Kako echinacoside sprečava Parkinsonovu bolest

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Dio I.:Mehanizam Autofagije Regulacija u MPTP-Induced PD Miševi preko MTOR signalnog puta po Echinacoside

Apstraktno:

Cilj: Sadašnja studija je za cilj bila istražiti učinakechinacoside(ECH) na indikatore povezane sa autofagijom putem signalnog puta mTOR-a, posebno efekta na očišćenje autofagijinog supstrata P62 i α-sinukleina, jezgre patoloških proizvoda odParkinsonova bolest(PD), da se obezbijede nove strategije za liječenje PD (Parkinsonova bolest). Metode: Miš model subacute PD(Parkinsonova bolest)ustanovljena je intraperitonealnom injekcijom 1-metil-4-fenila-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP). Prvo, neurobehavioralni simptomi kod miševa svake grupe su bili procijenjeni, a monoaminski neurotransmiteri u striatumu u svakoj grupi mjereni su s tečnom fazom visokih performansi. Imunofluorescencija dvostruko mrljanje je usvojena kako bi se posmatrao izraz tirozin hidroksilaze (TH), α- sinuclein, i LC3. Transmisioni elektronski mikroskop je korišten za promatranje promjena ultrastrukture u substantia nigra i formiranje autofagosoma. Zatim, izraze TH, α-sinuclein, Beclin 1, LC3, P62, mTOR, i uzvodno protein AKT su otkriveni od strane Western blot. Rezultati: Kada se u odnosu na grupu modela neurobehavioralna funkcija značajno poboljšala uECH (Echinacoside)grupa ( p< 0.01),="" together="" with="" increased="" expression="" of="" th,="" da,="" and="" dopac="" in="" the="" brain="" (p="">< 0.01).="" in="" the="">ECH (Echinacoside)grupe, dok su se izrazi Beclina 1 i LC3-II povećali (P< 0.01),="" the="" expression="" levels="" of="" p62="" and="" α-synuclein="" decreased="" significantly="" (p="">< 0.01).="">ECH (Echinacoside)mogao up-regulisati nivo izraza signala preživljavanja p-AKT/AKT i sniziti izraz mTOR-a. Zaključak:ECH (Echinacoside)može povećati autofagiju inhibicijom izražavanja mTOR-a, i time promicati očišćenje α-sinukleina i degradaciju autofagnog supstrata P62 i izvođenje neuroprotektivnog efekta.

Ključne reci: Parkinsonova bolest, MPTP,echinacoside, α-sinuklein, P62, autofagija, mTOR

Cistanche može liječiti Parkinsonovu bolest

Uvođenje

Parkinsonova bolest (PD)je hronična i progresivna neurodegenerativna bolest. Tipična patološka osobina PD(Parkinsonova bolest)je formiranje Lewy tijela, a α-sinuklein i ubikvitin su glavne komponente Lewy tijela. Sve više dokaza pokazuje da poremećaj regulacije autofagije na kraju dovodi do nakupljanja pogrešno presavijenih proteina i povrijeđenih organela.54 Autofagija-lizosomski put ne može samo degradirati proteine koji se ne mogu degradirati putem ubiquitin-proteasome već i put može degradirati α-sinuklein. Stoga, regulacija autofagije može osigurati novu strategiju za liječenje PD-a (Parkinsonova bolest). Autofagija je glavni put za degradaciju intracellularnih agregata, a mTOR kinaza je ključno regulatorno mjesto za autofagiju. Stoga je od teoretskog i praktičnog značaja elucidirati odnos između PD-a(Parkinsonova bolest) i autofagija regulisana putem signalizacije mTOR-a. Budući da degradacija α-sinukleina uglavnom zavisi od autofagija-lizosomskog sistema sa eliminisanjem abnormalnih proteina kao cilja, razvoj neuroprotektivnih lijekova u mogućnosti regulirati autofagiju može pružiti upute za liječenje neurodegenerativnih bolesti. ECH (Echinacoside) ima molekularnu formulu C35 H46 O20. To je glavna komponenta kineske medicine Cistanche fenilethanoid glikosides. Prvi put ga je izolovao Stoll et al iz korijenaEchinaceaAngustifolia DC.ECH (Echinacoside)ima širok spektar farmakološkog efekta. Ima anti-upalne, antioksidanse, zaštitu živaca, poboljšanje učenja i pamćenja, zaštitu jetri, regulaciju imunog sistema i anti-tumorske efekte. Sadašnja studija, počevši od srž patoloških mehanizama PD(Parkinsonova bolest), ima za cilj istraživanje regulacije neuroprotektivnih efekataECH (Echinacoside)u mišu PD(Parkinsonova bolest)model induciran MPTP-om iz autofagija-lizosomnog puta.

