Dio 1:Cistanoside of Cistanche Herba ublažava reproduktivna oštećenja muškaraca izazvana hipoksijom putem supresije oksidativnog stresa

Više informacija kontaktirajte: Tinatina.xiang@wecistanche.com

Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, He Wang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1

1Odjel za urologiju, bolnica Tang Du, Četvrti vojni medicinski univerzitet, Xi'an 710038, Shaanxi, Kina;

2Urološka i nefrološka bolnica, Xi'an People's Hospital, Xian 710100, Shaanxi, Kina;

3Institut za osnovne medicinske nauke, Četvrti vojnomedicinski univerzitet, Xi'an 710032, Shaanxi, Kina;

4Odjel za radioterapiju, bolnica Tang Du, Četvrti vojni medicinski univerzitet, Xi'an 710038, Shaanxi, Kina. *Jednaki doprinosioci. Primljeno 1. septembra 2020.;

Prihvaćeno 18. januara 2021.; Epub 15. maja 2021.; Objavljeno 30. maja 2021

Abstract: Sve veći broj dokaza pokazuje da je hipoksija uzrokmuška neplodnost, a hipoksija može biti povezana saoksidativni stres(OS). Cistanozid (Cis) je jedinjenje feniletanoidnog glikozida iz kojeg se može ekstrahiratiCistanches Herbai ima različite biološke funkcije. Ova studija je imala za cilj da ispita zaštitne efekte Cis-a na reproduktivna oštećenja izazvana hipoksijom i istražiti specifične osnovne mehanizme. Konstruisani su eksperimentalni modeli hipoksije ćelija i životinja, a procenjeni su zaštitni efekti različitih podtipova Cis na reproduktivni sistem muškaraca in vitro i in vivo. Rezultati su pokazali da hipoksija značajno smanjuje održivost GC-1 ćelija kroz zaustavljanje ćelijskog ciklusa i aktivaciju apoptoze, što je povezano sa povećanim OS. Štaviše, Cis je pokazao snažne antioksidativne efekte i in vitro i in vivo, značajno obnavljajući aktivnosti antioksidativnih enzima i snižavajući nivoe reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) dok povećava vitalnost ćelija i smanjuje apoptozu. Važno je da su svi ovdje proučavani Cis podtipovi (Cis-A. Cis-B, Cis-C i Cis-H) pokazali određene antioksidativne efekte, među kojima su efekti Cis-B bili najznačajniji. Ova studija pokazuje da Cis značajno umanjuje štetne efekte OS izazvanog hipoksijom utičući na aktivnosti antioksidativnih enzima u testisima i GC-1 ćelijama.

Ključne riječi: Cistanozid, hipobarična hipoksija, muška neplodnost, oksidativni stres, reproduktivna zaštita

Uvod

Trenutno je oko 48,5 miliona (15 posto) parova reproduktivne dobi širom svijeta pogođeno neplodnošću [1], među kojima se 40-50 posto slučajeva pripisujemuška neplodnost[2], stanje koje je snažno povezano sa faktorima životne sredine i životnim stilom. Dokazi sugeriraju da je osjetljivost testisa sisara na nizak pritisak kisika uzročni faktor nekih oblikamuška neplodnost[3]. Kao što je pokazano u prethodnim studijama, spermatogeneza je oštećena i smanjena nakon izlaganjahipobarična hipoksija [4-7].

Kako bi se istražio osnovni mehanizam, studije su pokazale da je izloženosthipobarična hipoksijapovećava pro-

dukcija [8, 9].ROS igra važnu ulogu u muškom reproduktivnom sistemu. Na niskim nivoima, potrebni su za kapacitaciju sperme, akro-some reakciju i fuziju spermatozoida-0ocita [10]. Međutim, prekomjerni ROS može izazvati oštećenje nuklearne/mitohondrijske DNK sperme i plazma membraneperoksidativno oštećenje, koji su zauzvrat glavni etiološki faktori za povećani rizik od muške neplodnosti [11,12]. Stoga, akumulacija ROS-a izazvanog hipoksijom može biti jedan od uzroka muške neplodnosti.

