Dio Ⅱ Nedostatak Smad3 poboljšava terapiju dijabetesa i dijabetesne ozljede bubrega zasnovanu na otočićima promicanjem ćelijske proliferacije putem E2F3-zavisnog mehanizma
May 25, 2023
Metode
1. Životinje
Smad3-null (Smad3KO) miševi su ljubazan poklon prof. Chuxia Denga i održavani su u heterozigotima (Smad3 plus /- ) u pozadini C57BL/6 [20]. Smad3KO miševi su nastali ukrštanjem Smad3 plus /- miševa. db/db miševi sa mutacijom Lepr (leptinskog receptora) u pozadini C57BLKS kupljeni su od Eksperimentalnog centra za životinje Kineskog univerziteta u Hong Kongu (CUHK). Sve životinje su držane u posebnom objektu bez patogena (SPF) sa slobodnim pristupom hrani i vodi u ciklusu dan/noć od 12/12 h. Sve manipulacije životinjama u ovoj studiji izvedene su u skladu sa propisima i odobrenim od strane Etičkog odbora eksperimenata na životinjama CUHK-a sa Ref. Ne. 18-177-MIS.
2. Streptozocin (STZ) izazvan dijabetički mišji model
Mužjaci C57BL/6 miševa u dobi od 8-10 sedmica su intraperitonealno injicirani sa 50 mg/kg/dan STZ dnevno tokom 5 kontinuiranih dana. 5 dana nakon konačne STZ injekcije, miševi sa stabilnom nasumičnom glukozom u krvi više od 16 mM tokom 2 uzastopna dana smatrani su uspješnim uspostavljanjem dijabetesa i korišteni su kao miševi primatelji za transplantaciju otočića.
3. Izolacija otočića, transplantacija i procjena dijabetičkog fenotipa
Ostrva su izolovana od mužjaka ili ženki Smad3 nokaut (KO) ili divljeg tipa (WT) miševa u dobi od 8-10 sedmica kao što je prethodno opisano [21]. Da bi se izvršila transplantacija otočića, naznačeno je da je nekoliko otočića presađeno ispod bubrežne kapsule mužjaka db/db miševa u dobi od 4 sedmice ili STZ-induciranih dijabetičkih miševa 7. dana nakon završne injekcije STZ prema protokolu koji su opisali Szot et al [ 22]. Ukratko, miš primatelj je anesteziran anestezijom Combo (1,5 posto ketamina i 0, 15 posto ksilazina, 6 μL/g tjelesne težine). Nakon gubitka svijesti napravljen je rez od 1 cm na koži koja je prekrivala lijevi bubreg. Nežno izvucite bubreg i održavajte ga vlažnim sterilnim fiziološkim rastvorom tokom operacije. Iglom od 25G napravite malu ogrebotinu na kapsuli kako biste napravili urez. Navedeni broj otočića je dostavljen u bubrežnu kapsulu putem PE50 cijevi. Uostalom, otočići su presađeni, zapečatite urez kauterizacijom na laganoj vatri. Zamijenite bubreg i zatvorite peritoneum šavovima. Zapečatite kožu spajalicama. 100 μL otopine penicilin-streptomicina (Gibco, kat. br. 15140122, SAD) ubrizgano je intraperitonealno kako bi se spriječila infekcija. 100 μL Tegmic-a je ubrizgano intramuskularno kako bi se ublažio bol. Životinja je stavljena u toplo okruženje do potpunog oporavka. Isti postupak je također proveden kod lažnih kontrolnih miševa, ali bez infuzije otočića. I nasumični nivoi glukoze u krvi i nivoi glukoze u krvi u toku 6 sati (RBG i FBG) u krvi vrha repa provjeravani su jednom sedmično pomoću prijenosnog mjerača glukoze (Roche, ACCU-CHEK® Performa). Test insulinske rezistencije (IPITT), test tolerancije na glukozu (IPGTT), nivoi HbA1c i inzulina u serumu mereni su kao što je prethodno opisano [9].
