PRVI DIO Feniletanol glikozidi štite hipertrofiju miokarda izazvanu konstrikciju abdominalne aorte putem ECE-1 inhibicije demetilacije i poboljšanja putanje PI3K/PKB/eNOS
Mar 06, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Qiong-Ling Fan,1 Jia-Wei Wang,1 Shi-Lei Zhang, & et al.
Feniletanoil glikozidi (CPhGs)su osnovna materijalna osnova farmakološke aktivnosti uCistanche tubulosai imaju različite farmakološke efekte. Međutim, nejasno je da li su CPhG(Feniletanoild glikozidi iz cistanche) imaju meliorativni učinak na hipertrofiju miokarda uzrokovanu preopterećenjem. U ovoj studiji, mužjaci SD pacova težine (200 ± 20) g su ustanovljeni kao modeli srčane hipertrofije koarktacijom abdominalne aorte (AAC). Nakon operacije, pacovima je davan odgovarajući lijek 6 sedmica (CPhGs(Feniletanoild glikozidi iz cistanche) 125, 250 i 500 mg/kg/d i valsartan 8,3 mg/kg/d). Detektovani su ehokardiografija, indeks srčane težine (HWI), površina poprečnog presjeka kardiomiocita (CSCA), područje fibroze, plazma endotelin 1 (ET-1) i nivoi proinflamatornih faktora. Naši rezultati su pokazali da različiti CPhG(Phenyletanoild glikozidi) smanjena doza debljina stražnjeg zida lijeve komore (LVPWT), krajnji dijastolički promjer lijeve komore (LVED), HWI, CSCA, područje fibroze, ET-1, proinflamatorni faktori, arterijski natriuretski peptid (ANP), moždani natriuretski peptid (BNP ), nivoi mRNA enzima koji konvertuje endotelin 1(ECE-1), nivoi ciklooksigenaze 2 (COX-2), nivoi proteina u kutiji grupe visoke pokretljivosti 1 (HMGB-1) i ECE{{8} } nivo demetilacije uz povećanje ejekcionih frakcija lijeve komore (LVEF), frakcijsko skraćivanje lijeve komore (LVFS), fosforilirana fosfatidilinozitol 3-kinaza (p-PI3K), fosforilirana protein kinaza B (p-PKB) i fosforilirani nitrioksid endotel sintetaza (p-eNOS). -e indeksi CPhG(Feniletanoild glikozidi iz cistanche) 250 i 500 mg/kg grupe su se značajno razlikovale od AAC grupe; u poređenju sa grupom koja je primala valsartan (AV), indeksi CPhGs 500 mg/kg grupe nisu se značajno razlikovali. U zaključku, CPhGs(Feniletanoild glikozidi iz cistanche) poboljšala hipertrofiju miokarda kod pacova AAC-om, što može biti povezano sa inhibicijom ECE- 1 demetilacije i poboljšanjem PI3K/PKB/eNOS.
2. Materijali i metode
2.1. Životinje.
70 mužjaka SPF SD pacova težine 200 ± 20 g (10 po grupi) obezbijedio je Centar za eksperimentalne životinje Medicinskog univerziteta Xinjiang (Urumqi, Kina). Broj dozvole za proizvodnju životinja bio je SYXK(XIN)2016-0003, a broj certifikata SCXK(XIN)2016-002. -e studiju je odobrio Komitet za etiku životinja Prve pridružene bolnice Medicinskog univerziteta Xinjiang (broj odobrenja 20180223-183). -održavani su sa slobodnim pristupom vodi i hrani u plastičnim kavezima i držani u ciklusu svjetlo/mrak od 12 sati na temperaturi od 22 ± 2 stepena i vlažnosti od 45-55 posto u našem Centru za eksperimentalne životinje.