Materijali i aparati

Eksperimentalna životinja

Eksperimentalna grupa se sastoji od 108 muških miša C57BL/6J sa SPF razredom, star osam sedmica, težak 20–22 g, četiri miša po kavezu, čuvan na 22–25 °C. Miševe su obezbedili Šangajski centar za laboratorijske životinje, Kineska akademija nauka, koji je bio na Univerzitetu kineske medicine Nanjing, a životinje su dobijale humanu njegu prema nacionalnim institutima za zdravstvene smjernice, u prostoriji SPF razreda sa temperaturom od 22–25 °C, relativnom vlažnošću od 55%, i pod 12-satnim cirkadijanim ritmom. Miševi su bili slobodni da imaju hranu i vodu.

Glavni reagenti

MPTP (Sigma Company), miševi anti -TH monoklonsko antitelo (Sigma Company), Alexa Fluor 555 anti-zec antitelo (Biyuntian Institute of Biotechnology), Alexa Fluor 488 anti-zec antitijelo (Biyuntian Institute of Biotechnologija), HRP-kozje anti-zečje sekundarno antitijelo (Biyuntian Institute of Biotechnology), poliklonsko poliklonsko α- sinukleinsko antitijelo (Cell Signaling Technology Company), HRP-kozje sekundarno antitijelo (Biyuntian Institute of Biotechnology),ECH(Echinacoside) (Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), zečji anti-p-AKT (Ser473) protutijelo (Cell Signaling Technology Company), Rapamycin (Cell Signaling Technology Company), Hloroquine (Sigma Company), Wortmannin (Sigma Company), zečji poliklonski LC 3 antitijela (Abcam Company), zečje poliklonsko P62 antitijelo (Enzo Life Science Company), miševi monoklonsko β-aktinsko antitijelo (Santa Cruz Company), Beclin 1 poliklonsko antitijelo (Abcam Company).

Informacije o materijalima:

MPTP (America, Sigma Company), miševi anti-TH monoklonsko protutijelo (America, Sigma Company), zec poliklonsko α-sinukleinsko protutijelo (America, Cell Signaling Technology Company), HRP-kozje sekundarno protutijelo (Kina, Biyuntian Institute of Biotechnology),ECH(Echinacoside) (China, Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), rabbit anti-p-AKT (Ser473) antitijelo (America, Cell Signaling Technology Company), Rapamycin (America, Cell Signaling Technology Company), Chloroquine (America, Kompanija Sigma), Wortmannin (Amerika, Kompanija Sigma), zečje poliklonsko LC3 antitijelo (Amerika, Abcam Company), zečje poliklonsko P62 antitijelo (Amerika, Enzo Life Science Company), monoklonsko β-aktinsko protutijelo (Amerika, kompanija Santa Cruz), poliklonsko protutijelo Beclin 1 (Amerika, Abcam Company).

Echinacoside poslasticaParkinsonova bolest

Eksperimentalne metode

Grupisanje eksperimentalnih životinja

Miševi 108 C57BL/6J su nasumično podijeljeni u šest grupa, sa po 18 miša u svakoj grupi. Detalji su bili slijedeci: Normalna kontrolna grupa (normalna saline grupa, N grupa), grupa modela (MPTP grupa, M grupa),ECH(Echinacoside) grupa (MPTP +ECH (Echinacoside), EH grupa), inducirana autofagija grupa (MPTP + Rapamycin grupa, RA grupa), inhibitor autofagije A grupa (MPTP +ECH (Echinacoside)+ grupa hlorokina, CQ grupa), inhibitor autofagije B grupe (MPTP +ECH (Echinacoside)+ Wortmannin group, WO group). Doza MPTP je bila 30mg/kg/d, kontinuirano se ubrizgava 7 dana.ECH (Echinacoside) je dano pri 30mg/kg/d, intragastrijski administrirano.9

Modeliranje eksperimentalnih životinja i lijekova

N grupa i grupa EH dobili su normalnu otopinu iECH(Echinacoside) tri dana prije modelinga, odnosno do sedam dana nakon modelinga. Rapamicin,10 wortmannin,11, i hlorokin su dane sedam uzastopnih dana nakon posljednje injekcije MPTP. Doza ubrizgavanja repne vani rapamicina izračunata je kao 2mg/kg/d. Doza intraperitonealne injekcije hlorokina u miševe je bila 50mg/kg/d. Doza ubrizgavanja repne žile wortmannina u miševe je bila 0,7mg/kg/d (Dopunski snimak 1).