Kliknite ovdje da dobijetekoristi Cistanche
4. Ukupni proteini u urinu i kreatinin u serumu
24 h urin je sakupljen u metaboličkom kavezu. Ukupni protein u urinu za 24 sata izračunat je množenjem volumena urina i koncentracije proteina u urinu koji je kvantificiran pomoću Quick Start Bradford Protein Assay Kit-a (Bio-Rad, kat. br. 5000201, SAD). Kreatinin u serumu je određen kompletom za kvantifikaciju kreatinina (Stanbio Laboratory, cat# 0430-120, SAD).
5. Histopatologija
Histopatološke promjene bubrega ispitane su u paraformaldehidom fiksiranim, parafinom ugrađenim rezovima (4 µm) sa Periodic Acid-Schiffovim (PAS) reagensom kao što je prethodno opisano [23]. Proširenje mezangijalne matrice je ocjenjivano korištenjem programa za kvantitativne slike (Image-Pro Plus 7.0, Media Cybernetics) kao što je prethodno opisano [23].
6. Imunohistohemija
Bubreg ili pankreas koji nosi otočiće fiksiran je u 4 posto paraformaldehida, ugrađen u parafin i isječen na 4 μm. Nakon rehidracije, sekcije su tretirane mikrovalovima posredovanim izvlačenjem antigena u 0.01 M citrat (pH 6.0) u trajanju od 10 minuta i blokiranjem u 5% BSA u trajanju od 1 h . Primarna inkubacija antitijela je obavljena preko noći na 4 stepena. Za fluorescentno bojenje, fluorescentno sekundarno antitelo je primenjeno na sobnoj temperaturi (RT) tokom 1 h. Za termogenezu posredovanu DAB-om, dodatni korak od 3 posto H2O2 blokiranja u trajanju od 15 minuta je uključen prije uzimanja antigena. Nakon primarne inkubacije antitijela, dodat je HRP-konjugirani polimer (Envision plus System, Dako, SAD). Za bojenje E2F3, uzimanje antigena je izvršeno u rastvoru EDTA-Tris (pH 9,0). Antitijela korištena u imunohistohemiji su detaljno prikazana u Tabeli S2. Područje pozitivnog bojenja je kvantificirano pomoću softvera Image J (v1.47, NIH, SAD).
Ekstrakt Cistanche
7. Mjerenje cijepljene ćelijske mase u bubregu koji nosi otočiće
Indeks prosječne površine ćelije po presjeku korišten je za semi-kvantitativno određivanje ćelijske mase u transplantatu otočića. Ukratko, bubreg koji nosi otočiće (ugrađen u parafin) je uzastopno isječen na 4 μm duž sagitalne ose. Kontinuirani preseci u intervalima od 160 μm su fluorescentno imuno obojeni na insulin. Najmanje 6 sekcija sa insulin-pozitivnim bojenjem korišćeno je za izračunavanje površine ćelije po sekciji u svakom mišu. Inzulinsko pozitivna ćelijska površina u svakoj sekciji je kvantificirana pomoću softvera Image J (v1.47, NIH, SAD). Indeks prosječne površine ćelije po sekciji kod svakog miša izračunat je dijeljenjem ukupne inzulinsko-pozitivne površine na sve sekcije brojem sekcija pozitivnih na inzulin.
8. Primarna kultura ćelija otočića
Izolovana otočića su razdvojena na pojedinačne ćelije i zasijana u 96-ploču u 200 μL RPMI 1640 (Gibco, SAD) plus 10 posto FBS (Gibco, SAD) plus 1 posto penicilin-streptomicina (Gibco, SAD) dopunjen sa 20 mM glukoze. Ćelije otočića kultivirane su naznačeno vrijeme u inkubatoru postavljenom na 37 stepeni, 5 posto CO2 i 100 posto vlažnosti. Za uništavanje E2F3 posredovano adenovirusom, disocirane stanice otočića uzgajane su u mediju koji sadrži adenovirus koji prekomjerno eksprimira kratku ukosnu RNA (shRNA) ciljajući mišji E2F3 (shE2F3) ili kontrolnu nespecifičnu shRNA (prikazano) u titru od 10 pfu po ćeliji za 2 dana nakon čega slijedi srednja zamjena. Sekvenca stabla shE2F3 dupleksa bila je 5'-CATCCATGCTCTATTCTGT-3'. Raspršene ćelije sa 50 otočića su zasijane po jažici za imunobojenje i RT-PCR, i 100 otočića po jažici za Western blot, koji su sprovedeni kao što je prethodno opisano [9].