Cistanches Herba, višegodišnja parazitska ljekovita biljka, široko je rasprostranjena u sušnim područjima [13] i široko se koristi zbog svojih farmakoloških aktivnosti [14-17]. Među svim efektivnim sadržajimaCistanches Herba, PhGs se smatraju glavnom aktivnom komponentom. Do danas su 34 PhG izolirana iz biljaka Cistanches [13]. Cistanozid (Cis), aktivni PhG izolovan iz Cistanches Herba, privukao je pažnju zbog svojih antioksidativnih efekata.

Uzimajući u obzir antioksidativne efekte Cis-a i ulogu ROS-a u hipoksiji izazvanojmuška neplodnost, Cis se smatra potencijalnim kandidatom za lijek za liječenje hipoksije izazvanemuška neplodnost. Međutim, nekoliko izvještaja bavilo se antioksidativnim djelovanjem Cis ekstrahiranog iz Cistanches Herba u liječenju hipoksije izazvanemuška neplodnostili uključeni signalni putevi. U ovoj studiji su konstruisani eksperimentalni modeli hipoksije in vitro i in vivo i procenjene komponente dejstva različitih Cis.

materijali i metode

Ćelijska kultura i reagens

Ćelijska linija mišje spermatogonije GC-1spg (GC-1) kupljena je od Američke kolekcije tipskih kultura (ATCC) i uzgajana u DMEM-u (Invitrogen, SAD) sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma, 1 posto L-glutamin (100 mM), penicilin (100 U/mL) i streptomicin (100 ug/mL) na 37 stepeni u vlažnom inkubatoru sa 5 posto CO, kupljen je Cis (Cis-A, B, C, H) iz Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Kina).

Test vitalnosti ćelija

Vijabilnost ćelija je testirana pomoću kompleta za brojanje ćelija{{0}} testa (CCK-8). Ukratko, GC-1 ćelije su posađene u 96-ploče sa 1,5×103 po jažici i kultivisane na 37 stepeni tokom 24 h. Zatim su ćelije tretirane različitim koncentracijama (20 posto, 15 posto, 10 posto, 5 posto) kisika ili različitim koncentracijama (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) Cis (Cis-A, Cis-B, Cis- C, Cis-H) za potrebno vrijeme. Zatim je supernatant odbačen, a vitalnost ćelija je otkrivena pomoću CCK-8 kompleta (Dojindo Japan). Apsorbancija svake jažice je izmjerena na 450 nm pomoću čitača mikroploča (BioRad USA). Konačno, vitalnost ćelija je izračunata prema sljedećoj formuli: Vijabilnost ćelije=(OD eksperimentalna grupa - ODblank grupa)/ (OD kontrolna grupa - ODblank grupa) × 100 procenata. Western blot analiza Sakupljene ćelije ili tkiva su homogenizovana u RIPA puferu za ekstrakciju proteina (RIPA Beyotime Kina; Cocktail Roche Švajcarska). Sakupljeni su supernatanti, a koncentracija proteina je testirana BCA metodom (Beyotime). Otprilike 40 ug ekstrahiranih proteina iz svakog uzorka odvojeno je pomoću SDS-PAGE i elektrotransferirano na nitroceluloznu (NC) filter membranu (Beyotime Kina). NC filter membrane su blokirane sa 5% nemasnog mlijeka 1,5 h i inkubirane sa specifičnim antitijelima (anti-PARP 1:1000, anti-Caspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti- Bax 1:1000, anti-GAPDH 1:1000; sva antitela su kupljena od Cell Signaling Technology, SAD) preko noći na 4 stepena. Zatim su sve NC membrane inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelom konjugovanim s peroksidazom rena 1,5 h na sobnoj temperaturi i snimljene pomoću sistema za snimanje (Tannon, Kina).

