Dio Ⅰ Adjuvantna vrijednost Herba Cistanches kada se koristi u kombinaciji sa statinom na mišjim modelima

Elaine Wat, Chun Fai Ng, Chi Man Koon, Cheng Zhang, Si Gao, Brian Tomlinson i Clara Bik San Lau

1 Institut za kinesku medicinu, Kineski univerzitet u Hong Kongu, Shatin, Nove teritorije, Hong Kong.

2 Državna ključna laboratorija za fitohemiju i biljne resurse u Zapadnoj Kini, Kineski univerzitet u Hong Kongu, Shatin, Nove teritorije, Hong Kong.

3 Odjel za kliničku farmakologiju, Odsjek za medicinu i terapiju, Kineski univerzitet u Hong Kongu, Shatin, Nove teritorije, Hong Kong. Elaine Wat i Chun Fai Ng podjednako su doprinijele ovom radu. Prepisku i zahtjeve za materijale treba uputiti na CBSL (e-mail: claralau@cuhk.edu.hk)

Za više informacija: emily.li@wecistanche.com

Kliknite ovdje da biste dobili više informacija o Cistancheu

Abstract

Poznato je da statini imaju probleme sa mišićnom toksičnošću.HerbaCistanches(HC) je kineska biljka koja se tradicionalno koristi za bolove u slabinama i kolenima. Naša prethodna in vitro studija sugerirala je da može zaštititi od mišićne toksičnosti izazvane statinima. Međutim, in vivo zaštitni učinak nikada nije istražen. Cilj ovog istraživanja bio je utvrditi da li vodeni ekstrakt odHerbaCistanche(HCE) može spriječiti toksičnost mišića izazvanu simvastatinom kod štakora i može li Herba Cistanche E također imati blagotvorne učinke na smanjenje hiperholesterolemije izazvane dijetom s visokim udjelom masti i povišenog kolesterola u jetri, čime se smanjuje doza simvastatina kada se koristi u kombiniranoj terapiji. Prema našim rezultatima, Herba Cistanche E je značajno obnovila smanjenje mišićne težine izazvano simvastatinom i smanjilo povišenu plazma kreatin kinazu kod pacova.HerbaCistancheE je također poboljšao smanjenje nivoa mišićnog glutationa uzrokovano simvastatinom, potencijal mišićne mitohondrijalne membrane i smanjio upalu mišića izazvanu simvastatinom. Nadalje, HCE bi mogao smanjiti težinu jetre, ukupne nivoe lipida u jetri i nivoe lipida u plazmi kod miševa hranjenih puno masti. U zaključku, naša studija je pružila in vivo dokaze daHerba CistancheE ima potencijalne zaštitne efekte na toksičnost izazvanu simvastatinom u mišićima, kao i povoljan učinak na dijetom izazvanu nealkoholnu masnu jetru i hiperlipidemiju kada se koristi sam ili u kombinaciji sa simvastatinom u smanjenoj dozi.

Inhibitori HMG-CoA reduktaze, takođe poznati kao statini, dobro su dokumentovani kao korisni za pacijente sa hiperholesterolemijom sa umerenim i visokim rizikom od kardiovaskularnih bolesti1. Statini, jedna od najprodavanijih klasa lijekova na recept u svijetu, djeluju tako što inhibiraju redukciju HMG-CoA u mevalonsku kiselinu tokom rane faze mevalonatnog puta kako bi smanjili endogenu sintezu kolesterola2, 3. Iako se statini obično dobro podnose , jedan od najvažnijih i dobro poznatih kliničkih nuspojava su abnormalnosti skeletnih mišića, koje mogu varirati od benigne mijalgije do teške miopatije4, 5. U velikom istraživanju na 10.409 francuskih subjekata obavljenom putem telefonskog intervjua, 10 posto pacijenata prima liječenje statinima prijavilo je mišićne simptome, od kojih je 30 posto ovih simptomatskih pacijenata rezultiralo prekidom liječenja6. Radna grupa za sigurnost statina Nacionalnog udruženja za lipide dala je preporuke za liječenje simptoma povezanih s mišićima kod pacijenata koji su podvrgnuti terapiji statinima. Općenito, savjetuje se da se kod pacijenata s teškim simptomima kao što je povišena kreatin kinaza (CK) više od 5×GGN, statine obustave, sve dok se nivo CK ponovo ne normalizuje5. Zbog pojave ovih nuspojava i činjenice da ne postoji efikasan tretman za mišićnu toksičnost izazvanu statinima, stoga postoji potreba za traženjem novih terapija za upravljanje mišićnim problemima izazvanim statinima.

