i posreduje u lokalnoj regulaciji aktivacije komplementa i upalnog procesa. U našim prethodnim studijama, pokazali smo učešće komplementa u I/R ozljedi i drugim imunološki posredovanim bubrežnim bolestima [38, 52–54]. Mehanizmi aktivacije komplementa u ovom životinjskom modelu mogli bi imati važne implikacije za interpretaciju podataka koji se očekuju u ljudskom okruženju. Za uspješan razvoj terapijskih intervencija usmjerenih na aktivaciju komplementa [36, 54], bitno je utvrditi valjanost podataka o svinjama u odnosu na ono što se događa u kliničkim okolnostima. Budući da je ovo istraživanje ograničeno na opservacijske studije, potrebni su daljnji eksperimenti kako bi se razgraničili međusobno povezani mehanizmi između PTX3 i komplementa koji bi mogli istaknuti nove terapijske strategije. Iz gornjih rezultata, naši podaci podržavaju hipotezu da bi PTX3 mogao regulirati više aspekata I/R ozljede posredovane komplementom, čime bi predstavljao potencijalni terapeutski cilj.

MATERIJALI I METODE

Model svinje s I/R ozljedom bubrega

Životinjski model bubrežne I/R ozljede razvijen je kako je prethodno opisano [23]. Nakon odobrenja etičke komisije Ministarstva zdravlja, 4-mjesečna ženka Velike bijele svinje (n=8, n=4 za grupu, 20 kg) je podvrgnuta eksperimentalni otvoreni operativni zahvat u općoj anesteziji. Životinje su gladile 24 sata prije uvođenja u anesteziju. Elektrokardiogram, broj otkucaja srca, zasićenost hemoglobinom kiseonikom, sastav respiratornog gasa, brzina disanja, disajni volumen, pritisak u disajnim putevima, sistolni arterijski krvni pritisak i centralni venski pritisak su kontinuirano praćeni i automatski snimani (Ohmeda Modulus CD; DatexOhmeda, Helsinki, Finska) . Izolirane su lijeva bubrežna arterija i vena, a žila je postavljena oko bubrežne arterije pomoću stezaljke pod pravim kutom. Biopsija bubrega je urađena prije ishemije (T0). Zatim je ishemijska faza indukovana (30 min) povlačenjem žilne petlje. Višestruke biopsije su zatim izvedene 15, 30 i 60 minuta nakon reperfuzije; životinje su žrtvovane 24 sata nakon hirurške procedure. Dio svakog uzorka biopsije je odmah zamrznut u mediju optimalne temperature rezanja (Tissuetek, Pittsburgh, PA) i pohranjen u tekućem dušiku. Drugi dio je fiksiran u puferiranom formalinu (4 posto) tokom 12 sati i stavljen u parafin koristeći standardne procedure.

Mikroskopska studija

Uzorci bubrega ugrađeni u parafin iz renalnih biopsija korišteni su za konvencionalno histološko bojenje (H&E, periodična kiselina-Schiff). Slike su dobijene pomoću uređaja Aperio ScanScope CS2 (Aperio Technologies, Vista, Kalifornija, SAD). Tubulno-intersticijalne i glomerularne lezije procijenjene su kvalitativnom analizom od strane dva posmatrača (CD, MR) koji nisu bili svjesni porijekla

Antitijela

Primarna antitela korišćena u ovoj studiji prepoznala su sledeće antigene: PTX3 (MNB4: direktno protiv PTX3 N-terminalnog domena, Exira Life Sciences In., Larsen, Švajcarska); CD163 (monociti/makrofagi, US Biological, Swampscott, MA); SWC3a (dendritske ćelije, [55] 74-22-15A, BD Biosciences); FSP1 (fibroblast specifičan protein 1, Abcam, Cambridge, UK); alfa-aktin glatkih mišića (Santa Cruz Biotechnology Inc.; Santa Cruz, Kalifornija, SAD); C1q (R9/2, AbDSerotec; Kidlington, Ujedinjeno Kraljevstvo); MBL (3E7: direktno protiv domena prepoznavanja ugljikohidrata MBL, Hycult biotechnology, Uden, Nizozemska) i C9 neoantigen (aE11, Hycult biotechnology). Unakrsna reaktivnost je potvrđena prethodnom inkubacijom specifičnih antitijela, prije njihove upotrebe, s ljudskim peptidima koji su korišteni za njihovo podizanje. Pre-inkubacija je ukinula specifično bojenje na svinjskom tkivu.

