Dio 3: Učinci izorhamnetina na dijabetes i njegove pridružene komplikacije: Pregled in vitro i in vivo studija i post hoc transkriptomska analiza uključenog molekularnog puta
Mar 29, 2022
Za više informacija. kontakttina.xiang@wecistanche.com
5. Post hoc analiza transkriptoma predviđa potencijalni efekat izorhamnetina na dijabetes u alatu zasnovanom na matičnim ćelijama
Uspostavili smo alat baziran na matičnim ćelijama koristeći perinatalnimatične ćelije, humane amnionske epitelne ćelije (hAECs), za procjenu bioaktivnosti prirodnih jedinjenja koristeći analizu mikromreža cijelog genoma [71,140-144]. Posljednjih godina sve veći broj bioaktivnih spojeva u ljekovitom bilju provjerava se u pogledu njihovog potencijalnog terapeutskog i preventivnog djelovanja. U ovom kontekstu, pristupi zasnovani na matičnim ćelijama koji koriste ljudske pluripotentne matične ćelije (hPSC) dobijaju veliku pažnju kao fiziološki relevantniji in vitro ljudski modeli za skrining lekova i validaciju hiljada jedinjenja kako u akademskim istraživanjima tako iu farmaceutskoj industriji[{{4} }]. Međutim, hPSC, uključujući embrionalne matične ćelije (hESC) i indukovane pluripotentne matične ćelije (hiPSC), imaju ograničene ćelijske resurse, zahtevaju invazivne procedure ekstrakcije, skupo reprogramiranje ćelija i kritične procedure održavanja, kao i postavljaju etička ograničenja i stoga su manje povoljni kao praktičan izvor za skrining na droge. S druge strane, hAEC su izvedeni iz odbačene placente, medicinskog otpada. Ne zahtijevaju invazivne procedure berbe i imaju minimalne etičke brige. Nadalje, hAEC su izvedeni iz pluripotentnih epiblasta i tako održavaju potencijal višelinijske diferencijacije sličan ESC-u i mogu se diferencirati u ćelije iz sva tri zametna sloja [148-151].
Vrijedi napomenuti da se uz odgovarajući protokol diferencijacije, hAEC mogu diferencirati u ćelije slične hepatocitima [152-155], holangiocite [156] i, što je najvažnije, ćelije koje proizvode inzulin slične pankreasu[157-160 ]. Transplantacija hAEC-indukovanih ćelija pankreasa u dijabetičke miševe izazvane streptozotocinom mogla bi normalizovati nivo glukoze u krvi[161]. hAEC[162], kao i egzosomi izvedeni iz hAECs [163], mogu ubrzati zacjeljivanje dijabetičkih rana promicanjem angiogeneze i funkcije fibroblasta i smanjenjem upale. Uključivanje hAEC-a u organoide otočića [164] i zaštita nativnih otočića slojem hAEC-a [165] moglo bi poboljšati presađivanje otočića i revaskularizaciju u modelima dijabetičkih miševa. Dodatno, hAEC izvedene ćelije slične hepatocitima, kao i sam hAEC, prijavljeno je da imaju terapeutsku efikasnost kod oboljenja jetre, uključujući fibrozu jetre [166,167], cirozu [168] i zatajenje jetre [169].