Dok se predlaže niz mehanizama koji bi mogli biti odgovorni za štetne efekte statina, vjeruje se da su mitohondrijski mehanizmi uključeni u štetne efekte statina na mišićnu toksičnost. Mevalonat nije samo prekursor holesterola, već je i prekursor važnih jedinjenja, kao što su selenoproteini, dolihol i ubikinon7, 8. Statin može smanjiti nivo selenoproteina kao što je glutation peroksidaza (GPx), ugrožavajući gustinu antioksidansa i doprinoseći njegovom štetnom uticaju. efekti4. Statini također mogu dovesti do iscrpljivanja ubikinona, uzrokujući smanjenu potrošnju kisika i sintezu ATP-a9. Nadalje, sve veće in vitro i in vivo studije pokazale su da statin također može djelovati direktno na mitohondrije tkiva uzrokujući povećane reaktivne vrste kisika (ROS) i mitohondrijski oksidativni stres, što dovodi do smrti stanica i stoga doprinosi ozljedama jetre i mišića10, 11.

HerbaCistanches, cijela osušena biljkaCistanchedeserticolaYC Ma (porodica Orobanchaceae), su parazitske biljke koje pretežno rastu u pustinjskim područjima sjeverne i sjeveroistočne Kine12. Prema teoriji kineske medicine, Herba Cistanches ima ukus slatkog, toplog i slanog13. To je kineska tonik biljka koja osnažuje Yang koja se prvenstveno koristi za liječenje nedostatka bubrega sa simptomima kao što su impotencija, neplodnost, prerana ejakulacija. To je također kineska biljka koja se tradicionalno prepisuje pacijentima za bolove u slabinama i kolenima i obično se koristi u kineskim formulacijama za liječenje mišićnih problema12, 14. Zanimljivo, ovo je također u skladu sa savremenim naučnim studijama koje su pokazale anti -aktivnosti zamora ekstrakta Herba Cistanches bogatog polisaharidima i feniletanoidima kod pacova nakon vježbanja smanjujući oštećenje mišića i poboljšavajući skladištenje ATP-a15. Osim toga, nedavni rad je pokazao da metanolni ekstrakt Herba Cistanches može poboljšati stvaranje mitohondrijalnog ATP-a16.HerbaCistanchesje također dokazano da je snažan antioksidans i hvatač slobodnih radikala u različitim organima, smanjujući oksidativni stres i aktivnosti ROS in vivo studije17, 18. U nedavnoj studiji koju je provela naša laboratorija, pokazali smo da našeHerbaCistanchesvodeni ekstrakt značajno je spriječio toksičnost izazvanu simvastatinom u ćelijama skeletnih mišića L6, kao i dozno-ovisno obnovljeno smanjenje proizvodnje ATP-a u L6 stanicama uzrokovano simvastatinom, što ukazuje na potencijalHerbaCistanchesvodeni ekstrakt u zaštiti od mišićne toksičnosti izazvane statinima19. Ipak, nedostaju in vivo dokazi.

Stoga smo to pretpostaviliHerbaCistanchesvodeni ekstrakt (HCE) mogao bi imati povoljan učinak na mišićnu toksičnost izazvanu simvastatinom. Stoga je ova studija imala za cilj utvrditi može li upotreba HCE-a smanjiti toksičnost mišića izazvanu simvastatinom koristeći in vivo životinjski model, i osim toga, može li HCE također imati blagotvorne učinke na smanjenje hiperholesterolemije izazvane ishranom bogatom mastima i povišenog holesterola u jetri. , čime se smanjuje doza korišćenog simvastatina.

Materijali i metode

Provjera autentičnosti i ekstrakcija biljnih materijala.

Sirovi biljni materijal odHerbaCistanches(Cistanche deserticola, poreklom iz Unutrašnje Mongolije) je kupljen od Zi Xin, renomiranog dobavljača u Guangdžouu, Kina. Herba Cistanches je hemijski potvrđena pomoću tankoslojne hromatografije i tečne hromatografije ultra-performanse u skladu sa Kineskom farmakopejom 201013 kao što je prethodno opisano19, saverbascosideiechinacoside(kupljeno od Nacionalnog instituta za kontrolu farmaceutskih i bioloških proizvoda, Kina) kao hemijski markeri. Nakon hemijske autentifikacije, uzorak herbarskog vaučeraHerbaCistanchesdeponovan je u Muzeju Instituta kineske medicine na Kineskom univerzitetu u Hong Kongu, sa uzorkom vaučera broj 2014-3434.

HerbaCistanchesvodeni ekstrakt je pripremljen kako je prethodno opisano19. Ukratko, 1 kg sirove biljke je natopljeno 1 sat, nakon čega je dva puta ekstrahirana grijanjem 1 sat pod refluksom na 100 stepeni koristeći 10x destilovanu vodu. Vodeni ekstrakti (HCE) su zatim kombinovani i filtrirani, a filtrat je koncentrisan pod sniženim pritiskom na 60 stepeni. Koncentrirani ekstrakt je liofiliziran do suhog. Postotak prinosa bio je 50,1 posto w/w. Sav ekstrahovani prah je vakuumiran i čuvan do upotrebe.

