Extraction Of Phenylethanoid Glycosides From Cistanche Tubulosa By High-Speed Shearing Homogenization Extraction

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Wenjing Pei i Ruili Guo

Pozadinu:

Cistanche tubulosaje poznata tradicionalna kineska medicina porijeklom iz Xinjianga. Rasprostranjen je u sjevernoj Africi, Indiji itd. Cilj: Glavna bioaktivna komponentaC. tubulosaje fenilethanoidni glycosides (PhGs). Echinacoside i akteoside su indikativna komponenta za određivanje PhG-ova i uglavnom se koriste za zaštitu jetre, imunološku zaštitu itd. Stoga je vrlo važno izvući phG-ove iz C. tubulosa. Metode: U ovoj studiji uspoređene su metode ekstrakcije uz pomoć ultrazvuka (UAE), ekstrakcije uz pomoć mikrovalne (MAE) i metode homogenizacije homogenizacije velike brzine. Nadalje, uslovi vađenja HSHE metode su optimizirani. Rezultati: Rezultati su pokazali da je HSHE metoda bolja i od UAE i MAE metoda, A optimalni parametri ekstrakcije HSHE bili su koncentracija etanola od 50%, temperatura ekstrakcije 70°C, brzina rotacije 16000 o/min, vrijeme ekstrakcije 2 min, omjer čvrsto-tekućih 1:9 i jedan ciklus ekstrakcije. Prinosi ehinakoside i akteoside su bili 1,366 odnosno 0,519%, a stopa transfera ehinakoside i akteoside dostigla je 87 odnosno 94%. Zaključci: Može se zaključiti da je HSHE metoda jednostavna, brza i efikasna tehnika za izdvajanje phG-ova iz C. tubulosa. Izdvajamo: Istražena je efikasna i eko-friendly HSHE metoda za vađenje phG-ova iz C. tubulosa. Dobiveni su optimalni uvjeti HSHE metode za vađenje phG-ova iz C. tubulosa. Ovo istraživanje pruža novu metodu za industrijsko izdvajanje phG-ova izC. tubulosa.

Cistanche tubulosa

Cistanche tubulosaje uobičajena tradicionalna kineska medicina koja potječe iz Xinjianga. Rasprostranjena je u sjevernoj Africi, Arapskom poluostrvu, Pakistanu i Indiji, a službeno je zabilježena u Kineskoj farmakopoeji 2010. godine. Glavna bioaktivna komponentaC. tubulosaje fenilethanoidni glycosides (PhGs), klasa prirodnih proizvoda koji se rastvore u vodi uključujući ehinakoside, akteoside, izoakteoside, i 2-acetilakteoside (1, 2). Struktura PhG-ova se sastoji od cinamičke kiseline i hidroksifinetilnih mehurića, od kojih su obje pričvršćene na β-glukopiranozu kroz ester i glycosidic linkages, odnosno (3). Farmakološke studije su pokazale da phG-i C. tubulosa imaju mnoge ljekovite funkcije, kao što su antifatigue (4), neuroprotektivni (5–7), zaštitni za jetru (8–10), i imunoprotektivni učinci (11). Stoga je efektivno izdvajanje phG-ova iz C. tubulosa od velikog značaja za razvoj i ikorišćenje prirodnih proizvoda.

Trenutne tradicionalne metode ekstrakcije phG-a su ekstrakcija vrućeg refluksa, ekstrakcija uz pomoć ultrazvuka (UAE) i ekstrakcija uz pomoć mikrovalne (MAE; 12–16). Ove metode imaju različite nedostatke, kao što su niska efikasnost, duga vremena izvlačenja, i visoki troškovi. U poređenju sa tradicionalnim metodama, metoda brzog smicavanja homogenizacije (HSHE) je metoda ekstrakcije novela i ima prednosti bržeg vremena vađenja, manje otapajućeg otpad, veće prinose, jednostavniji uređaj i lakši rad (17). Radni princip HSHE metode temelji se na rotirajućem unutrašnjem rezaču koji vozi motor velike brzine. Snažnu silu za sniženje proizvode unutrašnji i izlazni rezači kako bi poremetili i pomiješali uzorke. U međuvremenu, rezač sa rotacijom velike brzine uzrokuje razlike u pritisku između unutrašnjih i vanišnih šupljina rezača, što rezultira masovnim prijenosom između uzoraka i otapa. Kombinacijom velike sile za sniženje, sile sudara, pritiska i drugih sila, brzo se može postići rastvorna ravnoteža između čvrstih uzoraka i otapa (18). Tako, proces ekstrakcije HSHE može biti završen za nekoliko minuta, pa čak i brzo kao i desetine sekundi (19–22).

