Dio 2: Molekul ozljede bubrega-1 je potencijalni receptor za SARS-CoV-2
May 11, 2022
Za više informacija. kontakttina.xiang@wecistanche.com
Kliničke manifestacije korona virusa
1. Period inkubacije je dug, a glavni simptomi su temperatura, umor, grlobolja i kašalj. Groznica može biti visoka, umjerena ili niska temperatura;
2. Dojenčad i starije osobe nisu tipične i često su praćene zviždanjem i dispnejom. U teškim slučajevima može doći do oštećenja više sistema;
3. Suhi kašalj u ranoj fazi je uglavnom paroksizmalan i jak, sličan velikom kašlju, koji utiče na san i aktivnosti; u kasnijoj fazi, kašalj je ispljuvak, ispljuvak je opak, povremeno sadrži malu količinu krvi, a neki su praćeni zviždanjem;
4. Neki pacijenti imaju blage simptome i možda nemaju temperaturu. Većina pacijenata ima dobru prognozu, a mali broj pacijenata je kritično bolestan ili čak umire;
5. Sindrom akutnog respiratornog distresa, septički šok, refraktorna metabolička acidoza i koagulacijska disfunkcija.
Kako spriječiti novi korona virus, poboljšanje vlastitog imuniteta je najefikasnije sredstvo za borbu protiv virusa. Cistanche, koji se od antičkih vremena koristio kao hranljivo blago, poznat je kao "pustinjaginseng" i kralj je jačanja imuniteta. Cistanche - Kralj jačanja imuniteta
Savremenim medicinskim istraživanjima dokazano je da osim funkcije ishrane i jačanja organizma, Cistanche ima značajna ljekovita svojstva u prevenciji tumora, protiv starenja, protiv aritmije, inhibiciji apoptoze i poboljšanju imuniteta. uslugu.
Theukupni glukozidi Cistancheasu aktivne komponente ginsenga za regulaciju imunološke funkcije, što može poboljšati imunološku funkciju ne samo za normalne ljude već i za osobe sa niskom imunološkom funkcijom.
Kliničkim zapažanjem je potvrđeno da Cistanche ima određeno ljekovito djelovanje na maligne tumore, te ima očigledan učinak povećanja leukocita. Uzimanje ginsenga tokom radioterapije i kemoterapije može smanjiti toksične i nuspojave radioterapije i kemoterapije, ubrzati popravak oštećenog tkiva i spriječiti leukopeniju;
Diskusija
Boriti se protivPandemija COVID-19, duboko razumijevanje kakoSARS-CoV-2invaziju na ljudske ćelije je opravdana. Studije su pokazale direktnu infekciju SARS-CoV-2 ububregpored pluća (Braun et al., 2020; Farkash et al., 2020). Međutim, ACE2 ostaje jedini dobro poznati receptor koji može posredovati u ovoj invaziji. Nadalje, bubrežni tropizam SARS-CoV-2 i povezanipovreda bubregaizgleda neobjašnjivo relativno smanjenim nivoom ACE2 nakon virusne invazije (Kuba et al., 2005). Ovdje naša studija sugerira da KIM1, drastično povećani biomarker za ozljedu bubrega (Yang et al., 2015), posreduje u SARS-CoV-2 invaziji bubrega kao receptor.
Također smo otkrili da se SARS-CoV-2-RBD veže za KIM1 sa većim afinitetom od SARS-CoV-RBD i MERS-COV-RBD, što vjerovatno leži u osnovi jače zaraze SARS-CoV-2 (Rabaan et al, 2020); stoga, renalna infekcija i uloge KIM1 u ovim teškim respiratornim bolestima vrijedne ponovnog razmatranja. Posebno, naši rezultati sugeriraju različita mjesta vezivanja KIM1 i ACE2 na virusnom RBD-u, stoga je vrijedno istražiti da li i kako KIM1 i ACE2 posreduju u invaziji SARS-CoV-2 u ovim organima. Osim toga, budući da se KIM1 endocitozira putem puteva zavisnih od klatrina (Zhao et al., 2016), također bi bilo zanimljivo dalje istražiti KIM{21}}zavisni proces nakon vezivanja virusa na ćelijsku membranu.