Detekcija ćelijskog ciklusa

Protočni citometrijski test (FCM) je izveden za analizu ćelijskog ciklusa. Ćelije su tretirane u različitim uslovima tokom 72 h i sakupljene. Ćelije su zatim isprane sa PBS, fiksirane u 75 posto etanola i obojene propidijum jodidom (PI). Za svaki uzorak, 1×104 ćelije su sakupljene i analizirane protočnom citometrijom (FACS Calibur, BD Biosciences). Zatim je izračunat udio ćelija G1/S/G2 faze i indeks proliferacije [Faza(S plus G2)/Faza(G1 plus S plus G2) × 100 posto].

Ki-67 bojenje

Ćelije su uzgajane u konfokalnoj posudi i tretirane hipoksijom ili različitim podtipovima Cis-a tokom 72 h. Nakon fiksiranja svih ćelija sa 4 posto paraformaldehida, one su inkubirane sa anti-Ki-67 antitijelom (1:200, Cell Signaling Technology). Zatim su sve ćelije inkubirane sa odgovarajućim CY-3-konjugiranim anti-zečjim IgG antitelom (1:200, Boster, Kina) i rastvorom DAPI (1,0 ug/mL, Beyotime). Fluorescencija je uočena konfokalnim mikroskopom Fluoview FV1000 (Olympus, Japan).

Detekcija ROS

FCM je uveden za mjerenje intracelularnih nivoa ROS pomoću DCFH-DA. Suspendirane ćelije su posađene u 6-ploče sa bunarima i podvrgnute različitim tretmanima. Nakon 72 h tretmana, ćelije su suspendovane u DMEM bez seruma sa 10 μM DCFH-DA (Beyotime). Sadržaj ROS je zatim određen sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom na Beckman Coulter Flow Cytometry sistemu sa talasnom dužinom ekscitacije od 488 nm i talasnom dužinom emisije od 525 nm [18].

Određivanje lipidne peroksidacije (LPO)

Test reaktivnih supstanci s tiobarbiturnom kiselinom (TBARS) je izveden da bi se otkrio LPO. Svi operativni koraci izvedeni su u skladu sa uputstvima (Sigma USA). Koncentracije su izračunate korištenjem koeficijenta molarne ekstinkcije od 1,56×105/(M-cm), koji je dobiven korištenjem malondialdehida kao standarda. Rezultati su izraženi kao nmol MDA ekvivalenata/mg proteina.

Određivanje aktivnosti enzima

Aktivnosti enzima su testirane korištenjem kompleta za analizu uključujući glutation reduktazu (GR), glutation peroksidazu (GPx) i superoksid dismutazu (SOD). Svi operativni koraci su izvedeni u skladu sa priloženim uputstvima (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute China).

Životinje i eksperimentalni protokol

Zreli mužjaci pacova Wistar (180-220 g, 8 w stari) su dobijeni iz centra za životinje Četvrtog vojnog medicinskog univerziteta, Xi'an, Kina. Dozvola za korištenje životinja dobijena je od Etičkog odbora Univerziteta (poziv na broj: 20190506). Eksperiment na životinjama izveden je prema sveučilišnim smjernicama za njegu i korištenje laboratorijskih životinja.

Svim pacovima je dozvoljeno da se prilagode otprilike 1 sedmicu prije početka eksperimenta. Nakon aklimatizacije, pacovi su nasumično raspoređeni u 6 grupa sa po 5 životinja u svakoj grupi. Pacovi u kontrolnoj grupi su uzgajani pod normalnim pritiskom (PO.:20 posto; vazdušni pritisak: 101,3 kPa), dok su pacovi u modelu i grupama tretiranim Cis odgajani u komori za kiseonik niskog pritiska (unutrašnji pritisak od 61,6 kPa). , što odgovara visini od 4000 metara nadmorske visine; PO:14,55 posto) za simulaciju hipoksičnog okruženja na velikoj nadmorskoj visini. Svi pacovi su imali slobodan pristup hrani i vodi u plastičnim kavezima na 22 ±2 stepena i uslovima vlažnosti sa automatskim ciklusom 12-h svjetlo/mrak. Pacovi u modelu i grupama tretiranim Cis-om ostali su u hipobaričnim uslovima, ali su prebačeni u normobarične uslove svakih 96 h, pri čemu im je davana hrana i voda, a kavezi očišćeni. Trajanje prijelaza iz hipobarične u hipobarično je bilo približno 2 h. Sve tretirane grupe su tretirane odgovarajućim Cis-om (8 mg/kg/d) putem oralne sonde tokom 8 nedelja, dok su kontrolni i model pacovi tretirani jednakom količinom vode.