Nedavno je HSHE istražen u ekstrakciji bioaktivnih komponenti iz raznih prirodnih proizvoda (23–25). Cheng et al. je koristio HSHE da izvuče pet lignana iz ploda Schisandra Chinensis (26). Rezultati su pokazali da su optimalni uslovi bili koncentracija etanola od 75%, vrijeme izvlačenja od 1 min, omjer čvrstih i tekućih 1:19, ekstrakcioni napon od 180 V i veličina uzoraka čestica od 120 mreza. Ukupan prinos od pet lignana bio je 13,89 ± 0,014 mg/g pod optimizovanim uslovima. Tang et al. je koristio HSHE za dobijanje bioaktivnog ulja od sejenih perilla (27). Optimalni uslovi su bili vrijeme ekstrakcije od 2 min, omjer čvrste i tekuće 1:10, ekstrakcioni napon od 150 V i dva ciklusa izvlačenja. Prinos ulja sejmova Perilla dostigao je 59,3%. Gorenađeni rezultati ukazuju da HSHE ima prednosti kratkih vremena izvlačenja, niskih troškova i visokih prinosa. Međutim, postoji nedostatak istraživanja o izvlačenju phG od strane HSHE.

U sadašnjoj studiji, HSHE je korištena za istraživanje njegove potencijalne primjene u ekstrakciji phG-ova izC. tubulosa. Prinos phG-ova je odredio HPLC. Tri metode ekstrakcije, HSHE, UAE i MAE, su upoređene pod istim uslovima. Istraživali su se efekti koncentracije etanola, temperature ekstrakcije, brzine rotacije, vremena ekstrakcije, omjera čvrstih i tekućih, te broja ciklusa ekstrakcije prinosa. Prednosti i mane ovog rada i reference se upoređuju i raspravljaju.

Materijali i metode

Materijal i hemijski reagenti

C. tubulosaje kupljen od Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd (Xinjiang, Kina). Standardi echinacosidea (čistoće ≥98%) i akteoside (čistoće ≥98%) kupljeni su od Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd (Šangaj, Kina). Acetonitril, metanol i oceta kiselina su bili hplc razreda (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). Analitički etanol je kupljen od Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Tianjin, China). Deionizirana voda je korištena tokom eksperimenata.

HPLC analiza

HpLC analiza je izvršena na vodi e2695 tekućoj hromatografiji (Waters, Milford, MA) opremljenoj 2489 UV/Vidljivim detektorom i kolonom C18 simetrije (Vode), 250 × 4,6 mm, veličinom čestica od 5 μm. Koncentracije ehinakozida i akteozida analizirane su HPLC metodom. Mobilna faza se sačinjala od (1) acetonitrila i (2) 2% ledenog ocetnog kiselina aqueous rastvora. Program elucije gradijenta je predstavljen u Tabeli 1.

Otkrivena talasna dužina je bila 330 nm, protok je bio 1 mL/min, volumen injekcije je bio 10 μL, a temperatura pećnice je postavljena na 30°C. Hromatografski vrh analita je potvrđen upoređivanjem njegovog vremena održavanja sa onim iz standarda. Kvantifikacija je izvršena integracijom vrha pomoću vanjske standardne metode.

Precizni test je izvršen ubrizgavanjem istih uzoraka ekstrakcije pet puta. Za test stabilnosti, isti uzorci su analizirani u pomacima od 0, 1, 2, 4, 12, 24 i 48 h. Testovi oporavka ehinakozida i akteoside su izvršeni dodavanjem standarda u uzorke ekstrakcije. Zabilježena su sva vršna područja i vrijeme održavanja echinacosidea i akteosidea. Rezultati kalibracionih krivina za echinacoside i akteoside su nabrojani u Tabeli 2.

Izračun prinosa

Echinacoside i akteoside su korišteni kao indikativna komponenta za određivanje PhG-ova. Prinos echinacoside ili akteoside je izračunat pomoću sljedeće jednadžbe:

Y=CV/W×100% (1)

gdje je Y = prinos echinacoside ili akteoside (%); C = koncentracije ehinakozida ili akteoside (mg/mL); V = volumen otopine za ekstrakciju (mL); i W = težina C. tubulosa praha (mg).

Metode vađenja phg-ova

Stapci C. tubulosa su prvi put izmljeni električnim mlinom (JC-500g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, China) i filtriran sitom filtera (približno 380 μm). Zatim je C. tubulosa prah sušen u pećnici na 70°C dok težina nije bila konstantna. Pet grama C. tubulosa prah je pomiješan sa ekstrakcionim otapalom i smestio se u bocu za ekstrakciju. Nakon toga, tekuća smjesa je bila zagjenjena (30–80°C) 5 min u vodenoj kupelji konstantne temperature (DF-101S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, China).