ACE2 je najbolje proučavan receptor za SARS-CoV-2, ali nije idealna terapijska meta za COVID-19, budući da je široko izražen u više organa i igra ključnu ulogu u regulaciji krvnog pritiska i prevenciju srčane/bubrežne ozljede (Imai et al.,2005; Li et al.,2020d). Nasuprot tome, KIM1 ima jaču povezanost s funkcijom bubrega i visoko je izražen tek nakonpovreda bubrega(Kondratowicz et al,2011; Yuan et al, 2015; Costafreda i Kaplan,2018), što ga čini specifičnijim, a možda i sigurnijim terapijskim ciljem za COVID{3}} pacijente s bubrežnim oboljenjima.
Ukratko, naši podaci ukazuju na ključnu ulogu KIM1 u SARS-CoV-2 bubrežnom tropizmu kao potencijalnog receptora za SARS-CoV-2. Ovdje predlažemo model 'začaranog kruga' posredovanog KIM1 i ACE2 (slika 5G), koji može objasniti bubrežni tropizam SARS-CoV-2 kod pacijenata sa COVID-19. Tokom početne faze SARS-CoV-2 invazije, viši fiziološki nivo (dodatna slika S1) i afinitet vezivanja (dodatna tabela S1) čine ACE2 primarnim ciljem, koji nije specifičan za bubrege. Međutim, nakon početka virusom izazvanog AKl, rezultirajući drastično povećan KIM1 brzo potiče sekundarnu virusnu infekciju posredovanu KIM1 i ACE2, koja je više specifična za bubrege, i posljedično pogoršava oštećenje bubrega u začaranom krugu (Slika 5G). Pristupi koji mogu prekinuti interakciju između SARS-CoV-2 i KIM1, uključujući anti-KIM1 antitijela, inhibitore malih molekula i antagonističke peptide izvedene iz KIM1-, mogu rasvijetliti COVID-19 tretman.
materijali i metode
Materijali
Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >95 posto) je hemijski sintetizirao Genscript. Anti-mišje-lgG antitijelo (p/n 18-8816-33) i anti-lgG anti-zečje antitijelo (p/n 18-8817-33) su dobijene od Rocklanda. IgG with SureBeads" Protein G magnetne kuglice (J2112LB-02) kupljene su od Bio-Rad-a. DAPI (D9542) je od Sigme. Alex Flour 594 označen faloidin (C2205S) je iz Beyotimesa. Antitijela protiv KIM1 (NBP{) Korišteni su 15}}, Novus Biologicals), Flag (F1804, Sigma), HA (H6908, Sigma) i ACE2 (2115-1-AP, Proteintech).
Akvizicija i analiza profila ekspresije KIM1 i ACE2
Da bismo dobili sveobuhvatne profile transkriptoma i proteina KIM1 i ACE2 za ljudska tkiva, prikupili smo i analizirali podatke o transkriptomima i imunohistohemijski bazirane proteinske profile iz Atlasa ljudskih proteina (HPA, https://www.proteinatlas.org), koji je pokazao ekspresija i lokalizacija humanih proteina u tkivima i organima, zasnovana na dubokom sekvenciranju RNA (RNA-seq) iz 37 normalnih tkiva i imunohistohemiji na mikromrežima tkiva koji sadrže 44 tipa tkiva (Uhlen et al., 2015). HPA RNA-seq tkivo gena koji kodira protein je zabilježeno kao srednji transkripti koji kodiraju proteine na milion (pTPM), što odgovara srednjim vrijednostima uzoraka iz svakog tkiva. Nivoi ekspresije proteina zasnovani na histologiji analizirani su ručno u četiri nivoa (nije otkriven, nizak, srednji i visok). Na dodatnoj slici S1, 10 najboljih nivoa tkivne transkripcije i histološki zasnovani nivoi ekspresije proteina KIM1 i ACE2 su navedeni, respektivno, a sažet je profil preklapanja ekspresije KIM1 i ACE2.