9. In vivo i in vitro BrdU označavanje
Da bi se izvršilo in vivo označavanje BrdU, miševi su intraperitonealno ubrizgani sa 50 mg/kg/dan BrdU (u PBS) tokom 7 dana od 2. dana nakon transplantacije otočića i žrtvovani su 2 h nakon posljednje injekcije. Za in vitro označavanje BrdU, dispergovane ćelije otočića su kultivirane 48 h, nakon čega je zamijenjena svježom podlogom koja sadrži 10 μM BrdU i kultivirana dodatna 24 h. Fluorescentno imunobojenje protiv BrdU u tkivu i kultivisanim ćelijama izvedeno je kao što je prethodno opisano [9].
Cistanche prah
10. RNA-Seq
Ostrva su izolovana od miševa Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT-db/m i Smad3KO-db/m. Za svaki genotip, otočići od više od 5 miševa su spojeni za izolaciju RNK. RNK je pripremljena sa miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Njemačka). RNA-seq i nizvodna analiza podataka opisani su ranije [9]. Nivo ekspresije datog gena je predstavljen kao fragmenti po kilobazi transkripta na milion mapiranih čitanja (FPKM). Diferencijalno eksprimirani gen (DEG) definiran je kao varijansa FPKM-a između dvije grupe veća ili jednaka 2 puta. Regulisani i niže regulisani DEG-ovi su kombinovani i korišćeni za analizu obogaćivanja puteva genske ontologije (GO) i Kjoto enciklopedije gena i genoma (KEGG) sa onlajn DAVID bioinformatičkim resursima (v6.8) sa podrazumevanim postavkama. GOTERM_BP_DIRECT potkategorija je korištena za GO analizu.
11. Imunoprecipitacija
Da bi se izvršila imunoprecipitacija u mišjim otočićima, oko 500 svježe izolovanih otočića je lizirano u 500 mL RIPA pufera. Dodano je zečje anti-Smad3 antitelo (2 ug) ili zečji IgG izotip i inkubirano na 4 stepena preko noći uz laganu rotaciju. Zatim je dodato 20 μL zrna proteina A agaroze (Beyotime, kat. br. P2051, Kina) i inkubirano 2 h na 4 stepena. Nakon snažnog ispiranja svježim RIPA puferom, vezan protein je oslobođen denaturacijom u puferu za punjenje 1xSDS i podvrgnut Western blot analizi. Da bi se izbjegao utjecaj teškog lanca IgG, korišten je mišji anti-zečji IgG specifičan za laki lanac (HRP konjugirani, Abmart, kat. br. M21006, Kina) za prepoznavanje precipitiranog Smad3 proteina.
12. Imunoprecipitacija hromatina-ChIP
Za izvođenje ChIP-a u mišjim otočićima, sakupljeno je oko 2000 otočića od 8-10 sedmica starih C57BL/6 miševa i korišteno kao jedan ChIP preparat. Svježe izolirana otočića su stimulirana sa 10 ng/mL TGF- 1 (Gibco, SAD) tokom 15 minuta u RPMI 1640 plus 1 posto FBS plus 1 posto penicilin-streptomicina. ChIP je izveden sa SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (CST, SAD) prema preporučenim uputstvima. Antitijela i prajmeri korišteni u testu ChIP detaljno su navedeni u Tabeli S1 i S2.