Imunofluorescencija tkiva i konfokalna laserska skenirajuća mikroskopija

Karakterizacija i lokalizacija PTX3 signala istražena je na zamrznutom tkivu uključenom u OCT medijum (Tissue-Tek). Stakalca su inkubirana sa 5% zečjeg seruma 1 sat na 37 stepeni C. Stakalca su zatim inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi sa specifičnim antitelima. Nakon tri ispiranja u PBS, stakalca su zatim inkubirana sa odgovarajućim sekundarnim antitelima (Alexa Flour 488 i 555, Molecular Probes, Eugene, OR). Sve sekcije su obojene sa TO-PRO-3 (molekularne sonde). Negativne kontrole su pripremljene sa irelevantnim antitelima. Sekcije su analizirane pomoću konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa Leica TCS SP2 (Leica, Wetzlar, Njemačka). Broj infiltrirajućih ćelija mjeren je u najmanje 10 polja velike snage (x630)/presjeku od strane dva nezavisna posmatrača koji su zaslijepili porijeklo stakalca. Konačna izračunavanja su bila srednja vrijednost dvije mjere. Ni u kom slučaju varijabilnost među posmatračima nije bila veća od 20 posto.

Ćelijska kultura i analiza protočne citometrije

Endotelne ćelije ljudske pupčane vene (HUVEC, EC) kupljene su od American Type Culture Collection (ATCC-LGC Standards, Sesto San Giovanni, Italija). EC je uzgajan u njihovom preporučenom mediju, EndoGro (Merck Millipore, Darmstadt, Njemačka). EC je postavljen u gustini od 1{{10}},000ćelija/cm2 i stimulisan je tretmanom H2O2 (3 procenta, 1 sat). Zatim su bazalni i stimulisani EC dva puta isprani sa PBS i uklonjeni sa PBS-EDTA 2mM i tripsinom 0.001×. Zatim su ćelije resuspendirane u PBS i inkubirane sa PTX3 (rekombinantni humani PTX3, Sigma-Aldrich, Merck, Njemačka) (1 ug/ml) ili/i sa rhC1-INH (Ruconest®, Pharming) (2,5 ug /ml) 60 min. Nakon tri puta ispiranja sa PBS 1X, ćelije su resuspendirane u puferu za protočnu citometriju (FACS) (fiziološka otopina puferirana fosfatom, pH 7,2, 0,2 posto goveđeg serumskog albumina i 0,02 posto natrijum azida) i inkubirane sa reagensom za blokiranje FCR (Miltenyi) za 10 min na sobnoj temperaturi. Nakon blokiranja, EC su inkubirani sa zečjim anti-humanim C1-INH (obezbeđen od prof. M. Daha, Univerzitet u Leidenu, 1//100 razrjeđenje) ili/i sa pacovskim anti-PTX3 (MNB4, Exira Life Sciences In., 1/20 razrjeđenje) na sobnoj temperaturi 30 min i ispran FACS puferom. Zatim su ćelije inkubirane sa kozjim anti-zečjim IgG PE (Molecular Probes, 1/100 dilution) ili/sa anti-rat IgG FITC (Molecular Probes, 1/100 Dilution) na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta i isprane tri puta. Ćelije su analizirane pomoću FC500 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) i Kaluza softvera. Područje pozitivnosti je određeno korištenjem mAb usklađenog s izotipom i, ukupno, prikupljeno je 104 događaja za svaki uzorak. Izvedena su tri nezavisna eksperimenta.

Statistička analiza

Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD) i upoređeni su korištenjem analize varijanse ili uparenog Studentovog t-testa, prema potrebi. Razlike su se smatrale statistički značajnim kada su p vrijednosti bile manje od 0.05. Podaci su analizirani pomoću softverskog paketa Statview (verzija 5.0) (SAS Inc. Co., Cary, NC, USA). Grafikoni su prikazani pomoću softvera GraphPad Prism 5.