Nakon 8 sedmica, pacovi su žrtvovani pod anestezijom. Testisi, epididimis i sjemeni mjehurići su odvojeni i izvagani, a indeks organa izračunat je prema sljedećoj formuli: (težina organa/težina životinje)

t) ×100 posto . Nakon toga, prikupljeni su spermatozoidi u epididimisu, te je ispitana njihova pokretljivost i aktivnost enzima akrozoma. Slično, sakupljena su tkiva testisa za histopatološke studije i detekciju ROS, LPO i antioksidativnih enzima.

Procjena količine žive sperme

Hirurškim makazama je zarezan epididimis, a suspenzija sperme je pripremljena u normalnom fiziološkom rastvoru. Da bi se procijenila količina živih spermatozoida, 5 uL suspenzije sperme pažljivo je pomiješano sa jednakom količinom boje eozina-Y. Spermatozoidi su zatim izbrojani pod svjetlosnim mikroskopom. Stope živih spermatozoida procijenjene su izračunavanjem obojene (mrtve sperme) i neobojene sperme (živa sperma).

Određivanje aktivnosti enzima akrozoma sperme

Test aktivnosti enzima akrozoma sperme korišten je za procjenu enzima akrozoma sperme [19]. Rezultati u svakoj grupi su izračunati korištenjem sljedeće formule: Aktivnost enzima akrozoma (μIU)=(ODExperiment grupa - ODBlank grupa)/(247,5×10) × 106.

Statistička analiza

Svi kvantitativni podaci izraženi su kao srednja vrijednost ± SD i analizirani su pomoću softvera SPSS 22.0. Za poređenje podataka između dvije grupe korišten je nezavisni Studentov t-test. „P<0.05>< 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">

Rezultati

Efekti hipoksije na GC-1 ćelije

Da bismo utvrdili efekte hipoksije na zametne stanice, prvo smo ispitali promjene u vitalnosti stanica nakon tretmana hipoksije različitim koncentracijama kisika (20 posto, 15 posto, 10 posto, 5 posto) tokom 1, 3, 5 i 7 dana. , odnosno. Rezultati CCK-8 analize su pokazali da, u poređenju sa kontrolnom grupom (20 posto koncentracije kiseonika), ćelije izložene hipoksiji pokazuju značajno smanjenje vitalnosti (P<0.01; figure="" 1a).="" moreover,="" their="" survival="" rate="" was="" inversely="" proportional="" to="" the="" oxygen="" concentration="" and="" further="" decreased="" with="" induction="" time.="" to="" avoid="" an="" excessive="" cytotoxic="" effect,="" a="" 10%="" oxygen="" concentration="" and="" 3-day="" induction="" time="" were="" selected="" as="" the="" hypoxic="" model="" criteria="" for="" subsequent="" in="" vitro="">

Nakon toga, izvršeno je FCM i imunofluorescentno bojenje kako bi se dalje procijenila proliferacijska promjena GC-1 ćelija pod tretmanom hipoksije. Rezultati su pokazali da hipoksija može izazvati zaustavljanje GC-1 ćelija u G1 fazi, čime se smanjuje ulazak ćelije u S fazu i inhibira replikacija DNK. Dakle, hipoksija je značajno smanjila indeks proliferacije GC-1 ćelija (P<0.01; figure="" 1b).="" positive="" ki-67="" staining="" is="" another="" specific="" biomarker="" of="" proliferating="" cells.="" therefore,="" we="" also="" examined="" the="" ratio="" of="" ki-67-positive="" cells="" with="" or="" without="" hypoxia="" treatment.="" compared="" with="" the="" control="" group,="" hypoxia="" treatment="" remarkably="" reduced="" ki-67-positive="" cells,="" as="" shown="" in="" figure="">