(a) HSHE metoda.—HSHE je izvršena fa25 sistemom (FLUKO Co., Ltd, Shanghai, China), koji se sastoji od rotirajućeg rezača, motora velike brzine i kontrolora. Brzina rotacije unutrašnjeg rezača je regulisana u rasponu od 10000-28000 o/min, a vremena izvlačenja su podešena u rasponu od 2–15 min.

(b) UAE metoda.—Pet grama sušenog uzorka i 300 mL metanola je precizno vagano i dodato u bocu za ekstrakciju. Boca za vađenje je uronjena u ultrazvučnu kupku i izvedena ultrazvučnom snagom od 300 W 10 min. Temperatura izvlačenja je postavljena na 30°C.

(c) MAE metoda.—Pet grama sušenog uzorka i 300 mL metanola je precizno vagano i dodato u bocu za ekstrakciju. Boca za vađenje je stavili u mikrovalni reaktor i izvodili se na 180 W 10 min. Temperatura izvlačenja je postavljena na 30°C.

Metoda HSHE je upoređena sa metodama UAE i MAE sa istim ekstrakcionim otapalom, vremenom ekstrakcije, temperaturom ekstrakcije, omjerom čvrstih i tekućih, i brojem ciklusa ekstrakcije. Ekstrakcioni rastvor je filtriran membranom od 0,22 μm i analiziran preko HPLC-a kako bi se utvrdile koncentracije ehinakoside i akteoside. Svi procesi vađenja su ponovljeni tri puta

Određivanje stopa transfera

Na osnovu standardne metode u Kineskoj farmakopoeiji 2015. godine utvrđeni su sadržaj echinacoside i akteoside u C. tubulosa prahu (28). Jedan gram C. tubulosa prah i 50 mL 50% metanola su precizno vagani i dodani u smeđu volumetrijsku pljosku od 50 mL. Tecna smjesa je bila vagana i natopljena 30 min. Zatim je smeđa volumetrička pljoska uronjena u ultrazvučnu kupku i izvedena ultrazvučnom snagom od 250 W i frekvencijom od 35 kHz 40 min. Tekuća smjesa je premotana, a 50% metanola je dodano u opskrbu zbog gubitka otapao. Ekstrakciona otopina filtrirana je membranom od 0,22 μm i analizirana je pomoću HPLC-a kako bi se utvrdile koncentracije ehinakozida i akteoside. Procesi izvlačenja su ponovljeni tri puta.

Stope transfera echinacoside ili acteoside su izračunate pomoću sljedeće jednadžbe:

X= M1/M2 ×100% (2)

gdje je X = brzina prijenosa ehinakoside ili akteoside (%); M1 = kvalitet ehinakoside ili akteoside u ekstraktu (mg); i M2 = kvalitet echinacoside ili akteoside u C. tubulosa prahu (mg).

Rezultati i diskusija

Validacija HPLC metode

HPLC profili echinacoside i akteoside iz C. tubulosa koristeći HSHE prikazani su na 1. RsD vršnih područja ehinakoside i akteoside bila je 1,89 odnosno 1,40%. Rezultati su pokazali da HPLC metoda ima dobru preciznost u kvantitativnoj analizi echinacosidea i akteosidea. U raznim vremenima (0–48 h), RSD-ovi vršnih područja ehinakoside i akteoside su bili 1,71 odnosno 1,70%, što ukazuje da je uzorak bio stabilno u 48 h. Oporavak ehinakozida i akteoside bio je 99,3 odnosno 99,1%, a njihov rsd je bio 0,70 odnosno 0,67%, što je potvrdilo pouzdanost HPLC metode.

Usporedba različitih metoda ekstrakcije

Obavljena je usporedba HSHE metode s metodama MAE i UAE u vezi s prinosima echinacosidea i akteosidea, od kojih su rezultati prikazani na 2. Primjećivano je da su prinosi ehinakozida i akteoside dobiveni od HSHE-a veći od onih koje su dobili i MAE i UAE. U odnosu na MAE, prinosi echinacosidea i akteoside dobiveni od strane HSHE bili su veći za 20,5 odnosno 20,8%. I u poređenju sa UAE, prinosi ehinakoside i akteoside dobiveni od strane HSHE bili su veći za 6,6 odnosno 7,4%. Ovi rezultati ukazuju da HSHE može značajno povećati prinose phG-ova.

Optimizacija HSHE metode

Parametri ekstrakcije phG-ova od strane HSHE uključuju koncentraciju etanola, temperaturu ekstrakcije, brzinu rotacije, vrijeme ekstrakcije, omjer čvrstih i tekućih, te broj ciklusa ekstrakcije (26, 29).