Uzimajući u obzir složenu patofiziologiju DM, hAEC možda nije idealan in vitro model za proučavanje antidijabetičkih efekata jedinjenja. Međutim, zbog svojih svojstava sličnih matičnim ćelijama, može se koristiti za početni skrining ciljnih jedinjenja. Prethodno smo istraživali antifibrotički[71] i potencijal izorhamnetina koji izaziva diferencijaciju [170] u hAEC-ima. U ovoj studiji izvršili smo ciljanu sekundarnu analizu naših prethodno objavljenih podataka [71] kako bismo istražili potencijalne funkcionalnosti izorhamnetina udijabetes(Figure 4). Data analysis was conducted for three biological replicates of day 10 control (n = 3) and isorhamnetin-treated (n =3) hAECs. The cells were grown in 3D cell culture. Control cells were maintained in placental basal epithelial cell medium(Promo Cell, Cat.#C-26140)in absence of any differentiation medium or growth factors, whereas treatment cells were supplemented with 20 mM of isorhamnetin (Sigma-Aldrich, Japan) for 10 days. Differentially expressed genes (DEGs) are referred to as genes with a linear fold change>2 i p-vrijednost<0.05(one-way between-subjects="" anova).="" a="" total="" of="" 303="" degs="" were="" identified;="" among="" them,="" 60="" were="" upregulated="" and="" 243="" were="" downregulated.="" details="" of="" methodology="" have="" been="" explained="" elsewhere="" [71,170].="" all="" microarray="" data="" are="" available="" at="" gene="" expression="" omnibus(geo)="" under="" accession="" number:="" gse153149="" (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc="GSE153149,accessed" on="" 24="" november="">
Kliknite ovdje da saznate više o proizvodima
5.1. Setovi gena za potpis tipa ćelije
U našim prethodnim studijama o hAECs, otkrili smo da različite vrste jedinjenja mogu usmjeriti diferencijaciju hAEC prema različitim ćelijskim linijama, kao što su ester kafeinske kiseline, ružmarinska kiselina [142] i derivat kafeoilkinske kiseline3,4,5- Tri-O-Caffeoylquinic Acid (TCQA)[140] koja bi mogla poboljšati diferencijaciju nervnih ćelija, dok je antocijanin, cijanidin-3-O-glukozid (Cy3G), inducirao diferencijaciju adipocita [143] u hAECs. Primetili smo da se bioaktivnost ili funkcionalnost prirodnih jedinjenja generalno može predvideti iz obogaćenih tipova ćelija pomoću DEG.
Ispitali smo značajno obogaćene skupove podataka o potpisu tipa ćelije koristeći bazu podataka molekularnih potpisa (MSigDB)ver. 7.4 GSEA softvera na mreži (https://software. broadinstitute.org/gsea/index.jsp; pristupljeno 26. novembra 2021.)[171]. Ovi skupovi gena sadrže klaster marker potpisne gene za tipove ćelija identificirane u studijama sekvenciranja jedne ćelije ljudskog tkiva i olakšavaju dodjelu tipova ćelija u skupovima podataka, kao što su eksperimenti razvoja organoidnih modela.
Otkrili smo da su najznačajnije obogaćene genske grupe pankreasa mezenhimalne stromalne ćelije [172] (Slika 4A). Pored toga, tipovi duktalnih i endotelnih ćelija pankreasa su značajno obogaćeni [172]. Geni za potpis gušterače u hAEC-ovima tretiranim izorhamnetinom uključeni su u epitelno-mezenhimsku tranziciju, TGF-signalizaciju, TNF-signalizaciju preko NF-kB, KRAS signalizaciju i metabolizam masnih kiselina. Nekoliko skupova gena za potpis jetre je također značajno obogaćeno, kao što su HSC, Kupferove ćelije, ćelije žučnih kanala [173] i mezotelne ćelije fetalne jetre [174]. Postojalo je i nekoliko značajno obogaćenih skupova gena za potpis skeletnih mišića, uključujući fibrillin1 plus fibro-adipogene progenitorske (FBN1 plus FAP) ćelije, fibro-adipogene progenitorske (FAP) ćelije i pericite skeletnih mišića [175]. Biološke funkcije jetrenih signaturnih gena u hAEC-ovima tretiranim izorhamnetinom uključuju nekoliko puteva upalnog odgovora, dok geni za potpis skeletnih mišića reguliraju zacjeljivanje rana, organizaciju kolagenih vlakana i MAPK kaskadu. Značajnost je izmjerena kao stopa lažnog otkrića, analoga hipergeometrijske p-vrijednosti nakon Benjaminijeve i Hochbergove korekcije za testiranje više hipoteza (FDR q-vrijednost<>
5.2.Značajno obogaćeni skupovi gena markera
Zatim smo ispitali značajno obogaćene skupove gena na MSigDB (preuzeto 26. novembra 2021.). Označeni skupovi gena predstavljaju specifična, dobro definisana biološka stanja ili procese generisane na osnovu identifikacije preklapanja genskog skupa i zadržavanja gena koji pokazuju koherentnu ekspresiju. Obilježja imaju kolekciju od 50 skupova gena kondenziranih iz preko 4000 preklapajućih setova gena i tako imaju smanjenu buku i redundantnost [176].