Standardized Cistanche
13. Dual-luciferase reporter test
Promotor miša E2F3 (-1000 do plus 451 bp) je kloniran u pGL3-osnovni vektor (pGL3-E2F3.Pro). Istovremeno, izvršena je tačkasta mutacija na vezivnom mjestu Smad3 da bi se generirao pGL3- E2F3.Pro. Mut. Da bi se izvršio test reportera sa dvostrukom luciferazom, ćelije HEK293T su posađene u ploču sa 24-jažicom pri gustini od 5 x 104 ćelija po jažici. Sljedećeg dana, ćelije su transficirane sa 500 ng pGL3-Basic ili pGL3-E2F3.pro ili pGL3-E2F3.pro.mut u kombinaciji sa pcDNA3.1-Smad3, koji prekomjerno eksprimira mišji Smad3, ili ne (kao što je prikazano na slici 10F) fosfatnom kalcijum metodom. Vektor pEGFP-C1 je dopunjen kako bi se izbalansirala doza transfekcije u svakom tretmanu. 10 ng pGL4.73.huc/SV40 vektora koji eksprimira renilla luciferazu uključeno je u svaki tretman da bi se normalizovala efikasnost transfekcije. 6 h nakon transfekcije, podloga je promijenjena nakon čega je uslijedila inkubacija dodatnih 48 h. Ćelije su lizirane, a aktivnost luciferaze je određena pomoću Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, SAD) i kvantificirana u luminometru (VICTORTM X{40}} Multilabel Reader, PerkinElmer, SAD). Transkripciona aktivnost kloniranog E2F3 promotora predstavljena je kao odnos vrednosti luciferaze krijesnice i renila luciferaze. Svaki tretman je izveden u tri primjerka.
14. Statistika
Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD i analizirani SPSS softverom (16.0). Normalnost podataka je provjerena Kolmogorov-Smirnov testom jednog uzorka. Homogenost varijansi među grupama testirana je Levene statistikom. Za poređenje između dvije grupe korišten je Studentov t-test. Za poređenje među više grupa, korištena je jednosmjerna ANOVA sa LSD testom ako je pretpostavljena jednaka varijansa. Za jednaku varijansu koja nije pretpostavljena, korištena je alternativna statistika Welch testa praćena višestrukim poređenjem sa Tamhaneovim T2 testom. P < 0.05 se smatra statistički značajnim.
Cistanche suplementi
Zaključci
Nedostatak Smad3 u velikoj mjeri poboljšava terapiju zamjene otoka i za T1DM i za T2DM i štiti od dijabetičke ozljede bubrega. Pojačana ćelijska proliferacija zavisna od E2F3- može biti ključni mehanizam terapije Smad3KO otočićima i kod T1DM i T2DM. Stoga, terapija zamjene stanica Smad3KO može biti klinički bolja terapijska strategija za dijabetes.
Reference
1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Klinička transplantacija otoka pankreasa. Nat Rev Endocrinol. 2017; 13: 268-77.
2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Diferencijacija ljudskih pluripotentnih matičnih stanica do funkcionalnih stanica pankreasa za terapije dijabetesa: inovacije, izazovi i budući pravci. J Biol Eng. 2017; 11:21.
3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S, et al. Histološka procjena grafta nakon kliničke transplantacije otočića. Transplantacija. 2009; 88: 1286-93.
4. Lan HY. Različite uloge TGF-beta/Smads u bubrežnoj fibrozi i upali. Int J Biol Sci. 2011; 7: 1056-67.
5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. TGF-beta/Smad signalizacija kod renalne fibroze. Front Physiol. 2015; 6: 82.
6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K, et al. Smad signalna mreža regulira proliferaciju stanica otočića. Dijabetes. 2014; 63: 224-36.
7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. Inhibicija TGF-beta signalizacije promovira humanu replikaciju beta-ćelija pankreasa. Dijabetes. 2016; 65: 1208-18.
8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanić V, et al. Kombinovana inhibicija puteva DYRK1A, SMAD i tritoraksa sinergije da izazove robusnu replikaciju u odraslim ljudskim beta ćelijama. Cell Metab. 2019; 29: 638-52 e5.
9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH, et al. Nedostatak Smad3 potiče proliferaciju i funkciju beta ćelija kod db/db miševa kroz obnavljanje ekspresije Pax6. Theranostics. 2021; 11: 2845-59.