2.2. Materijali.
CPhGs(Feniletanoild glikozidi iz cistanche) , čiji je sadržaj ehinacee bio više od 40 posto i akteozida više od 16 posto, kupljen je od Hetian Di Chen Medical Biotechnology Co., Ltd. Valsartan je kupljen od Beijing Novartis Pharma Co., Ltd. Carboxymethylcellulose sodium (CMC-Na) je osigurala Xian Zhengtian Pharmaceutical Accessories Co., Ltd., a CPhG su rastvoreni u 0,5 posto CMC-Na.
Feniletanoild glikozidi iz cistanche
2.3. Koarktacija abdominalne aorte (AAC).
Nakon anesteziranja sa 2,5 posto pentobarbital natrijuma (2,5 ml/kg) (Merck, Darmstadt City, Hessen, Njemačka), pacovi su obrijani i držani na toplim jastučićima za grijanje. -en trbušna šupljina štakora je otvorena za 2 cm na sredini abdomena u sterilnom okruženju, trbušni utrobe su gurnute na desnu stranu, a trbušna aorta je potpuno otkrivena na 0,5 cm iznad desne bubrežne arterije. Igla broj 8 je podvezana žicom broj 2 paralelno sa trbušnom šupljinom koja se šivala [18]. Abdominalne aorte pacova u lažnoj grupi su odvojene bez podvezivanja i nije bilo kontrolne grupe za operaciju. -e dan nakon operacije, AC 125 mg/kg, AC 250 mg/kg i AC 500 mg/kg hranjeni su CPhG(Feniletanoild glikozidi iz cistanche)gavažom; AV grupa je hranjena valsartanom putem sonde; i kontrolna grupa, AAC grupa i lažna grupa nisu hranjene sa CPhG ili valsartanom, jednom dnevno tokom 42 uzastopna dana. Doza lijeka određena je na osnovu prethodnih referenci i preliminarnih eksperimenata [8].
2.4. Ehokardiografija.
Šest sedmica nakon AAC-a, pacovi su anestezirani sa 2,5 posto pentobarbital natrijuma i izvršena je ehokardiografija (Philips HD11 XE, Amsterdam, Holandija). LVPWT, LVED, LVEF i LVFS su mjereni četiri puta da bi se izračunali prosjeci kao konačni indikatori.
2.5. Indeks srčane težine (HWI).
Nakon ehokardiografije, pacovi su pogubljeni prikupljanjem krvi iz abdominalne aorte. Srca pacova su izvađena iz sanduka i izmerena nakon što su tri puta isprana fiziološkim rastvorom (4 stepena) i oceđena čistim filter papirom. -e HWI je izračunat pomoću sljedeće formule: HWI � težina srca tjelesna težina. (1)
2.6. Hematoksilin-eozin i Massonovo bojenje.
-e miokard iz leve komore je fiksiran sa 4% paraformaldehida ugrađenim u parafin, poprečno presečen sa debljinom preseka od 4 μm, sušen u pećnici na 60 stepeni 2 sata, a zatim obojen hematoksilin-eozinom ili Massonom (Solaibio, Peking, Kina). -e struktura miokarda posmatrana je inverznim fazno-kontrastnim mikroskopom (Leica, Frankfurt, Njemačka). Za izračunavanje CSAC i površine fibroze korišten je softver Image J.
2.7. Enzimski vezan imunološki sorbentni test (ELISA).
Krv iz abdominalne aorte je ekstrahirana iz pacova i stavljena u antikoagulacijsku epruvetu na 2 h na sobnoj temperaturi, a zatim centrifugirana pri brzini od 3000 o/min. -e supernatant je apsorbovan pipetama (Eppendorf, Hamburg, Nemačka) i čuvan na 80 stepeni radi testiranja. Plazma ET-1, interleukin 1 (IL-1), interleukin 6 (IL-6), faktor tumorske nekroze Komplementarna i alternativna medicina zasnovana na dokazima
Nivoi (TNF-) (Bioss, Peking, Kina) i ciklooksigenaze 1 (COX-1) (Cusabio, Wuhan, Kina) kod pacova su detektovani prema uputstvima ELISA kompleta.