The Neurobehavioral Observations

Prema literaturi,12 sa manjom modifikacijom, samo-napravljeni uređaj za test na motki je bio kako slijedi: Uređaj je bio dug 55 cm, 1 cm u promjeru PV cijevi promjera 2 cm sferne projekcije na vrhu uređaja kao tačka pričvršćivanja za miševe. Uređaj je bio prekriven crnom trakom kako bi se spriječilo da miševi padnu. Svaki miš je bio na sferičnoj izbušivoj tački sa glavom na gore tokom testa. Zabilježeno je vrijeme od vrha placed bara do glave da se odbiju (T-turn) i ukupno vrijeme od vrha placed bara da se popne na dno cijevi do slijetanja (T-total).

Spontana aktivnost

Spontana aktivnost, poznata i kao aktivnost otvorenog polja, čest je pokazatelj za otkrivanje rijetke aktivnosti nakon povrede MPTP-a.13 U sadašnjoj studiji usvojen je sistem video analize eksperimenta na otvorenom polju. Specifične operacije su bile slijedece: Prije eksperimenta, cetiri miša iste grupe su stavili u okvir za promatranje (dužine 25 cm, širine 25 cm, i visine od

25 cm) da se prilagodi 30 minuta. Tada su snimani neprekidno 30 minuta. U 30-minutnom posmatračkom vremenskim prozoru broj vertikalnih kretanja (Rearing broj) je ubrojen odvojeno u tri prekidana intervala od pet minuta. Sistem video analize je automatski analizirao putanju aktivnosti miša i dobio 30-minutnu totalnu udaljenost (Total Distance) kao pokazatelj horizontalnog kretanja.

Analiza gaita

Analiza gaita: Prema literaturi,14 korišten je samo-napravljeni uređaj za analizu gaita. Ovaj uređaj je bio kako slijedi: Drveni hod (dužine 42 cm, širine od

4,5 cm i visina 12 cm), jedan kraj je bio otvoren, drugi kraj je doveo do kaveza vjeverica. Kavez za vjeverice je bio prekriven crnom krpom. Plava maљna je umoиila na dno miљje noge. Onda je miš bio stisnut na otvoreni kraj šetališta. Miš se prirodno preselio na kraj kaveza vjeverica koji je bio prekriven crnom krpom. Tri najduža putanja i zadnji koraci udova su izmjereni, a prosječne vrijednosti su uzete.

The Rotarod Test

Miš je bio položen na rotarod promjenjive brzine, s tim da je brzina rotaroda podešena da se poveća sa četiri metka/minute na 40 metaka/minuta u roku od pet minuta. Vrijeme od početka rotacije rotaroda do pada miša iz rotaroda svaki put je zabilježeno kao latencija pada. Determination of the Contents of Monoamine Neurotransmitters in the Striatum by High-Performance Liquid Chromatography Electrochemistry Detection (HPLC-ECD)

Sampling i liječenje

Miševi su bili eutanaizirani, a striatum se brzo odvojio na ledu i vagao. Prema omjeru od 1 mL od 5% perklorične kiseline do 0,1 g mozga (mokra težina), primjerci svake grupe su stavili u staklo koje sadrži odgovarajuću zapreminu perklorične kiseline i homogenizirane u muljnu cijev. Homogenat je centrifugiran na niskoj temperaturi sa 13.000 r/min 20 minuta. Supernatant je uzet, i centrifugacija je ponovljena. Supernatant je bio stavimo u hladnjak niske temperature za daljnje otkrivanje. Uslovi za HPLC-ECD su bili kao što slijedi Couloehemlll 5300 elektrohemijski hromatografija je usvojena. Sredstva za otkrivanje su bila 5020 i 504 lb ćelije, sa hromatografskim kolonom MD-150 (3,0*150 mm; 3 um), mobilnom fazom MDTM-2, i osjetljivošću 2uA. Brzina protoka je bila postavljena na 0,6 mL/ min, potencijal elektrode je postavljen na 220mV, a temperatura kolone je bila postavljena na 30 °C. Volumen injekcije je bio 20 ul (prvi put razrijeđen deset puta).

