Part1: Homoarginin Ameliorates Diabetic Nephropathy Independent Of Nitric Oxide Synthase-3

Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Apstraktno

Nedavno smo pokazali da dodatak homoargininu dosuđiva zaštitu bubrega u modelima dijabetičara miša. U ovoj studiji smo testirali da li je zaštitni efekat homoarginina sintaza dušika-3 (NOS3)-nezavisan u dijabetičke nefropatije (DN). Eksperimenti su sprovedeni u NOS3 deficient(NOS3-7)miševi i njihov divlji tip littermata koristeći više niskih doza vozila ili streptozotocina i tretirani homoargininom putem vode za piće 24 tjedna. Homoarginin nosa za 24 tjedna u dijabetički NOS3-/ miševi značajno otežan albuminurija, povećana urea dušik u krvi, histopatološke promjene i fibroza bubrega, bubreg fibrotski markeri, i novačenje makrofaga bubrega u usporedbi s vozilom tretirani dijabetičar NOS3-/ miševi. Nadalje, homoarginin supplementacija je obnovila mitohondrijsku funkciju bubrega nakon dijabetesa. Važno je da nije bilo značajnih promjena u izrazu NOS1 bubrega ili NOS2 mRNA između svih grupa. Osim toga, dopuna homoarginina poboljšala je srčanu funkciju i smanjila srčanu fibrozu nakon dijabetesa. Ovi podaci pokazuju da je zaštitni učinak homoarginina nezavisan od NOS3, što će na kraju promijeniti naše razumijevanje mehanizma(-a) kojim homoarginin inducizuje zaštitu bubrega i srca u DN. Homoarginin zaštitni učinak u DN mogao bi biti posredovan putem poboljšanja mitohondrijske funkcije.

Ključne riječi: srčana funkcija,dijabetička nefropatija, homoarginin,NOS3

Kliknite da biste saznali za šta se cistanche koristi

1 UVOD

Dijabetesje ozbiljan i sve rasprostranjeniji uzrok morbiditeta i smrtnosti u SJEDINJENIM Državama, a procjenjuje se da je 12-14% odraslih dijabetičara, sa još višim stopama među etničkim manjinama(Gao et al, 2016; Menke et al, 2015). Ekonomski i produktivni gubici zbog dijabetičke komplikacije su preko 245 milijardi dolara i vode do fizioloških i psiholoških efekata uključujući sistemskeupala,disfunkcija bubrega i srca, depresija, i socijalna tjeskobu (Jha et al.,2018; Menke et al, 2015; Moreno et al.,2018; Tao et al.2015; Vanstone et al., 2015). Dijabetička nefropatija (DN)je hronični progresivni poremećaj koji dovodi do brzog pada i zatajenja bubrega u krajnjem stadiju. Tokom poslednje decenije, incidencija otkazivanje bubrega zbog dijabetesa se udvostručila. Tradicionalne terapije, uključujući krvni pritisak i kontrolu glukoze i druge promjene načina života, bile su samo skromno uspješne u odgađanju napredovanja zatajenja bubrega. Tako je važno identificirati mehanizme koji su uključeni u razvoj i napredovanje dijabetičarabolest bubrega.Cistanche deserticolapripada tradicionalnoj kineskoj medicini i lijek je za tonifikovanje bubrega. Uglavnom se koristi za nedostatak bubrega i janga, kao što su bol u leđa, bol u leđa, impotencija itd. Međutim, većina dijabetičara ima manjak yin-a, a ako imaju nedostatak yanga, mogu ga uzeti na odgovarajući način. Međutim, treba ga koristiti s oprezom u manifestacijama negativne topline kao što su strah od vrućine i noćno znojenje, te suha usta. Svakako se prvo posavijesti sa doktorom.