Zatim smo imali za cilj da istražimo način inhibicije vitalnosti GC-1 ćelija izazvane hipoksijom. Kao što je objavljeno u literaturi, nivo ROS se povećavao kako su pacovi bili izloženi hipobaričnoj hipoksičnoj sredini [8,20]. Stoga su endogeni nivoi ROS u GC-1 ćelijama izmjereni pomoću FCM testa. Rezultati su pokazali viši nivo ROS-a pod hipoksijom u odnosu na normalnu grupu kiseonika (P< 0.01;="" figure="" 1d).="" accumulated="" ros="" cause="" marked="" dna="" impairment,="" which="" in="" turn="" causes="" cell="" apoptosis="" pathway="" activation="" and="" might="" be="" the="" major="" etiological="" factor="" for="" the="" increased="" risk="" of="" male="" infertility="" [21,22].="" next,="" we="" detected="" the="" apoptotic="" activation="" effect="" of="" hypoxia="" on="" gc-1="" cells="" by="" tunelstaining.="" as="" shown="" in="" figure="" 1e,="" treatment="" with="" hypoxia="" resulted="" in="" an="" increase="" in="" tunel="" fluorescence="" compared="" with="" the="" control="" group,="" indicating="" an="" increase="" in="" apoptosis="" in="" the="" model="">

Budući da ROS-indukovano oštećenje ćelija obično uzrokuje OS, dalje smo testirali OS GC-1 ćelija. Kao što je prikazano na slici 1F, nivoi LPO ćelija GC-1 u grupi modela su bili izrazito

povećan u poređenju sa nivoima LPO ćelija GC-1 u kontrolnoj grupi. Ovi nalazi sugeriraju da bi ozljeda GC-1 ćelija uzrokovana hipoksijom mogla biti povezana s OS, koji je izazvan akumulacijom ROS.

Efekti Cis-a na vitalnost GC-1 ćelija izazvane hipoksijom in vitro.

Da bi se ispitalo može li Cis spriječiti inhibitorne efekte hipoksije na vitalnost GC{{0}} ćelija, izvršena je CCK-8 analiza. GC-1 ćelije su tretirane različitim podtipovima (Cis-A, B, C, H) i rasponima koncentracije (0.02 μM, 0,2 μM, 2 μM) Cis tokom 72 h. Poređenje grupa modela sa DMSO grupom je pokazala da DMSO nije direktno promovirao vitalnost GC-1 ćelija (Slika 2A). Međutim, vitalnost ćelija je značajno obnovljena (P< 0.05)="" with="" cis="" treatments.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" cis-a,="" cis-b,="" cis-c,="" and="" cis-h="" all="" showed="" certain="" protective="" effects="" on="" hypoxia-induced="" damage="" to="" gc-1="" cell="" viability,="" and="" cis-b="" showed="" the="" most="" significant="" effect(figure="" 2a).="" the="" protective="" effects="" of="" cis="" at="" 0.2="" μm="" were="" significantly="" higher="" than="" the="" protective="" effects="" of="" cis="" at="" 0.02="" μm,="" while="" the="" difference="" between="" 2="" μm="" and="" 0.2="" um="" was="" not="" obvious,="" indicating="" that="" the="" restored="" gc-1="" cell="" viability="" induced="" by="" cis="" demonstrated="" a="" dose-dependent="" increase="" in="" the="" concentration="" range="" from="" 0.02-0.2="" μm="" （figure="" 2a）.="" therefore,="" according="" to="" the="" experimental="" needs,="" 0.2="" m="" cis="" was="" selected="" as="" the="" optimal="" concentration="" in="" the="" following="" in="" vitro="" experiments.="" to="" further="" confirm="" whether="" germ="" cells="" were="" indeed="" protected="" by="" cis,="" fcm,="" and="" ki-67="" staining="" were="" performed="" to="" assess="" the="" alteration="" of="" the="" proliferation="" of="" gc-1="" cells="" after="" treatment="" with="" cis.="" upon="" cis="" treatment,="" the="" proportion="" of="" gc-1="" cells="" in="" the="" g1="" phase="" was="" reduced.="" in="" contrast,="" more="" cells="" entered="" s-phase,="" suggesting="" that="" cis-treatment="" could="" increase="" the="" germ="" cell="" proliferation=""><0.01; figure="" 2b).="" the="" statistics="" for="" the="" gc-1="" cell="" cycle="" are="" shown="" in="" figure="" 2bb.="" the="" ki-67="" staining="" results="" also="" showed="" that="" cis-a,="" cis-b,="" cis-cand="" cis-h="" treatment="" significantly="" improved="" the="" ki-67-positive="" cell="" ratio="" of="" hypoxia-induced="" gc-1="" cells="" in="" vitro(figure="">