10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. Metoda za izolaciju mišjih otočića i subkapsularnu transplantaciju bubrega. J Vis Exp. 2011.
11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH, et al. Transplantacija izotransplantata otočića poboljšava osjetljivost na inzulin u mišjem modelu dijabetesa tipa 2. Endokrine. 2021; 72: 660-71.
12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. Indukcija p16ink4a i p19ARF od strane TGFbeta1 doprinosi zaustavljanju rasta i odgovoru na starenje u keratinocitima miša. Mol Carcinog. 2009; 48: 181-6.
13. Dyer MA, Cepko CL. Regulacija proliferacije tokom razvoja retine. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 333-42.
14. Dyson N. Regulacija E2F proteinima iz porodice pRB. Genes Dev. 1998; 12: 2245-62.
15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J, et al. Prolazna supresija signalizacije TGFbeta receptora olakšava transplantaciju ljudskih ostrvaca. Endokrinologija. 2016; 157: 1348-56.
16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. Poremećaj SMAD2 u beta ćelijama pankreasa miša dovodi do hiperplazije otočića i poremećene sekrecije inzulina zbog slabljenja aktivnosti K plus kanala osjetljivog na ATP. Diabetologia. 2014; 57: 157-66.
17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P, et al. Prekomjerna ekspresija E2F3 potiče proliferaciju funkcionalnih ljudskih beta stanica bez indukcije apoptoze. Cell Cycle. 2013; 12: 2691-702.
18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. TGF-beta porodična signalizacija u kontroli proliferacije i preživljavanja ćelija. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017; 9.
19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Dijabetes melitus--napredak i izazovi u proliferaciji ljudskih beta-ćelija. Nat Rev Endocrinol. 2015; 11: 201-12.
20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H, et al. Ciljano narušavanje SMAD3 dovodi do oslabljenog imuniteta sluzokože i smanjene reakcije T-ćelija na TGF-beta. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.
21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Protokol za izolaciju otočića iz mišje pankreasa. Nat Protoc. 2009; 4: 1649-52.
22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Transplantacija otočića pankreasa u kapsulu bubrega dijabetičkih miševa. J Vis Exp. 2007: 404.
23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q, et al. Brisanje Smad3 sprečava fibrozu i upalu bubrega kod dijabetičke nefropatije tipa 2. Metabolizam. 2020; 103: 154013.
Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 i Hui-Yao Lan2,7
1 Istraživački centar za integriranu medicinu i odjel za nefrologiju, pridružena bolnica tradicionalne kineske medicine Jugozapadnog medicinskog univerziteta, Luzhou, Sichuan, 646000, Kina.
2. Odsjek za medicinu i terapiju, i Institut zdravstvenih nauka Li Ka Shing, Kineski univerzitet u Hong Kongu, Hong Kong, 999077, Kina.
3. Zajednička laboratorija Guangdong-Hong Kong za imunološke i genetske bolesti bubrega, Narodna bolnica provincije Guangdong, Akademija medicinskih nauka Guangdong, Guangdžou, Guangdong, 510080, Kina.
4. Državna ključna laboratorija bioelektronike, ključna laboratorija Jiangsu za biomaterijale i uređaje, Škola bioloških nauka i medicinskog inženjerstva, Jugoistočni univerzitet, Nanjing, Kina.
5. Ključna laboratorija za prevenciju i upravljanje hroničnom bubrežnom bolešću grada Zhanjiang, Institut za nefrologiju, pridružena bolnica Medicinskog univerziteta Guangdong, Zhanjiang, Guangdong, 524001, Kina.
6. Nacionalna baza za klinička istraživanja tradicionalne kineske medicine, pridružena bolnica tradicionalne kineske medicine Jugozapadnog medicinskog univerziteta, Luzhou, Sichuan, 646000, Kina.
7. Zajednička istraživačka laboratorija za imunološke i genetske bolesti bubrega CUHK-Guangdong Provincial People's Hospital, Kineski univerzitet u Hong Kongu, Hong Kong, 999077, Kina.