Homoarginin, endogeni arginin analog, koji nije uključen u sintezu proteina, pojavio se kao novi igrač u zdravlju i bolestima(Pilz et al., 2015). Homoarginin se sintetizira mitohondrijskim argininom: glicinom amidinotransferaze (AGAT) u bubrega koristeći L-arginin i L-lizin kao supstrate(Choe et al., 2013; Ryan & Wells,1964), and catabolized using alanine: glyoxylate aminotransferase 2(AGXT2)(Rodionov et al.2016). Koncentracije homoarginina u plazmi su inverzno korelirane sa rizikom od kardiovaskularnih bolesti i ukupne smrtnosti (Jud et al.,2018; Marz et al, 2010), povećan rizik za fatalne moždane udare(Haghikia et al.,2017), kongestivnog zatajenja srca, i hipertrofije lijeve klijetnice(Atzler et al.,2013,2017; Bahls et al., 2018; Pilz, Edelmann, et al.,2014), starenje(Atzler, Schwedhelm, et al.,2014; Marz et al., 2010), pušenje (Atzler, Gore, et al, 2014; Sobczaket al.,2014; Vogler al,2015; Zwan et al.,2013), indeks tjelesne mase(Atzler, Gore, et al.,2014; Marz et al.2010; Pilz, Teerlink, et al., 2014), and pregnancy(Valtonen et al, 2008). Nizak nivo homoarginina djeluje kao pokazatelj disfunkcije srca, sa povezanim visokim nivoima asimetričkog dimetilarginina(ADMA)(Atzler, Schwedhelm, et al.,2014; Jud et al.,2018; Kayacelebiet al.,2014; Pilzet al.,2015; Vogler al, 2015). Efekti niskog homoarginina na proizvodnju/djelovanje dušika (NO) povezani su sa povećanim rizikom od moždanog udara i ateronkleroze (Haghikia et al, 2017). Endotelna sintaza dušikova oksida (NOS3) konstitutivno je izražena u endotelnim ćelijama, i ona funkcioniše za podešavanje intraćelijskih nivoa NO kao odgovor na nivo kalcija (Zanchi et al., 2000). Homoarginin može doprinijeti SINTEZI NO-a služeći kao supstrat za NOS jer homoarginin, čak i sa svojim slabijim afinitetom prema NOS-u u odnosu na arginin, može biti metaboliziran na NO i homocitrulin (Drechsler et al., 2011). U bubregu, niski homoarginin je jak faktor rizika za iznenadnu srčanu smrt i smrt zbog zatajenja srca u bolesnika sa hemodijalizom (Drechsler et al.,2011). Nadalje, niske razine homoarginina su aso-ciated s povećanim kardiovaskularnim rizikom kod bolesnika sa transplantacijom bubrega(Kayacelebi et al.,2017). U obje životinje (Banchaabouchi et al.,2001; Tofuku et al., 1985)i ljudi (Drechsler et al 2013) sa kroničnim ozljedama bubrega, nivo homoarginina se smanjuje i niske razine homoarginina u plazmi su bile značajno povezane sa smanjenom stopom glomerularne filtracije (GFR)i proteinurija (Ravani et al., 2013). Iako su epidemiološki podaci pokazali da su sniženi nivoi homoarginina aso-ciated sa povećanom smrtnošću u bolesti bubrega i kardiovaskularnih bolesti (Drechsler et al.,2015; Jud et al.,2018; Marz et al, 2010; Ravani et al.,2013), direktni fiziološki mehanizmi homoarginina ostaju nejasni. Ranije smo pokazali da je homoarginin efikasan tretman za DN(Wetzel et al., 2019). Međutim, mehanizam homoarginina u kid-ney i srčanoj disfunkciji nije poznat.

U trenutnoj studiji testirali smo hipotezu da je zaštitno dejstvo homoarginina u funkcijama bubrega i srca kod dijabetesa nezavisno od NOS3. Naši rezultati pokazuju da homoarginin posreduje u zaštiti bubrega i srca kod dijabetičara NOS3-šmice koji će na kraju promijeniti naše razumijevanje mehanizma(a) kojim homoarginin ameliorira dijabetičke ozljede bubrega. Zaštitno dejstvo homoarginina u DN moglo bi se posredovati putem poboljšanja mitohondrijske funkcije.