Molekularno spajanje i simulacije dinamike
Pristajanje je obavljeno preko Z-Dock-a (http://zdock. umassmed.edu/). Kristalne strukture SARS-CoV-RBD (PBD ID 2AJF), SARS-CoV-2-RBD (PDB ID 6MOJ), MERS-COV-RBD (PDB ID 4L3N), ACE2(PDB ID 1R42) i KIM1 Ig V domen (PDB ID 5DZO) korišten je za traženje potencijalnih modela vezivanja. Najbolje ocijenjeni proteinski kompleksi odabrani su za sljedeće simulacije molekularne dinamike, koje je sproveo Desmond server, a analizirali Pymol2.3 i Maestro11.8.012. Dijagram simulacije dinamike od 50 ns primijenjen je za proučavanje dinamičkih parametara proteinskih kompleksa . Slobodnu energiju vezivanja MM-GBSA izračunao je HawkDock (Misini lgnjatović et al., 2016).
Srednje kvadratna devijacija (RMSD) i srednje kvadratna fluktuacija (RMSF)
RMSD je korišten za procjenu prosječne promjene u pomaku odabira atoma za određeni okvir kao što je opisano (Li et al., 2011). RMSF je proveden za proučavanje promjena pomaka u proteinskom lancu (Li et al., 2011.) .
AKI modeli miša i qPCR
I/R povreda je izvršena na miševima C57BL/6 kao što smo prethodno opisali (Chen et al, 2015, 2017). Za AKI izazvan cisplatinom, 30 mg/kg tjelesne težine cisplatina je intraperitonealno ubrizgano 8-nedeljnim mužjacima miševa, a miševi su žrtvovani 3 dana kasnije. Uzorci krvi i bubrega su prikupljeni za dalju analizu, sa n=4 za svaku eksperimentalnu grupu životinja. Ukupna RNK je izolirana iz bubrega pomoću RNAiso Plus (TaKaRa) i reverzno transkribirana u cDNK korištenjem M-MLV sistema sinteze prvog lanca (Invitrogen). Obilje specifičnih genskih transkripata je procijenjeno qPCR. Prajmeri korišteni u studiji su dati (dodatna tabela S4).
Konstrukcije
Ekspresijski plazmidi sisara za ljudski KIM1, KIM1 Ig V (KIM1 ostaci aa 20-127), KIM1 △lg V (skraćeni KIM1 bez ostataka aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1 lg V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD(SARS-CoV-2-S ostaci aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV{{20 }}RBD-YFP i TIM4-YFP su konstruisani. Proizvodi PCR amplifikacije odgovarajućih cDNK fragmenata su klonirani u vektor baziran na pRK promotoru koji sadrži ili HA ili FLAG oznaku. Plazmidi povezani sa SARS-CoV-2- bili su ljubazni pokloni dr. PHWang sa Univerziteta Shandong.
Ćelijska kultura i transfekcija
Tubularna ćelijska linija ljudskog bubrega HK-2 (dobijena od Kineskog centra za kolekciju tipskih kultura) kultivirana je u mediju DMEM/F12 (Hyclone) koji sadrži 17,5 mM glukoze i 10 posto fetalnog goveđeg seruma. Da bi se procijenio uticaj SARS-CoV-2 na ćelije, HK{7}} ćelije su transficirane sa SARS-CoV-2-S i SARS-CoV-2-RBD plazmidima, a zatim sakupljene za dalje otkrivanje.
Co-IP
Indicirane HK-2/HEK293T ćelije (1×10) su lizirane u 1 ml pufera prije lize (25 mM Tris-HCl, pH7,4, 150 mM NaCl, 1 posto NP-40, 1 mM EDTA, 5 postotak glicerola), koji je formuliran za pulldown i IP testove i kao pufer za ispiranje perlica. Za IP, ćelijski lizat je imunoprecipitiran sa naznačenim antitelom ili odgovarajućim gG magnetnim perlicama SureBeadsTM Protein G preko noći na 4C. Nakon ispiranja puferom za prelizu koji sadrži 500 mM NaCl, kuglice su prokuvane u puferu za punjenje i podvrgnute imunoblotingu (Wan et al., 2017).