2.8. PCR specifičan za metilaciju.
DNK je ekstrahovan iz tkiva miokarda leve komore pacova pomoću kompleta za ekstrakciju DNK (Tiangen Biotech, Peking, Kina). -e vrijednost apsorpcije (vrijednost A) bila je jednaka OD260/OD280 (1,8∼1,9). 20 ul genomska DNK (500 pg-1 ug) modificirana je sumpornom kiselinom pomoću Methylation-Gold Kit (ZYMO, Orange County, CA, SAD). -e MSP reakcijski sistem je bio 25 μL, uključujući 3,0 μL sulfitom modificiranog DNK šablona, 2,5 μL 10 × pufera, 2,5 μL 2,5 mm dNTPs, 1,0 μL 10 μm prajmera, 0,1 μL Hotstar Taq DNA Biotech polymerase (TAK) polimera i 14,9 μL ddH2O. - Bilo je ukupno 45 ciklusa: denaturacija na 95 stepeni, žarenje na 55 stepeni i ekstenzija na 72 stepena tokom 30 s. Nakon PCR-a, 5 μL proizvoda je odvojeno elektroforezom u 2 posto agaroznom gelu. -e DNK je tretirana M. Sssl metiltransferazom (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) korišćena je kao pozitivna kontrola metilacije, a DNK normalne kontrolne grupe je korišćena kao pozitivna kontrola demetilacije. Konačno, gel agaroze je fotografisan i analiziran Bio-Rad gel sistemom za snimanje. -e nivo demetilacije izračunat je pomoću sljedeće formule:
Svi prajmeri dizajnirani u Methprimer-u (Applied Biosystems, MA, SAD) i sintetizovani od strane Sangon Biotech-a (Šangaj, Kina) navedeni su u tabeli 1.
2.10. Western Blot.
Proteini su ekstrahovani iz miokarda leve komore pomoću Ripa Buffffer-a (Scientific) i dodat je inhibitor proteaze. Koncentracija proteina određena je BCA metodom (Solarbio, Peking, Kina). Proteini su uzeti na 50 ug i denaturirani na 100°C 5 minuta. Proteini su razdvojeni elektroforezom natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnog gela (SDS-PAGE, Beyotime, Šangaj, Kina), a zatim prebačeni na membranu od poliviniliden fluorida (PVDF) pomoću elektroforetske opreme (Bio-Rad, Kalifornija, SAD). Nakon što su blokirane sa 3 procenta BSA tokom 2 sata na sobnoj temperaturi, membrane su inkubirane sa anti-PI3K antitelom, antifosfo-PI3K antitelom, anti eNOS antitelom, anti-fosfo-eNOS (1:1000, Bioss, Peking, Kina), anti-COX-2 antitijela, anti-HMGB-1 antitijela (1: 1000, Proteintech, Chicago, IL, SAD) i anti-ECE-1 antitijela (1: 2000, Signalway Antibody , College Park, MD, SAD), primarna antitijela preko noći na 4 stepena. Sljedećeg dana, nakon što su tri puta isprane TBST-om, membrane su inkubirane sa HRP-obilježenim kozjim anti-zečjim IgG (1:25000, 1 h, Zhongshanjinqiao, Šangaj, Kina) na sobnoj temperaturi. Nakon što su tri puta isprane sa TBST, membrane su vizualizovane pomoću Pierce™ ECL Western Blotting supstrata i snimljene korišćenjem FluorChem E Imaging System (Protein Simple, SAD), koje su normalizovane na -aktin kao internu kontrolu.