2. MATERIJALI I METODE

2.1Dijabetični model miša

Svi pokusi na životinjama izvedeni su kod miša starih 6 tjedana (The Jackson Laboratory, Bar C57BL/6J ili NOS3-1-Harbor, ME). Miševi su čuvani na 23°CC i 12:12 svjetlosno-tamnom ciklusu sa slobodnim pristupom standardnom jelu i vodi. Dijabetes je induciran intraperitonealnom injekcijom od 50 mg/kg streptozotocina (STZ) ili kontrolom saline nakon 6-h posta 5 uzastopnih dana. Sve procedure su urađene ujutro tokom cijele studije. Nivo glukoze u krvi je izmjeren od miša koji ne poste koristeći Kontour Sljedeći EZ glukometar s Contour Sljedećim trakama iz miševe repne žile, S dijabetički miševi se definiraju kao da imaju razinu glukoze u krvi preko 350 mg/dl.L-Homoarginin(Sigma, St. Louis MO, Cat #: H1007) je dopunjen u vodi za piće u koncentraciji od 50mg/L kao što je prethodno opisano (Wetzel et al., 2019) i zamijenio svaka 4 dana. Na kraju istraživanja (24 sedmice), prikupljeni su 24-h uzorci urina, miševi su eutanazirani pomoću intraperitonealne injekcije ketamina/ksilazina koktela; plazma je dobivena srčanom punkcijom, a bubrege i srca su uklonjeni za daljnje studije. Za sakupljanje urina, miševi su se pojedinačno 16h smestili u metaboličke kaveze sa slobodnim pristupom vodi za piće, a urin je prikupljen u prikupljanju cijevi koje sadrže 200 μl mineralnog ulja koje sprečava isparavanje urina. Krv je prikupljena srčanom punkcijom i centrifugirala se na 3000 g 3 min na 4°C kako bi se odvojila plazma. Nakon prikupljanja svi uzorci su pohranjeni na -80°CC do analize. Broj miša po grupi je dat u Tabeli 1. Uzorci dobiveni iz Ins2Aita miša dobiveni su kao što je prethodno opisano (You et al., 2015). Sve eksperimente na životinjama odobrio je Univerzitet u Texas Health Science Center u San Antonio Institutional Animal Care and Use Committee.

2.2 Imunohistohemija

Tkivo mišjeg bubrega bilo je fiksiran u 10% formalina i ugrađeno u parafin, a 3-μm sekcije su isječena. Imunohistohemija je izvedena na parafinsko ugrađenim sekcijama sa anti-mišjim Mac-2 antitijelom (klon M3/38; Cedarlane, Burlington, NC)kako je prethodno opisano(Youet al., 2013,2014). Slike su snimljene mikroskopom Olympus BX60 i digitalnim fotoaparatom Olympus Q-Color3 pomoću softvera Q-capture Pro 7. Broj glomerularnih makrofaga je ubrojen u 20 glomerulija/sekcije (br. makrofaga u glomeruli di-vided by no. glomeruli)na zaslijepljen način ispod 40 godina× uvećanje i prosječno kao što je prethodno opisano (Morris et al.,2011; Wetzel et al.,2019; You et al., 2013, 2014).

2.3 Histopatologija bubrega i srca

Bubrege i srca su fiksirani u 4% paraformaldehida, ugrađeni u parafin, a rezani su 5-μum sekcije. Sekcije su bile zaslijepljene Massonom trihromom ili periodičnom kiselinom-Schiff (PAS)mrljama, ispitane na zaslijepljen način, a ocjene su prosječno prosječane. Da bi se utvrdilo postotno područje fibroze, Massonove trihromne slike su dobijene na 10x i analizirane u ImageJ-u kako bi se izmjerila postotna površina fibroze. Reprezentativne slike snimljene su mikroskopom Olympus BX60 i digitalnim fotoaparatom Olympus Q-Color3 pomoću softvera Q-capture Pro 7. Glomerularne karakteristike su mjerene pomoću Bioquant Osteo softvera (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN), a indeks postotaka ozljeda je izračunat kao što je prethodno opisano (Mohan et al.,2008). Za svaki bubreg dobili smo 12 slika i analizirali glomerulus za svako polje koje bi bilo prosječno za svaku životinju za statističku analizu.