Skraćenice

I/R: ishemija/reperfuzija; EC: endotelne ćelije; PTX3: pentraxin 3; FSP-1: fibroblast-specifični protein 1; N-kadherin: neuronski kadherin; alfa-SMA: alfa-aktin glatkih mišića.

DOPRINOSI AUTORA

CD je koordinirao studiju, učestvovao u imunoobilježavanju i konfokalnoj mikroskopiji bubrežnih sekcija i izradio rukopis. AS i RF su učestvovali u dizajnu studije, doprineli analizi podataka, izveli in vitro eksperimente i kritički revidirali rukopis. MR i GSN su izvršili histopatološke analize slike. LL, FS, AMC su izveli životinjski model ishemijsko-reperfuzijske ozljede i pomogli u reviziji rukopisa. GL, PD i MB izvršili su sve hirurške zahvate na modelu svinje i pomogli u reviziji rukopisa. MRD, P.vdP., C.vK. i FS revidirali su rukopis.

PP, ER, GG, GS i LG su kritički revidirali rukopis. GC je obezbijedio nove analitičke alate, dizajnirao i nadgledao istraživanje. CD, AS i RF podjednako su doprinijeli ovoj studiji. Svi autori dali su doprinos članku i odobrili dostavljenu verziju.

ZAHVALNICA

Zahvaljujemo Claudia Curci iz Jedinice za bubrege, dijalizu i transplantaciju, Odjel za hitne slučajeve i transplantaciju organa,

Univerzitetu u Bariju na odličnoj tehničkoj pomoći.

SUKOB INTERESA

Autori izjavljuju da nemaju sukoba interesa.

FINANSIRANJE

Ovu studiju je podržao Univerzitet u Bariju "Aldo Moro", Ministarstvo zdravlja Italije (GR 2016- 02362239 "Pristup zasnovan na transkriptomiji za identifikaciju prediktivnih faktora i terapijskih ciljeva za odloženu funkciju transplantata ububregprimaoci transplantacije", Bando di Ricerca Finalizzata 2016, CD je dobio stipendiju za ovaj projekat) i Fondo Sociale Europeo, Azione I.2 "Attrazione e Mobilità Internazionale dei Ricercatori"- AIM-1810057-aktivnost 2 dodeljena AS

REFERENCE

1. Bonventre JV, Yang L. Stanična patofiziologija ishemijske akutnebubregpovreda. J Clin Invest. 2011; 121:4210–21.

2. Jang HR, Rabb H. Urođeni imuni odgovor u ishemijskom akutnom oblikububregpovreda. Clin Immunol. 2009; 130:41–50.

3. Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD. Komplement: ključni sistem za imunološki nadzor i homeostazu. Nat Immunol. 2010; 11:785–97.

4. Thurman JM, Holers VM. Centralna uloga alternativnog puta komplementa u ljudskim bolestima. J Immunol. 2006; 176:1305–10. PMID:16424154

5. Franzin R, Stasi A, Fiorentino M, Stallone G, Cantaluppi V, Gesualdo L, Castellano G. Sistem zapaljenja i komplementa: veza između akutnogBubregPovrede i hronična oštećenja transplantata. Front Immunol.

2020; 11:734.PMID:32457738

6. Deban L, Jaillon S, Garlanda C, Bottazzi B, Mantovani A. Pentraksini u urođenom imunitetu: lekcije iz PTX3. Cell Tissue Res. 2011; 343:237–49.PMID:20683616

7. Cieślik P, Hrycek A. Long pentraxin 3 (PTX3) u svjetlu njegove strukture, mehanizma djelovanja i kliničkih implikacija. Autoimunost. 2012; 45:119–28.PMID:21988562

8. Kunes P, Holubcova Z, Kolackova M, Krejsek J. Pentraxin 3(PTX 3): endogeni modulator inflamatornog odgovora. Mediators Inflamm. 2012; 2012:920517.PMID:22577258

9. Garlanda C, Bottazzi B, Bastone A, Mantovani A. Pentraksini na raskrsnici između urođenog imuniteta, upale, taloženja matriksa i plodnosti kod žena. Annu Rev Immunol. 2005; 23:337–66.115756PMID:15771574