Eksperimentalne životinje.

Simvastatin je nabavljen od SR Pharmasolutions Ltd. Mužjaci pacova Sprague Dawley (180–200 g) i mužjaci C57Bl/6J miševa (stari 8- sedmica) isporučeni su od Laboratory Animal Services Centre, Kineskog univerziteta u Hong Kongu. Eksperimente na životinjama odobrio je Etički komitet za eksperimentisanje na životinjama Kineskog univerziteta u Hong Kongu (Ref. br. 12/074/MIS). Sve eksperimentalne metode su provedene prema odobrenim smjernicama koje je odredio Etički komitet za eksperimentiranje na životinjama Kineskog univerziteta u Hong Kongu. Svi pacovi (3 životinje po kavezu) i miševi (5 životinja po kavezu) smješteni su u normalne standardne kaveze na konstantnoj temperaturi od 21 stepen sa ciklusom 12-h svjetlo-tamno. Svaki standardni kavez sadržavao je jasiku kao podlogu. Svim životinjama je dozvoljen ad libitum pristup hrani i vodi.

Studija mišićne toksičnosti izazvane statinima kod štakora.

Svi pacovi su nasumično podijeljeni u 5 grupa (n=5–10). Sve životinje su bile na normalnoj prehrani. Takođe su dobijali destilovanu vodu ili simvastatin dnevno, sa ili bez HCE tretmana intragastrično. Za životinje kojima je potrebno davati i simvastatin i HCE, HCE je davan 3 sata nakon primjene simvastatina kako bi se spriječila bilo kakva direktna hemijska interakcija biljke i lijeka. Biljni ekstrakt ili simvastatin je otopljen u 0,5 posto metilceluloze u destilovanoj vodi u poznatoj koncentraciji. Unaprijed izračunati volumen je davan intragastrično svakoj životinji prema težini pojedinca, tako da je izračunata zapremina sadržavala količinu potrebne predložene doze. Detalji ovih grupa su sljedeći:

Grupa a) Normalna ishrana sa jelom plus destilovana voda (normalna kontrolna grupa)

Grupa b) Dijeta sa normalnom hranom plus simvastatin (640mg/kg)

Grupa c) Dijeta sa normalnom hranom plus simvastatin (640 mg/kg) plus niska doza HCE (1,1 g/kg životinje)

Grupa d) Dijeta sa normalnom hranom plus simvastatin (640 mg/kg) plus visoka doza HCE (2,2 g/kg životinje)

Grupa e) Dijeta sa normalnom hranom plus visoka doza HCE (2,2 g/kg životinje)

Unos hrane se bilježio dnevno, a tjelesna težina je mjerena dva puta sedmično. Liječenje je trajalo 4 sedmice. Nakon toga životinje su anestezirane mješavinom ketamina (100 mg/kg) i ksilazina (10 mg/kg) intraperitonealno. Krv je uzeta punkcijom srca i ostavljena da se zgruša. Plazma je zatim odvojena centrifugiranjem (3,000 o/min tokom 10 minuta). Različiti mišići (kvadriceps, gastrocnemius, soleus, tibialis anterior i ekstenzor digitorumlongus) su izrezani i pohranjeni na -80 stepeni do analize.

Mjerenje kreatin kinaze u plazmi. Aktivnost plazma kreatin kinaze (CK) određena je korištenjem Stanbio CK Liqui-UV® kita (2910-430, Stanbio Laboratory, SAD) prema uputama proizvođača.

Mjerenje mišićne glutation peroksidaze. Mišićna glutation peroksidaza (GPx) je izmjerena korištenjem komercijalno dostupnog kompleta (703102, Cayman Chemical, USA) prema uputama proizvođača. Ukratko, mišićna tkiva su isprana PBS-om na pH 7,4 da bi se uklonila sva crvena krvna zrnca i homogenizirana u 5-10 ml hladnog pufera za lizu, nakon čega je homogenat centrifugiran na 10,000 g 15 minuta na 4 stepena. Supernatant je zatim uklonjen i testiran na GPx aktivnost koristeći komercijalni komplet.

Priprema mitohondrijske i citosolne frakcije mišića. Mitohondrijalne i citosolne frakcije iz mišićnih uzoraka pripremljene su korištenjem kompleta za izolaciju mitohondrija (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, USA) prema uputama proizvođača. Ukratko, svježi uzorci mišića prethodno su tretirani ekstrakcijskim puterom, izrezani na male komadiće i homogenizirani u puferu za ekstrakciju. Homogenati tkiva su zatim centrifugirani. Supernatant je sakupljen i rezervisan za analizu citosolne frakcije. Pelete mitohondrija su zatim isprane i ponovo centrifugirane i korištene za analizu mitohondrijske frakcije.