Učinak koncentracije etanola na ekstrakciju phG-ova

Koncentracija etanola je važan faktor koji utiče na prinose PhG-ova. Kao što je prikazano na 3., ispitani su prinosi ehinakoside i akteoside iz C. tubulosa pod različitim koncentracijama etanola. Otkrilo se da se prinos ehinakoside povećao sa 0 na 30%, a zatim se s 30 na 90% s povećanjem koncentracije etanola. Prinos akteoside se povećao sa 0 na 70%, a zatim se s 70 na 90% s povećanjem koncentracije etanola. Kada je koncentracija etanola bila 50%, cicija ehinakozida i akteoside prinosa je bila na maksimumu. Različite koncentracije etanola imaju različite polaritete, što dovodi do različitih rastvora ehinakoside i akteoside. Tako je optimalna koncentracija etanola bila 50%.

Efekt brzine rotacije na ekstrakciju phG-ova

Na sličci 5 se pokazuju učinci različitih brzina rotacije na prinose PhG-ova. Prinosi ehinakoside i akteoside su se povećali sa povećanjem brzina rotacije. Povećanje brzine rotacije može povećati sniženje sile unutrašnjeg i izvana rezača, povećavajući tako prinose PhG-ova. Optimalna brzina rotacije je bila 16000 o/s.

Efekat vremena ekstrakcije na ekstrakciju phG-ova

Prinosi ehinakoside i akteoside u različitim vremenima ekstrakcije prikazani su na 6. Prinosi ehinakoside i akteoside bili su stabilni s povećanjem vremena izvlačenja. Stoga se može zaključiti da se PhG-i mogu u potpunosti izvući iz C. tubulosa za 2 min, a optimalno vrijeme ekstrakcije je bilo 2 min.

Efekt solid-to-liquid Ratio na ekstrakciju PhG-ova

Kao što je prikazano na 7. Prinosi ehinakoside i akteoside su se povećali sa 1:3 na 1:9 i postali stabilni od 1:9 do 1:24. Pošto mala količina ekstrakcionog otavara ne može u potpunosti rastvoriti ehinakoside i akteoside, stopa prijenosa mase je smanjena. Pretjerano vađenje otavara uzrokovalo je nepotrebni otpad. Stoga je optimalni omjer čvrste i tekuće bio 1:9.

Učinak broja ciklusa ekstrakcije na ekstrakciju phG-ova

Nacilja 8 pokazuje da efekti brojnih ciklusa ekstrakcije na prinose phG-ova. Prinosi ehinakoside i akteoside su se povećali sa sve većem broju ciklusa ekstrakcije. Međutim, vremena izvlačenja su se izvanredno povećala sa povećanjem ciklusa ekstrakcije, i više energije je bilo uzeto. Optimalni broj ciklusa ekstrakcije je bio jedan.

Upoređivanje HSHE metode sa drugim metodama ekstrakcije za izdvajanje phG-ova

Rezultati HSHE metode u usporedbi s drugim metodama ekstrakcije za izdvajanje PhG-ova iz C. tubulosa su nabrojani u Tabeli 3. HSHE je jednostavnija i lakša od metoda spojnice kao što su ultrazvučni pomoćni vađenje u dvije faze i ultrazvučne metode mikrovalne tehnologije ekstrakcije. Osim toga, pritisak vađenja HSHE je niži od metode ekstrakcije tečnosti pod pritiskom, a uslovi rada nekadašnjeg su sigurniji. Što je još važnije, iz tabele 3 se vidi da HSHE pokazuje najkraće vrijeme izvlačenja i najmanje potrošnje otavara među svim metodama ekstrakcije. Može se zaključiti da HSHE metoda ima mnoge prednosti kao što su visoka efikasnost, blagi uslovi rada, niske razine potrošnje, jednostavna oprema, te jednostavan rad za vađenje prirodnih proizvoda.

Zaključci

U ovoj studiji istražena je efikasna i ekoprijateljska HSHE metoda za vađenje phG-ova iz C. tubulosa. U odnosu na metode UAE i MAE, roman HSHE metoda proizvodi veći prinos PhG-ova pod istim uvjetima. U odnosu na metodu MAE, prinosi ehinakoside i akteoside su povećani za 20,5 odnosno 20,8%. I u poređenju sa UAE, prinosi ehinakoside i akteoside su povećani za 6,6 odnosno 7,4%. Parametri ekstrakcije HSHE phG-ova iz C. tubulosa su optimizirani. Pod optimizovanim parametrima, prinosi ehinakoside i akteoside dostigli su 1,366 odnosno 0,519%, a stopa transfera ehinakoside i akteoside dostigla je 87 odnosno 94%. HSHE metoda ima prednosti visoke efikasnosti, blagih uslova rada, niskog nivoa potrošnje, jednostavne opreme, lakog rada, i niskih troškova. Ova istraživanja pružaju novu metodu industrijskog vađenja phG-ova iz C. tubulosa.