2.4 Analitička metodologija

Koncentracija albumina u urinu je mjerena elisa koristeći Albuwell M kit (Excell, Philadelphia, PA)kao što je prethodno opisano(Awad, You, Gao, Gvritishvili, et al.,2015). Kreatinin urina je mjeren pomoću Diazyme Creatinine Assay (Diazyme Laboratories, Poway, CA)(Awad et al, 2011; Awad, You, Gao, Cooper, et al., 2015). Dušik ureje u krvi (BUN)je određen pomoću QuantiChrom urea assay kit (BioAssay Systems, Hayward, CA)kako je prethodno opisano(You et al.,2017). Sistolički pritisci miša mjereni su pomoću coda neinvazivnog sistema krvnog tlaka (Kent Scientific Corporation, Torrington CT) kako je prethodno opisano(Awad, You, Gao, Gvritishvili, et al.,2015). Miševi su bili aklimirani 10 min na 26°C prije početka čitanja. Očitanja su uzeta u isto vrijeme dana da bi sve grupe spriječile bilo kakve diurnalne varijacije.

2.5 Mjerenja srčane funkcije

Serijska B-Mode i M-Mode ehokardiografija je izvedena pomoću Vevo 2100 Imaging Platform(VisualSonics, Toronto, Kanada) pomoću linearne pretvornice od 30 MHz za precizno praćenje srčanih hemodinamičkih parametara i procjenu srčane strukture miševa nakon 22 tjedna liječenja homoargininom. Djelić izbacivanja lijeve klijetnice (EF)i frakciono skupljanje lijeve klijetnice (FS) kvantificirani su pomoću M-moda kao što je prethodno opisano(lorga et al., 2016,2018).

2.6 Izolacija RNK i PCR u realnom vremenu

RNK je izolirana Trizol ekstrakcijom iz cijelih rezova bubrega i reverzno-transkribirana na cDNA koristeći Bio-Rad (Hercules, CA)script DNA synthesis kit. PCR u realnom vremenu je izveden na CFX384real-time sistemu(Bio-Rad,Hercules, CA)koristeći Tagman primere za miš MCU (Mm0116873_m1), fibronektin (Mm01256744_m1), faktor rasta tumora β(TGFβ, Mm01178820_m1), NOS1(Mm00435175_m1), NOS2(Mm00440502_m1),i Rn18S (Mm03928990_gl)(Thermo Fisher, Waltham, MA). Vrijednosti CT su normalizirane na 18S i u odnosu na NOS3samples.Primers za glatki mišićni aktin(FW:5'-CTGCCGTTTTCCCCCTTCCTG-3', RV:5'-TTGCTTCCTCCTCCTTTG-3'),E-kadherin (FW:5'-TGAGTGTGTGGGTGGGGCTGCT GA-3',RV:5'-CGGTTTC AATGGCTTACCTTCC-3'), i β-aktin (FW:5'-GC TGGTTGTGTAAGGTAAGGTGTGGC-3',RV: 5'-GAGG GGGTTGAGGTGTTGGG-3) dobiveni su iz Integriranih TEHNOLOGIJA DNK(Coralville, IA).uzorci cDNA analizirani su pomoću SYBR Green Master Mixa (Thermo Scientific, Rockford IL), kako je prethodno opisano ( Morris et al.,2011), i normalizirano da β-aktin za usporedbu sa NOS3-/- uzorcima.

2.7 Zapadno blotting

Tkivo bubrega je homogenizirano u RIPA baferu koji sadrži 0,1% Triton X-100 dopunjenog inhibitorima proteaze (Roche Dijagnostika, Indianapolis, IN)i očišćen centrifugacijom na 10.000 g 10 min na 4°C, a supernatant je prikupljen. Koncentracija proteina je određena Bicinchonic Acid(BCA)assay(Thermo Scientific, Waltham, MA). Uzorak od 50 ugs lisata bubrega je odvojen na 4-12% Bis-Tris gel(Life Technologies, Carlsbad, CA)i prebačen na PVDF membrane prije blokiranja sa 5%suhim mlijekom. Zapadni bloti su izvedeni koristeći sljedeća antitijela: MiCU1(0,4 ug/ml; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) i β-actin(1:1000; Cell Signaling, Danvers, MA)antitijela. Zapadni bloti su kvantitirani pomoću ImageJ softvera (NIH, Bethesda, MD)i normalizirani na β-actin proteinski izraz.

2.8 Statistička analiza

Poređenja između svih grupa su obavljena pomoću softvera GraphPad Prism(verzija 7.04, San Diego, CA). Rezultati su izraženi kao ± SEM. Jednosmjesna ANOVA praćena Fisherov test razlike najmanjeg značaja korišten je za usporedbu značaja između grupa. Vrijednost p<0.05 represented="" a="" significant="">