Mjerenje mišićnih mitohondrijalnih vrsta reaktivnog kisika (ROS). ROS je mjeren protokolom modificiranim iz prethodne literature20. Ukratko, ROS je mjeren iz mitohondrijalne frakcije (50 µg proteina/ml) korištenjem DCFDA otopine (C6827, Invitrogen, SAD). Smjesa je inkubirana na 37 stepeni 10 minuta u mraku, nakon čega je inkubirana sa rastvorom supstrata (10 mM piruvat, 15 mM malat) za fotoaktivaciju. Intenzitet fluorescencije je mjeren svakih 5 minuta tokom 60 minuta pomoću BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader na 485 nm ekscitacije i 520 nm emisije. Intenzitet fluorescencije izračunat je za mjerenje stvaranja ROS.

Potencijal mišićne mitohondrijske membrane. Potencijal mitohondrijske membrane mitohondrijske frakcije iz mišićnih uzoraka određen je prema protokolu proizvođača (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, USA). Ova procedura je test fiksne tačke kojim se mjeri unos JC-1 sa formiranjem J-agregata. Ukratko, mitohondrijalna suspenzija je razrijeđena da sadrži 20 µg proteina i inkubirana je sa JC-1 bojom 7 minuta na sobnoj temperaturi. Ova 7- minuta je vrijeme optimizovano i potvrđeno od strane proizvođača korištenjem različitih jedinjenja (kao što je navedeno u protokolu proizvođača) jer će uočena fluorescencija otopine porasti na plato nakon 5-10 minuta, nakon čega slijedi drastičan pad fluorescenciju JC-1 zbog izjednačavanja koncentracija JC{11}} unutar i izvan mitohondrijalnog matriksa. Intenzitet fluorescencije je mjeren BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader pri 490nm ekscitaciji i 590nm emisiji. Za mjerenje gradijenata potencijala izračunati su intenziteti fluorescencije.

Histologija mišića i procjena upale. Imunohistohemija inflamatornih ćelija unutar mišića procenjena je bojenjem CD68 i CD163 kao što je prethodno opisano21-23. Isečeni su parafinski preseci od 5 μm, prilepljeni na Superfrost™ Plus stakalce (Menzel-Gläser, Nemačka). Primarna mišja anti-pacovska CD68, ED1 i CD163 antitela, ED2, (Bio-Rad, SAD) su primenjena na sekcije u razblaženju 1:100. Specifično bojenje je detektirano pomoću EnVision™ Systems (Dako, Danska), koristeći sekundarno antitelo, EnVision-HRP polimer-konjugovani antimišji IgG u razblaženju od 1:200, i detektovan korišćenjem DAB rastvora (Dako, Danska), nakon čega je usledilo suprotnim bojenjem hematoksilinom. Sekcije su zatim montirane u dibutil-ftalat u histonu (DPX). Prisustvo neutrofila u mišićima detektovano je kvantitativnom imunohistohemijom pomoću softvera ImageJ.

Analiza ekspresije mišićnih gena. PCR test koji profiliše gene povezane s oksidativnim stresom izveden je korištenjem PCR nizova Rat Oxidative Stress and Antioxidant Defense (PARN-065Z, SABiosciences, Frederick, USA). PCR niz je izveden prema uputama proizvođača. Ukratko, ukupna RNK je izolirana selektivnim vezivanjem za membranu baziranu na silika gelu nakon lize i homogenizacije mišićnih uzoraka u denaturirajućem gvanidin tiocijanatnom puferu (RNeasy kit, Qiagen). RNK je reverzno transkribovana u cDNK koristeći RT2 First Strand Kit (SABiosciences, Frederick, SAD). Ova cDNK je zatim dodata u RT2 SYBR Green qPCR Master Mix (SABiosciences, Frederick, SAD). Zatim, svaki uzorak je alikvotan na PCR nizovima Rat Oxidative Stress and Antioxidant Defense (SABiosciences, Frederick, USA). Svi koraci su izvedeni prema protokolu proizvođača.

Studija hiperlipidemije i steatoze jetre kod miševa izazvane dijetom s visokim udjelom masti.