Značajno obogaćeni skupovi karakterističnih gena uključuju gene koji definiraju epitelno-mezenhimsku tranziciju, gene koji su regulirani kao odgovor na hipoksiju, gene regulirane NF-kB kao odgovor na TNF, gene koji se reguliraju gore i dolje aktivacijom KRAS, gene koji posreduju apoptozu aktivacijom kaspaza, gene uključene u miogeneza, geni koji su regulirani kao odgovor na TGF- 1, geni regulirani STAT5 kao odgovor na IL-2 stimulaciju, geni koji definiraju inflamatorni odgovor, geni uključeni u puteve i mreže p53 i geni koji kodiraju proteine uključene u glikolizu i glukoneogeneza (Slika 4B). Značajnost je razmatrana na FDR q-vrijednosti<>
Zanimljivo otkriće je obogaćivanje KRAS aktivacije pomoću DEG-a hAEC-a tretiranih izorhamnetinom. Utvrđeno je da je nekoliko ekspresija gena izazvanih KRAS značajno smanjeno izorhamnetinom, kao što su MMP9, TSPAN1 i ITGBL1. Hiperglikemija izaziva genomsku nestabilnost koja dovodi do KRAS mutacija u ćelijama pankreasa [177] i takođe je povezana sa povećanim rizikom i invazivnošću karcinoma pankreasa [178] i debelog creva [179]. Wang i saradnici su izvijestili da izorhamnetin potiskuje proliferaciju ćelijske linije adenokarcinoma pankreasa PANC-1 kroz smanjenje aktivnosti Ras/MAPK signalnog puta [134]. Stoga, kao što je spomenuto u odjeljku 4.2.4, efekat izorhamnetina na rizik od karcinoma izazvanog KRAS-om kod dijabetesa, posebno karcinoma gušterače, vrijedan je daljeg istraživanja.
5.3. Značajno obogaćeni putevi
Dalja analiza putanja DEG-ova sprovedena je korišćenjem Comparative Toxicogenomics Database (CTD) (http://ctdbase.org/; pristupljeno 29. novembra 2021.)[180]. CTD predstavlja Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) i REACTOME puteve. Našli smo ih nekolikoinflamatornoputevi, formiranje i sklapanje kolagena, signalni put PI3K-Akt i signalni put AGE-RAGE kod dijabetičkih komplikacija su značajno obogaćeni (slika 4C).
Krajnji proizvodi napredne glikacije (AGE) nastaju neenzimskom glikacijom i oksidacijom proteina, lipida i nukleinskih kiselina. Receptori za krajnje produkte napredne glikacije (RAGE) pripadaju superfamiliji imunoglobulina. AGE/RAGE signalizacija je složena i zamršena kaskada koja aktivira višestruke intracelularne signalne puteve koji uključuju protein kinazu C, NADPH oksidazu i MAPK, što rezultira ekspresijom IL-1, IL-6 izazvanom NF-kB, TNF-, VCAM-1 i VEGF. Konkretno, AGE/RAGE signalizacija je implicirana u dijabetesom posredovanu vaskularnu kalcifikacija kroz aktivaciju TGF posredovane fibroze, NFkB i ERK1/2 puteva [181-184]. Otkrili smo da izorhamnetin značajno smanjuje ekspresiju gena povezanu sa AGE/RAGE signalizacijom, kao što su COL1A1, COL1A2, COL4A6, FN1, MMP2 i SERPINE1. Kao što je diskutovano u prethodnom odeljku, antifibrotični efekti izorhamnetina su dobro dokumentovani [71,74,99,119], pa se stoga može tvrditi da izorhamnetin takođe može imati korisne efekte u vaskularnoj patologiji izazvanoj dijabetesom.
5.4. Značajno obogaćene metaboličke bolesti i srodne ekspresije gena
Kurirani podaci o povezanosti gena i bolesti preuzeti su iz CTD-a (preuzeto 29. novembra 2021.). Kurirali smo samo značajno obogaćene metaboličke bolesti. Značajnost obogaćivanja izračunata je hipergeometrijskom raspodjelom prilagođenom Bonferronijevom metodom. Značajno obogaćene metaboličke bolesti uključivale su DM, poremećaje metabolizma glukoze i lipida, hiperglikemiju i gojaznost (Slika 4D). Heatmap pokazuje da su PPAR, TGF, TNF, IL, kolagen i ekspresije gena koje induciraju apoptozu značajno smanjene u hAEC tretiranim izorhamnetinom (Slika 4E). S druge strane, inzulinski receptori, lipoproteinske lipaze i inhibitori apoptoze su značajno povećani u hAEC tretiranim izorhamnetinom.