The Contents of the Following Neurotransmitters Were Detected Dopamine (DA), Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC), High vanillic acid (HVA), Norepinephrine (NE), 5-Hydroxytryptamine (5-HT), 5-Hydroxyindoleacetic acid (5-HIAA). Imunofluorescentna mrlja TH- a, α-Synuclein, LC3 i p62 Miševi (n = 6 po grupi) su eutanazirani pod dubokom anestezijom (5% hloral hidrata) i parfemirani sa 0,9% natrijevog hlorida, a potom 4% paraformaldehida kroz lijevu srčanu komoru. Mozgovi su brzo uklonjeni i postfiksirani 24 sata, a zatim prebačeni u fosfat-baferirani salin (PBS) koji sadrži 30% sakroze na 4° C dok ne potonu. Tkivo je bilo ugrađeno u parafin, a koraljni dijelovi (30 μm) su presjekli kroz tvar nigra pars compacta (SNc; −2,8 do −3,8 mm caudal do bregme) pomoću sanjke micro- tome. Sekcije su devoksirane i hidratizirane, a endogena peroksidaža je ugašena sa 0,3% H2O2 30 minuta. Nakon toplotno izazvanog dohvaćanja antigena, slajdovi su inkubirali sa 0,5% Triton-X100 zatim 5% serumskog albumina od goveda po 30 minuta. Dijelovi su zatim inkubirali anti-α-sinukleinske antitijela, anti-TH antitijela, anti-LC3 antitijela, anti-p62 antitijela, i odgovarajuća fluorescentna sekundarna antitijela preko noći na 4° C. Nakon tri petominutnog pranja u PBS-u, sekcije su inkubirane u biotiniliranom sekundarnom antitijelu na jedan sat, a nakon toga avidin-biotin kompleks 30 minuta. Aktivnost peroksidaze vizualizirana je sa 3,3-diaminobenzidinom.

Detekcijaof Protein by Western Blot

SNc protein je ekstrahiran (n = 6 miševa po grupi), razdvojen koristeći 12-15% SDS–PAGE, i prebačen na PVDF membrane. Membrane su bile blokirane sa 5% nemasnog mlijeka 1,5 sata na sobnoj temperaturi i inkubirali su se antitijela protiv TH, α synuclein, p62, Beclin 1, LC3, p-AKT, AKT, p-mTOR, mTOR, i GAPDH na 4° C preko noći. Sljedećeg dana membrane su isprane tris-baferiranom otopinom koja sadrži 0,1% Tween 20 i hibridizirane sa odgovarajućim sekundarnim antitijela 1,5 sata. Proteini su vizualizirani pomoću pojačane kemiluminescence, a imunoreaktivni bendovi su analizirani sa softverom za analizu slike (Gel Doc 1000-UV; Bio-Rad, Richmond, CA) za izračun optičke gustine α-sinuclein i TH bendova normaliziranih na GADPH.

Informacije o antitijela: zec poliklonalni LC3 antitela: 1:1000. Zec poliklonalno P62 antitijelo: 1:1000. Beclin 1 poliklonalno protutijelo: 1:1000. Miševi anti TH mono-klonalna antitijela: 1:1000. Zec poliklonalno α-sinukleinsko protutijelo: 1:1000.

Promatranje Ultrastrukturu substantia Nigra transmission Electron Microscope

Miševi (n = 6 po grupi) su eutanaizirani sa 5% hloralnog hidrata i parfuzirani kroz lijevu klijetku sa ledeno hladnim PBS-om, a slijede 4% paraformaldehida i 1% glutaraldehida u PBS- u. Mozak je uklonjen i postfiksiran u 2,5% glutaraldehida na 4° C 6 sati. SNc je isječen u blokove od oko 1 mm3 i fiksiran u PBS sadrži- ing 2,5% glutaraldehida i očuvan na 4° C za daljnju obradu. Fragmenti su postfiksirani u 1% osmijum tetroksida u istom puferu, dehidrirani kroz ocjenjene alkohole, i ugrađeni u Epon 812 (Shell Chemical Co., Houston, TX). Ultrathin (50 nm) sekcije su izrezane pomoću ultramikrotoma, uprljane pomoću uranil acetata i olovnog citrata, i analizirane pod prijenosnim elektronskim mikro- opsegom (Leica TCS SP2CLSM, School of Medicine Electron Microscopy Center, Fudan University).

Statistička analiza

Svi podaci mjerenja u sadašnjoj studiji su izraženi u obliku sredstva ± standardnih grešaka, a statističku analizu obradio je GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA) softver. P<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" one-way="" analysis="" of="" variance="" (one-way="" anova)="" was="" used="" to="" test="" the="" statistical="" differences,="" and="" the="" comparison="" between="" multiple="" groups="" was="" analyzed="" by="" tukey’s="" multiple="" group="">

KLIKNITE OVDJE ZA II DIO.