Svi miševi su nasumično podijeljeni u 5 grupa (n=8–10) i dobili su sljedeće: Grupa a) Normalna ishrana (Tabela 1); Grupe b do e) Ishrana sa visokim sadržajem masti (sadrži 21 procenat masti i 0.15 procenata holesterola) (tabela 2). Dijeta je davana 8 sedmica za životinje da izazovu gojaznost. Nakon 8 sedmica, svim grupama koje su bile hranjene s visokim udjelom masti davana je destilovana voda, ili simvastatin dnevno, ili HCE tretman intragastrično, 3 sata nakon primjene simvastatina. Biljni ekstrakt ili simvastatin otopljen je u 0,5 posto metilceluloze (Sigma-Aldrich Corporation, SAD) u destilovanoj vodi u poznatoj koncentraciji. Unaprijed izračunati volumen je davan intragastrično svakoj životinji prema težini pojedinca, tako da je izračunata zapremina sadržavala količinu potrebne predložene doze. Detalji ovih grupa su sljedeći:

Grupa a) Dijeta sa normalnom hranom plus destilovana voda

Grupa b) Dijeta bogata mastima plus destilovana voda

Grupa c) Dijeta bogata mastima plus simvastatin (50 mg/kg)

Grupa d) Dijeta bogata mastima plus HCE (4,4 g/kg)

Grupa e) Dijeta s visokim udjelom masti plus simvastatin (25 mg/kg) plus HCE (4,4 g/kg)

Unos hrane se bilježio dnevno, a tjelesna težina je mjerena dva puta sedmično. Na kraju 16-sedmične studije, svi miševi su žrtvovani nakon 16-satnog gladovanja preko noći. Životinje su anestezirane mješavinom ketamina (100 mg/kg) i ksilazina (10 mg/kg) intraperitonealno. Krv je uzeta punkcijom srca i ostavljena da se zgruša. Plazma je odvojena centrifugiranjem (3,000 rpm tokom 10 minuta). Jetre su izrezane i pohranjene na -80 stepeni do analize.

Mjerenje lipida u plazmi i jetri.

Trigliceridi u plazmi, holesterol (11488872216 i 11489232216, Roche Diagnostics, Švajcarska), holesterol lipoproteina visoke gustine i holesterola niske gustine (L-tip HDL-C i L-tip LDL-C) koncentracije su bile merene od strane japanske industrije Wako Pure Chemicals. enzimske metode koje koriste komercijalno dostupan komplet prema uputama proizvođača. Aktivnost plazma kreatin kinaze (CK) određena je korištenjem Stanbio CK Liqui-UV® kita (2910-430, Stanbio Laboratory, SAD). Ukupni lipidi jetre određivani su gravimetrijski nakon ekstrakcije metodom Bligh i Dyer24. Pojedinačni lipidi jetre su kvantificirani enzimski (kao što je gore opisano) nakon solubilizacije u izopropanolu (Sigma-Aldrich, SAD)25.

Histopatologija jetre i procjena upale. Bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E bojenje). Odsjeci krpelja (5 μm) tkiva uklopljenog u parafin isječeni su mikrotomom i stavljeni na mikroskopska stakla SuperFrost Plus® (Thermo Scientific, SAD). Sekcije su podvrgnute H&E bojenju prema metodi Harris et al. 26 i montiran sa dibutil-ftalatom u histonu (DPX) (Sigma-Aldrich, SAD)25.

Mac-3 bojenje i kvantifikacija. Debeli delovi (5 μm) tkiva umetnutog u parafin isečeni su pomoću mikrotoma i stavljeni na mikroskopska stakla SuperFrost Plus® (Thermo Scientific, SAD). Izvršeno je uzimanje antigena, nakon čega je uslijedilo blokiranje blokom peroksidaze (Dako Cytomation, Danska). Primarno pročišćeno anti-mišje Mac{4}} antitijelo (BD Pharmingen, SAD) je primijenjeno na sekcije u razrjeđenju 1:50. Specifično bojenje je otkriveno pomoću EnVision™ sistema (Dako, Danska). Stakalca su inkubirana sa sekundarnim antitelom, EnVision-HRP polimer-konjugiranim anti-zečjim IgG u razblaženju od 1:200. Mac-3 je detektovan pomoću DAB rastvora (Dako, Danska) i obojen hematoksilinom. Sekcije su zatim montirane u DPX. Prisustvo makrofaga u jetri je detektovano kvantitativnom imunohistohemijom pomoću softvera ImageJ.