Naša ciljana analiza podataka mikromreža hAEC-a tretiranih izorhamnetinom također je potvrdila potencijal izorhamnetina u regulaciji bioloških funkcija povezanih s DM i s njim povezanim komplikacijama.
6. Bioraspoloživost i crijevna apsorpcija izorhamnetin aglikona i njegovih glikozilovanih derivata
Uz prisustvo raznih kategorijaflavonoidiu prirodi je zanimljivo analizirati prisustvo ovih jedinjenja u organizmu. Kada govorimo o metabolizmu izorhamnetina i njegovoj dostupnosti u ljudskom tijelu nakon konzumiranja, govorimo o porijeklu, metabolizmu i transportu. Ovo se zasniva na zapažanju hromatografijom nekih flavonoida kao što su flavonoli u ljudskom serumu. Tečna hromatografija-masena spektrometrija pruža uvid u bioraspoloživost određenih flavonoida u njihovim aglikonskim i glikozidnim oblicima u tijelu [49]. Masena spektrometrija se može koristiti za određivanje flavonoida u biološkim uzorcima [185]. Studija je objavila 23 miješana derivata sulfata, metila, glukuronida i glukozekvercetinu urinu i plazmi ljudskih dobrovoljaca 1 h nakon gutanja lagano prženog crvenog luka. Ova studija je otkrila glikozide i kvercetina i izorhamnetina u plazmi [186].
Nekoliko faktora igra ulogu u ulasku nutrijenata kroz probavni trakt. Na primjer, enzimi iz crijevne mikrobiote utiču na ulazak fenolnih spojeva.
Studija provedena na ekstraktima lista ginka na modelu miševa pokazala je važnost crijevne mikrobiote na bioraspoloživost i apsorpciju nekih bioaktivnih molekula iz gastrointestinalnog trakta, posebno izorhamnetina [187]. U ovom koraku proizvode enzimi crijevne mikrobioteflavonoidaaglikoni i razni proizvodi prstenaste fisije. Analize uzoraka pune krvi pokazale su da je unos izorhamnetina povećan antibakterijskim tretmanom, što sugerira da enzimi crijevne mikrobiote imaju negativan učinak na farmakokinetiku prirodnih molekula, kao što je izorhamnetin.Antibakterijskiili konzumacija probiotika može povećati bioraspoloživost glikozidnog oblika izorhamnetina. Osim toga, in vitro stope biotransformacije i vremena zadržavanja bioaktivnih molekula razlikovali su se između normalnih, dijabetičkih i dijabetičkih pacova s nefropatijom [188].
S druge strane, različiti membranski transporteri kontroliraju transport flavonoida, kao što je transporter glukoze ovisan o natrijumu 1 (SGLT1) i proteini 2 i 3 povezani s rezistencijom na više lijekova (MRP2 i MRP3)[189]. U tom kontekstu, MRP transporteri regulišu transcelularne i paracelularne transportne puteve izorhamnetina [190]. Unutar ćelija, transport izorhamnetina sa apikalne na bazalnu stranu bio je 6.8-9.3-put veći. Na slici 5 sumirani su antidijabetički efekti izorhamnetina.
7. Zaključci
Izorhamnetin je fenolno jedinjenje iz porodice flavonoida, tačnije flavonola. Izvorno je to molekul kvercetina, ali je prošao metilaciju. Isorham-netin je rasprostranjen u biljnom carstvu u mnogim divljim i kozmetičkim biljkama. Osim toga, nekoliko ljekovitih biljaka proizvodi ovu molekulu i nekoliko studija je potvrdilo njegov antidijabetički učinak među ostalim biološkim aktivnostima. Svi ovi podaci stoga pokazuju interes izorhamnetina u terapijskoj industriji. Iz ove perspektive, bilo bi vrlo zanimljivo istražiti učinak izorhamnetina i njegovih derivata, izolovanih posebno iz prirodnih resursa, na metaboličke poremećaje. Također je potrebno istaknuti i revidirati kliničke studije provedene u ovom kontekstu korištenjem frakcija bogatih flavonoidima i prirodnih proizvoda kako bi se izbjegao utjecaj nuspojava uzrokovanih sintetičkim i kemijskim lijekovima.