10. Bottazzi B, Garlanda C, Cotena A, Moalli F, Jaillon S, Deban L, Mantovani A. Dugi pentraxin PTX3 kao prototipski humoralni receptor za prepoznavanje obrazaca: interakcija sa ćelijskim urođenim imunitetom. Immunol Rev. 2009; 227:9–18.PMID:19120471

11. Ma YJ, Doni A, Hummelshøj T, Honoré C, Bastone A, Mantovani A, Thielens NM, Garred P. Sinergija između fikolina-2 i pentraksina 3 pojačava urođeno imunološko prepoznavanje i depoziciju komplementa. J Biol Chem. 2009; 284:28263–75.PMID:19632990

12. Netti GS, Lucarelli G, Spadaccino F, Castellano G, Gigante M, Divella C, Rocchetti MT, Rascio F, Mancini V, Stallone G, Carrieri G, Gesualdo L, Battaglia M, Ranieri E. PTX3 modulira imunoflogozu u tumoru. mikrookruženje i prognostički je faktor za pacijente sa bistrocelularnim karcinomom bubrežnih stanica. Starenje (Albany NY). 2020; 12:7585–602.PMID:32345771

13. Souza DG, Amaral FA, Fagundes CT, Coelho FM, Arantes RM, Sousa LP, Matzuk MM, Garlanda C, Mantovani A, Dias AA, Teixeira MM. Dugi pentraxin PTX3 je ključan za upalu tkiva nakon

crijevna ishemija i reperfuzija kod miševa. Am J Pathol. 2009; 174:1309–18.PMID:19286566

14. Jaillon S, Peri G, Delneste Y, Frémaux I, Doni A, Moalli F, Garlanda C, Romani L, Gascan H, Bellocchio S, Bozza S, Cassatella MA, Jeannin P, Mantovani A. Humoralni receptor za prepoznavanje obrazaca PTX3 pohranjuje se u granulama neutrofila i lokalizira se u ekstracelularnim zamkama. J Exp Med. 2007; 204:793–804.PMID:17389238

15. Tong M, Carrero JJ, Qureshi AR, Anderstam B, Heimbürger O, Bárány P, Axelsson J, Alvestrand A, Stenvinkel P, Lindholm B, Suliman ME. Pentraxin 3 u plazmi u bolesnika s kroničnimbubregbolest: povezanost s bubrežnom funkcijom, proteinskom energijom, gubitkom, kardiovaskularnim bolestima i smrtnošću. Clin J Am Soc Nephrol. 2007; 2:889–97.PMID:17702732

16. Witasp A, Rydén M, Carrero JJ, Qureshi AR, Nordfors L, Näslund E, Hammarqvist F, Arefin S, Kublickiene K, Stenvinkel P. Povišeni nivoi cirkulacije i ekspresija pentraksina 3 u tkivu u uremiji: odraz endotelne dy. PLoS One. 2013; 8: e63493.PMID:23658833

17. Presta M, Camozzi M, Salvatori G, Rusnati M. Uloga rastvorljivog receptora za prepoznavanje obrazaca PTX3 u vaskularnoj biologiji. J Cell Mol Med. 2007; 11:723–38.PMID:17760835

18. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, Barbagallo M, Magrini E, Garlanda C, Mantovani A. Pentraksini PTX3 i SAP u urođenom imunitetu, regulaciji upale i remodeliranju tkiva. J Hepatol. 2016; 64:1416–27.

19. Xiao Y, Yang N, Zhang Q, Wang Y, Yang S, Liu Z. Pentraxin 3 inhibira akutnu intersticijalnu fibrozu izazvanu oštećenjem bubrega supresijom IL-6/Stat3 puta. Upala. 2014; 37:1895–901.PMID:24854162

20. Inforzato A, Reading PC, Barbati E, Bottazzi B, Garlanda C, Mantovani A. "Slatka" strana dugog pentraksina: kako glikozilacija utječe na funkcije PTX3 u urođenom imunitetu i upali. Front Immunol. 2013; 3:407. PMID:23316195