Statistička analiza. Razlike između tretiranih i kontrolnih grupa testirane su jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA), praćeno posthoc Bonferronijevim testom višestrukog poređenja. Sve statističke analize izvršene su korištenjem GraphPad Prism Version 6.0 (GraphPad, SAD). Verovatnoća p<0.05 would="" be="" considered="" statistically="">

Rezultati

Efekat odHerbaCistancheE o mišićnoj toksičnosti izazvanoj simvastatinom kod štakora. Mjerenje mišićne težine i kreatin kinaze u plazmi. Pet različitih tipova mišića (kvadriceps, gastrocnemius, soleus, tibialis anterior i extensor digitorum longus mišići) izolovano je od svih tretiranih pacova. Efekti različitih tretmana na težinu mišića prikazani su na slici 1a. Simvastatin (640 mg/kg) je izazvao značajno smanjenje težine na kvadriceps, gastrocnemius i tibialis anterior mišiće kod štakora, dok su ova smanjenja značajno obnovljena HCE na kvadriceps i gastrocnemius mišiće na način ovisan o dozi. IakoHerbaCistancheE je pokazao trend vraćanja težine prednjeg mišića tibialisa kod pacova tretiranih simvastatinom, nijedna od ovih grupa nije postigla statistički značaj. Nije uočen značajan efekat tretmana samo HCE na mišićnu masu u poređenju sa kontrolnim pacovima (slika 1a).

Slika 1b pokazuje efekte različitih tretmana na nivoe kreatin kinaze (CK) u plazmi kod pacova. Simvastatin je izazvao značajno povećanje aktivnosti kreatin kinaze kod štakora, koje je značajno smanjeno HCE zajedničkim tretmanima u obje doze. Takođe nije bilo značajnog efekta tretmana samo HCE na nivoe CK u poređenju sa kontrolnom grupom. Budući da se činilo da je gastrocnemius osjetljiv na liječenje simvastatinom i da je najveći mišić izoliran po masi, mi smo, stoga, odabrali ovaj mišić za daljnju analizu uključujući mjerenje mišićne glutation peroksidaze (GPx), mjerenje mitohondrijalnog MMP i ROS, te histologiju mišića i procjenu upale .

Mjerenje mišićne glutation peroksidaze (GPx). Izmjereni su nivoi mišićne glutation peroksidaze i prikazani na slici 2a. Primena simvastatina izazvala je trend smanjenja merenja mišićne glutation peroksidaze (GPx) kod pacova. Međutim, HCE je pokazao trend poboljšanja smanjenja mišićnog GPx izazvanog simvastatinom u obje doze od 1,1 g/kg i 2,2 g/kg. Takođe nije bilo značajnog efekta samog HCE tretmana na nivoe mišićnog GPx u poređenju sa normalnim kontrolnim pacovima.

Mjerenje potencijala mitohondrijske membrane (MMP) i ROS. Liječenje simvastatinom (640 mg/kg) izazvalo je značajno smanjenje MMP mišića (slika 2b). Ovo smanjenje je poboljšano u zavisnosti od doze kod štakora koji su primali istovremeni tretman HCE i simvastatina (slika 2b). S druge strane, zanimljivo je da je grupa koja je primala sam simvastatin imala značajno smanjene nivoe ROS u mitohondrijalnim mišićima u poređenju sa normalnom kontrolnom grupom (slika 2c). Međutim, HCE tretman dat pacovima tretiranim simvastatinom pokazao je trend ovisan o dozi za vraćanje nivoa mišićnog mitohondrijalnog ROS-a na normalan nivo. Takođe nije bilo značajnog efekta samog HCE tretmana kod pacova u poređenju sa normalnom kontrolnom grupom za merenje mitohondrijalnog MMP i ROS.

Histologija mišića i procjena upale. Gastrocnemius mišići pacova koji su tretirani različitim tretmanima su dalje histološki analizirani i reprezentativni obojeni preseci su prikazani na slici 3a. Životinje kontrolne grupe pokazale su histološke preseke normalnih mišića. Nasuprot tome, H&E sekcije životinja tretiranih simvastatinom otkrile su infiltraciju inflamatornih markera (žute strelice), koja je bila značajno smanjena u tim dijelovima mišića štakora datim kombinacijom simvastatina i HCE. Imunohistohemijske analize su takođe izvršene na prisustvo makrofaga CD68 i CD163 na slikama 4a i 5a, respektivno, sa kvantifikacijom odgovarajućih makrofaga prikazanim na slikama 4b i 5b. Imunohistohemijska analiza mišićnih sekcija otkrila je prisustvo makrofaga (CD68) kod pacova tretiranih simvastatinom (smeđa boja), koje je značajno smanjeno kod štakora koji su istovremeno tretirani HCE u obje doze (slika 4b). Također nije uočena značajna upala kod životinja tretiranih samo s HCE. Slično, imunohistohemijska analiza mišićnih sekcija otkrila je prisustvo CD163-pozitivnih makrofaga kod pacova tretiranih simvastatinom (smeđa obojenost), što je značajno smanjeno kod štakora uz pomoć HCE tretmana od 2,2 g/kg (slika 5b ). Također nije uočena značajna upala kod životinja tretiranih samo s HCE.