FRET test
Unutarstanična interakcija između KIM1 i SARS-CoV-2-RBD je otkrivena standardnim FRET testom (Karpova i McNally, 2006) korištenjem KIM1-CFP i SARS-CoV-2-RBD-YFP . Ukratko, ekspresijski plazmidi sisara koji eksprimiraju KIM1-CFP ili KIM1 Alg V-CFP su kotransficirani sa SARS-CoV-2-RBD-YFP u-293T ćelije. Za detekciju baziranu na fluorescentnom spektrofotometru, ćelije su sakupljene i lizirane 24 sata nakon transfekcije, a lizat je detektovan F-2700 Fluorescencijskim spektrofotometrom (Hitachi) putem skeniranja talasne dužine (500-600nm) i vremenskog skeniranja (435 /527 nm, ekscitacija/emisija). Za konfokalnu detekciju, ćelije su snimljene konfokalnim mikroskopom Leica TCS SP8 pod objektivom velike snage (40×) (CFP kanal: 435/485 nm, ekscitacija/emisija; YFP kanal :485/527nm, ekscitacija/emisija; FRET kanal:435/527 nm, ekscitacija/emisija) (Li et al,2020b). Kotransfekcija nekonjugovanog CFP i YFP uključena je kao negativna kontrola kao što je opisano (Karpova i McNally, 2006). Interakcija između KIM1 i njegovog liganda TIM4 otkrivena je FRET testom kao pozitivna kontrola (Rong et al, 2011).
CRISPR-Cas{1}}posredovao nokaut KIM1
Protokoli zasnovani na CRISPR-Cas{1}}u za inženjering genoma korišteni su kako je opisano (Zhang et al., 2017). Date su vodeći RNK ciljne sekvence za KIM1 (dodatna tabela S4).
FITC označavanje i konfokalna mikroskopija
FITC označavanje je izvedeno kako smo prethodno opisali (Li et al, 2020b; Zhang et al.,2020). Ukratko, SARS-CoV-2-RBD je inkubiran sa FITC-om (molarni omjer 1:5) preko noći, a zatim je dodan 5 mM NHCl da se zaustavi reakcija i ugasi neizreagirani FITC. Otopina je dijalizirana dva puta i liofilizirana za dalju upotrebu.
HEK293T ćelije (5×109) ili HK-2 ćelije (1×107) su inkubirane sa slobodnim FITC ili FITC-SARS-CoV-2-RBD (100 ug/ml za 2). Za analize internalizacije zasnovane na peptidima, AP1 ili AP2 (50 μM) su dodani zajedno sa FITC-SARS-CoV-2-RBD (100 ug/m). Nakon fiksiranja sa 4 procenta (w/v) formaldehida, ćelijske membrane su obojene sa Alex Flour 594 označenim faloidinom (2ug/ml), a jezgre su obojene DAPI (1ug/m), a zatim snimljene Leica TCS SP8 konfokalni mikroskop. Za svaku grupu, najmanje 100 ćelija iz pet polja pod objektivom velike snage (64×) je uključeno u procjenu. Predstavljene su reprezentativne slike. Kvantifikaciju slika je sproveo ImageJ1.8.0.
Testovi vitalnosti ćelija
Ćelije su postavljene na 3000-4000 ćelija po jažici u 96-pločama za jažice. Na 80 posto konfluencije, ćelije inkubirane sa SARS-CoV-2-RBD (100 ug/ml) tretirane su sa ili bez AP1 ili AP2 (10,50,100 μM). Nakon toga je svakom dodano 10 ul MTT (5 mg/ml).
4 h, medijum je uklonjen i dodat je DMSO. Apsorpcija izmjerena na 490 nm je normalizirana na odgovarajuću kontrolnu grupu.
Statistička analiza
Podaci su izraženi kao srednja vrijednost±SD. Značajne razlike procijenjene su dvostranim Studentovim testom. Dvostrana P-vrijednost<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">