Reference
1. Gill, SS; Tuteja, N. Reaktivne vrste kiseonika i antioksidansi u toleranciji na abiotski stres u biljnim kulturama. Plant Physiol. Biochem. 2010, 48, 909–930. [CrossRef] [PubMed]
2. Corpas, FJ; Gupta, DK; Palma, JM Mjesta proizvodnje reaktivnih vrsta kisika (ROS) u organelama iz biljnih stanica. U vrstama reaktivnog kisika i oksidativnim oštećenjima u biljkama pod stresom; Springer: Berlin/Heidelberg, Njemačka, 2015; str. 1–22.
3. Falleh, H.; Oueslati, S.; Guyot, S.; Dali, AB; Magné, C.; Abdelly, C.; Kouri, R. LC/ESI-MS/MS karakterizacija procijanidina i propelargonidina odgovornih za jaku antioksidativnu aktivnost jestivog halofita Mesembryanthemum edule L. Food Chem. 2011, 127, 1732–1738. [CrossRef]
4. Trabelsi, N.; Oueslati, S.; Falleh, H.; Waffo-Téguo, P.; Papastamoulis, Y.; Mérillon, J.-M.; Abdelly, C.; Ksouri, R. Izolacija moćnih antioksidansa iz medicinskog halofita Limoniastrum guyonianum. Food Chem. 2012, 135, 1419–1424. [CrossRef] [PubMed]
5. Boulaaba, M.; Mkadmini, K.; Tsolmon, S.; Han, J.; Smaoui, A.; Kawada, K.; Ksouri, R.; Isoda, H.; Abdelly, C. In vitro antiproliferativni efekat ekstrakta Arthrocnemum Indicum na ćelije raka Caco-2 kroz kontrolu ćelijskog ciklusa i srodnu identifikaciju fenola LC-TOF-MS. Evid.-Based Complement. Altern. Med. 2013, 2013, 529375. [CrossRef]
6. Karker, M.; De Tommasi, N.; Smaoui, A.; Abdelly, C.; Ksouri, R.; Braca, A. Novi sulfatirani flavonoidi iz Tamarix Africana i biološke aktivnosti njegovog polarnog ekstrakta. Planta Med. 2016, 82, 1374–1380. [CrossRef]
7. Bourgou, S.; Rebey, IB; Mkadmini, K.; Isoda, H.; Kouri, R.; Kouri, WM LC-ESI-TOF-MS i GC-MS profiliranje Artemisia herbal i procjena njegovih bioaktivnih svojstava. Food Res. Int. 2017, 99, 702–712. [CrossRef]
8. Boulaaba, M.; Medini, F.; Hajlaoui, H.; Mkadmini, K.; Falleh, H.; Kouri, R.; Isoda, H.; Smaoui, A.; Abdelly, C. Biološke aktivnosti i fitokemijska analiza fenolnih ekstrakata iz Salsola kali L. Uloga endogenih faktora u izboru najboljih biljnih ekstrakata. S. Afr. J. Bot. 2019, 123, 193–199. [CrossRef]
9. Najjar, H.; Abdelkarim, BA; Doria, E.; Boubakri, A.; Trabelsi, N.; Falleh, H.; Tlili, H.; Neffati, M. Fenolni sastav nekih tuniskih ljekovitih biljaka povezan sa antiproliferativnim djelovanjem na MCF-7 ćelije raka dojke kod ljudi. EuroBiotechnol. J. 2020, 4, 104–112. [CrossRef]
10. Bourgou, S.; Bettaieb Rebey, I.; Ben Kaab, S.; Hammami, M.; Dakhlaoui, S.; Sawsen, S.; Msaada, K.; Isoda, H.; Ksouri, R.; Fauconnier, M.-L. Zeleni rastvarač za zamjenu heksana za ekstrakciju bioaktivnih lipida iz sjemenki crnog kima i bosiljka. Hrana 2021, 10, 1493. [CrossRef]