Analiza ekspresije mišićnih gena. Da bi se odredili efekti simvastatina i HCE na gene povezane sa oksidativnim stresom u mišićima, PCR test koji profiliše gene povezane sa oksidativnim stresom izveden je pomoću PCR nizova za oksidativni stres i antioksidativni stres kod pacova. Geni na koje je tretman simvastatinom značajno uticao su analizirani i predstavljeni na slici 6. Za profil ekspresije gena koji regulišu antioksidanse, pacovi tretirani simvastatinom (640 mg/kg) su povećali ekspresiju gena koji regulišu antioksidanse. Tese uključuje glutation peroksidaze (GPx), GPx1 i GPx7, i druge peroksidaze uključujući Serpinb1b i club (slika 6a). HCE u obje doze (1,1 ili 2,2 g/kg) smanjio je ova simvastatinom izazvana povećanja GPxs i drugih peroksidaza na normalne razine. S druge strane, samo liječenje HCE značajno je povećalo nivoe ekspresije GPx1. Što se tiče ekspresije gena koji regulišu metabolizam ROS, simvastatin je značajno inducirao ekspresiju drugih gena metabolizma superoksida, uključujući Cyba, Ncf1, Ncf2, Scd1 i Ucp2. Slično, HCE u obje doze značajno je smanjio ova povećanja (slika 6b). Nadalje, simvastatin je inducirao ekspresiju gena koji reaguju na oksidativni stres uključujući Apoe, Ccl5 i Txn1, dok su ove ekspresije značajno smanjene kod životinja koje su tretirane HCE u obje doze (slika 6c). S druge strane, simvastatin je izazvao značajno smanjenje ekspresije gena Txnip-a. Nije bilo značajnog efekta HCE na smanjenje ekspresije Txnip gena izazvano simvastatinom (slika 6c). Simvastatin je takođe pokazao značajno povećanje ekspresije gena koji regulišu transportere kiseonika, uključujući Slc38a1 i Vim. HCE ko-tretman smanjio je ekspresiju ovih gena u obje doze (slika 6d).

Efekti kombinovane upotrebe Simvastatina i HCE na unos hrane i tjelesnu težinu kod miševa. Slika 7a prikazuje dnevni unos hrane miševa za sve tretirane grupe. Ishrana bogata mastima izazvala je značajno povećanje dnevnog unosa hrane životinja u poređenju sa životinjama koje su hranjene hranom (p<0.001). there="" was="" however="" no="" significant="" effect="" of="" the="" herb="" or="" drug="" treatments="" among="" all="" high-fat-fed="" groups="" (fig.="">

Sedmično merenje telesne težine. Nakon 16 sedmica hranjenja s visokim udjelom masti, životinje hranjene HF značajno su dobile na težini od životinja koje su hranjene hranom (slika 7b). Međutim, nije bilo značajnog efekta između miševa hranjenih HF i svih grupa koje su primale tretman. Takođe nije bilo značajne razlike između miševa hranjenih HF koji su primali zajednički tretman simvastatinom i HCE u odnosu na miševe hranjene HF koji su primali samo HCE ili simvastatin (slika 7b).

Efekti kombinovane upotrebe simvastatina i HCE na hiperlipidemiju i steatozu jetre kod miševa. Mjerenje aktivnosti lipida u plazmi i kreatin kinaze. Nivoi lipida u plazmi svih miševa prikazani su na slici 8. U poređenju sa normalnim miševima hranjenim hranom, miševi hranjeni HF imali su značajno povišene nivoe ukupnog holesterola u plazmi (TC), koji su značajno smanjeni u svim tretiranim grupama (slika 8a) . Miševi hranjeni HF liječeni simvastatinom i HCE imali su značajno niži TC u plazmi u poređenju sa životinjama s HF koje su primale sam simvastatin ili HF životinjama koje su primale samo HCE (p<0.001 and=""><0.01, respectively)="" (fig.="" 8a).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" simvastatin="" alone="" treatment="" group,="" suggesting="" hce="" has="" comparable="" effects="" as="" simvastatin.="" besides,="" hf-fed="" mice="" also="" had="" significantly="" higher="" plasma="" triglyceride="" (tg)="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" a="" normal="" chow="" diet=""><0.05) (figure="" 8b).="" there="" was="" a="" trend="" for="" a="" reduction="" in="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" on="" plasma="" tg="" in="" hf-fed="" animals,="" though="" this="" did="" not="" reach="" statistical="" significance.="" however,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" significantly="" reduced="" plasma="" tg="" compared="" to="" control="" hf-fed="" animals=""><0.001 and=""><0.01, respectively).="" when="" comparing="" between="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" with="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" group,="" hce="" co-treatment="" with="" simvastatin="" had="">