Mehanizam Cis-a štiti zametne ćelije od hipoksije in vitro.

Da bi se istražilo da li su zaštitni efekti Cis-a na GC-1 ćelije povezani sa uklanjanjem prekomjernog ROS-a, fluorescentna boja DCFH-DA je korištena za otkrivanje nivoa ROS-a u svakoj grupi. Kao što je prikazano na slikama 3A, 3B, tretman sa DMSO nije promenio intracelularni sadržaj ROS ili nivo LPO u poređenju sa modelnom grupom. Međutim, nivoi ROS-a u GC-1 ćelijama su značajno smanjeni u grupama koje su tretirane Cis (Slika 3A). Nadalje, smanjenje LPO je također uočeno u GC-1 ćelijama podvrgnutim Cis-u (slika 3B).

Da bi se dalje istražio mehanizam kojim Cis štiti zametne stanice od hipoksične ozljede, TUNEL bojenje i Western blot analize su obavljene za procjenu apoptoze. TUNEL bojenje (slika 3C) pokazalo je značajnu apoptozu u modelu i DMSO grupama. Međutim, uočeno je manje apoptotičkih ćelija kod tretmana Cis-om, što je ukazalo na to da liječenje Cis-om smanjuje apoptozu GC-1 ćelija. Dodatno, izmjerena je ekspresija PARP, kaspaze-3, Baxa i Bcl-2 da bi se potvrdio molekularni mehanizam. Kao što je prikazano na slici 3D, kaspaza-3 i PARP su aktivirani u GC-1 ćelijama pod hipoksijom, a ova aktivacija je inhibirana Cis tretmanom. Osim toga, omjer Bax/Bcl-2 bio je veći u modelnoj grupi nego u kontrolnoj grupi, a Cis tretman je smanjio omjer Bax/Bcl-2 (slika 3D). Ovi podaci ukazuju da Cis ima potencijalni kapacitet da ublaži oštećenje oksidansa izazvano hipoksijom, a ovaj zaštitni efekat se može postići smanjenjem akumulacije ROS i inhibiranjem aktivacije puta apoptoze povezane s kaspazom.

Enzimski mehanizam koji inhibira OS uključuje hvatače slobodnih radikala kao što su glutation reduktaza (GR), glutation peroksidaza (GPx) i superoksid dismutaza (SOD)[23]. Enzimski mehanizam koji inhibira OS igra bitnu ulogu u prevencijioksidativno oštećenjeu ćelijama i tkivima [23]. Da bi se dalje potvrdio potencijalni mehanizam Cis inhibicije OS izazvanog hipoksijom u GC-1 ćelijama, mjerene su aktivnosti GR, GPx i SOD. Rezultati su otkrili da su se aktivnosti GR, GPx i SOD značajno (P < 0.01,="" slika="" 3e)="" smanjile="" pod="" hipoksijom="" u="" poređenju="" sa="" kontrolnim="" grupama,="" a="" cis="" tretman="" je="" značajno="" obnovio="" njihove="" aktivnosti="" u="" gc{{6}="" }="" ćelije="" izložene="" hipoksiji="">< 0.05,="" figure="" 3e),="" suggesting="" that="" these="" compounds="" could="" activate="" the="" powerful="" endogenous="" antioxidant="">

Kliknite na link ispod da biste dobili informacije o 2. dijelu
https://www.xjcistanche.com/news/part2-cistanoside-of-cistanche-herba-ameliorat-54370494.html