Prednosti Phenyletanoild glikozida iz cistanchea
cistanche benefit
3. Rezultati
3.1. CPhGs(Feniletanoild glikozidi iz cistanche) Poboljšana srčana funkcija kod pacova nakon AAC.
-e pacovi su primili sondu od dana nakon AAC-a. -e pozitivna kontrolna grupa (AV) je dobila valsartan 8,3 mg/kg/d, a CPhGs grupa (AC) je dobila CPhGs 125, 250 i 500 mg/kg/d, respektivno. Nakon šest sedmica kontinuiranog doziranja, pacovima je urađena ehokardiografija pod anestezijom od 2,5 posto natrijum pentobarbitala. Dva pacova su umrla nakon AAC: jedan u grupi modela uginuo je trećeg dana nakon AAC od plućnog edema; još jedan u AC 500 mg/kg umro je dan nakon operacije za koju se sumnjalo da je uzrokovana kirurškim stresom. Kao što je prikazano na slici 2, u poređenju sa lažnom grupom, LVED, LVEF i LVFS u AAC grupi su značajno smanjeni, ali je LVPWT u AAC grupi značajno povećan. U poređenju sa AAC grupom, LVED, LVEF i LVFS su povećani i LVPWT je smanjen u različitim stepenima u svakoj grupi doze AC; za LVPWT, značajna promjena nije pronađena u AC 125 mg/kg grupi, ali je nađena u AC 250 i 500 mg/kg grupama. U poređenju sa AV grupom, LVPWT i LVED u grupi sa AC 125 mg/kg uočena je značajna razlika, dok LVPWT, LVED, LVFS i LVFS u grupama AC 250 i 500 mg/kg nisu.
3.2. CPhGs(Feniletanoild glikozidi iz cistanche) Smanjena površina HWI, CSAC i fibroze kod pacova nakon AAC.
-en smo izmjerili srce svakog štakora da bismo izračunali HWI i uzeli tkivo miokarda za HE i Massonovo bojenje da bismo uočili promjene površine poprečnog presjeka (CSAC) i površine fibroze u kardiomiocitima. Kao što je prikazano na slikama 3(a), 3(d) i 3(e), u poređenju sa lažnom grupom, srčana težina (HW) i HWI u AAC grupi su značajno smanjeni; u poređenju sa AAC grupom, HW i HWI u grupama AC250 i 500 mg/kg su značajno smanjene; u poređenju sa AV grupom, HW i HWI su značajno povećani u AC 125 mg/kg grupi, ali nisu bili u AC 250 i 500 mg/kg grupama. Na slikama 3(b) i 3(f), u poređenju sa lažnom grupom, rezultati bojenja po Massonu pokazali su da je područje fibroze u AAC grupi značajno povećano. Za područje fibroze, značajno smanjenje je pronađeno u grupama AC 125, 250 i 500 mg/kg u poređenju sa AAC grupom, dok je značajno povećanje u grupama AC 125 i 250 mg/kg i značajno smanjenje AC 500 mg/ kg grupe su pronađene u poređenju sa AV grupom. Na slikama 3(c) i 3(g), rezultati HE bojenja su pokazali da je CSAC u AAC grupi značajno povećan u poređenju sa onom u lažnoj grupi; u poređenju sa AAC grupom, CSAC u grupama AC 250 i 500 mg/kg je značajno smanjen; u poređenju sa onim u AV grupi, međutim, CSAC je značajno povećan u AC 125 i 250 mg/kg grupama, a nije nađena značajna razlika u grupi AC 500 mg/kg
3.3. CPhGs(Feniletanoild glikozidi iz cistanche) Smanjeni nivoi mRNA gena za hipertrofiju miokarda u tkivu miokarda pacova nakon AAC.
ANP, BNP i teški lanac miozina (-MHC) su važni faktori srčane hipertrofije [19, 20]. Otkrili smo relativne nivoe ekspresije ova tri gena za srčanu hipertrofiju u tkivima miokarda. Kao što je prikazano na slici 4, u poređenju sa lažnom grupom, relativni nivoi ekspresije ANP, BNP i -MHC mRNA u AAC grupi su značajno povećani; međutim, u poređenju sa AAC grupom, relativni nivoi ekspresije tri gena za hipertrofiju miokarda u AC 250 Komplementarnoj i alternativnoj medicini zasnovanoj na dokazima 5.