niži TG u plazmi u poređenju sa miševima hranjenim HF koji su primali samo simvastatin (str<0.01) (fig.="" 8b).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" the="" simvastatin="" treatment="" group,="" though="" hce="" had="" a="" slightly="" better="" reduction="" in="" tg="" levels.="" in="" addition,="" high-fat-diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" high-density="" lipoprotein="" (hdl)="" cholesterol="" and="" plasma="" low-density="" lipoprotein="" (ldl)="" cholesterol="" in="" mice="" compared="" to="" normal="" chow-fed="" animals="" (fig.="" 8c="" and="" d).="" simvastatin="" treatment="" alone="" significantly="" reduced="" both="" lipids="" in="" high-fat-fed="" mice.="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" also="" significantly="" reduced="" both="" types="" of="" plasma="" lipids="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone.="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" both="" lipids="" among="" all="" treatment="" groups.="" figure="" 8e="" showed="" the="" effect="" of="" different="" treatments="" on="" plasma="" creatine="" kinase="" (ck)="" levels.="" interestingly,="" hf="" diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels="" in="" mice="" compared="" to="" normal-chow-fed="" mice="" (fig.="" 8e).="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" the="" co-treatment="" of="" simvastatin="" significantly="" reduced="" plasma="" ck="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone=""><0.01 and=""><0.01, respectively).="" simvastatin="" treatment="" alone="" also="" significantly="" reduced="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels.="" there="" was="" also="" no="" significant="" difference="" in="" plasma="" ck="" levels="" among="" all="" active="" treatment="" groups="">mjerenje iver lipida.

Efekti različitih liječenih grupa na hepatomegaliju izazvanu HF-om (uvećana jetra) bili su povezani sa značajnim smanjenjem ukupnog sadržaja lipida u jetri, izraženog kao miligram lipida po jetri (slika 9a). Ukupni sadržaj lipida u jetri bio je značajno veći kod miševa hranjenih HF u poređenju sa normalnim miševima hranjenim hranom (3.0-puta više, p<0.001). simvastatin="" exerted="" no="" significant="" effect="" on="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" total="" liver="" lipid.="" interestingly,="" hce="" significantly="" reduced="" such="" a="" diet-induced="" increase="" in="" liver="" lipid=""><0.05). on="" the="" other="" hand,="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" exerted="" a="" trend="" to="" reduce="" the="" liver="" lipid="" content="" though="" did="" not="" reach="" statistical="" significance="" (p="0.15)." however,="" when="" comparing="" the="" liver="" lipid="" content="" among="" all="" treatment="" groups,="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" among="" all="">

Kao što je prikazano na slikama 9b i c, mjerenje ukupnog holesterola u jetri (TC) i triglicerida jetre (TG) otkrilo je da su miševi hranjeni HF imali povišene nivoe oba lipida u poređenju sa normalnim miševima hranjenim hranom (tj. 3.{4} } puta povećanje TC, str<0.001; and="" 3.4-fold="" increase="" in="" tg,=""><0.001). simvastatin="" treatment="" significantly="" reduced="" liver="" total="" cholesterol="" levels=""><0.05) but="" not="" triglyceride="" levels.="" on="" the="" other="" hand,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment,="" significantly="" reduced="" both="" liver="" total="" cholesterol="" and="" triglyceride="" levels="" in="" high-fat-fed="" mice.="" when="" comparing="" the="" effects="" among="" all="" groups,="" we="" observed="" no="" significant="" difference="" in="" liver="" total="" cholesterol,="" but="" there="" was="" a="" significant="" reduction="" in="" liver="" tg="" for="" the="" hce="" treatment="" group="" as="" compared="" to="" the="" simvastatin="" treatment="" group="" (fig.="" 9b="" and="">

Procjena upale jetre. Imunohistohemijsko bojenje je obavljeno kako bi se obojilo prisustvo makrofaga (Mac-3) (slika 10a). Imunohistohemijska analiza sekcija jetre otkrila je prisustvo Mac-3 i kod miševa koji su hranjeni puno masti i kod normalnih miševa hranjenih hranom (smeđa boja). Ova upala je dodatno povećana kod životinja liječenih simvastatinom, iako takav porast nije dostigao statistički značaj. Zanimljivo, HCE tretman, sa ili bez istovremenog liječenja simvastatinom, značajno je smanjio upalu kod miševa hranjenih s visokim udjelom masti. Kada se poredi među svim liječenim grupama, liječenje HCE-om, sa ili bez istovremenog liječenja simvastatinom, također je imalo značajno manju upalu u odnosu na grupu koja je primala simvastatin (p<0.001 and=""><0.001, respectively).="" these="" data="" are="" also="" presented="" as="" percentage="" areas="" in="" fig.="">

Nastavi čitati ...