Ehinakozid poboljšava hematopoetsku funkciju kod 5-FU-indukovanih mijelosupresivnih miševa
Mar 19, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Saisai Wang, et al
Abstract
Ciljevi:Cilj nam je bio da istražimo efekteechinacoside(ECH) uključenhematopoetskifunkcioniraju kod miševa s depresijom koštane srži 5-indukovane FU.
Glavne metode:In vitro, nakon stimulacije sa ECH, sposobnost proliferacije ćelija koštane srži (BM) i stromalnih ćelija koštane srži (BMSC) izvedena izmijelosupresijamiševi su procijenjeni CCK8 testom i morfologijom, respektivno. In vivo, 5-FU-indukovana mijelosupresija ili kontrolni miševi su intragastrično primijenjeni sa bilo ECH(ehinakozid)na 15 mg/kg ili jednaku zapreminu normalnog fiziološkog rastvora dnevno tokom 12 dana pre nego što su BM ćelije izolovane za ispitivanje ćelija koje formiraju kolonije. U međuvremenu, BMSC su kultivisane 4 nedelje pre nego što su ćelije posmatrane za obrazac rasta, supernatanti ćelijske kulture su sakupljeni za sekreciju GM-CSF pomoću ELISA, a RNK ćelija je ekstrahovana za EPO i GM-CSF RT-PCR. BM ćelije ili BMSC stimulisani sa ECH tokom 24 h ili 48 h sakupljeni su za ekstrakciju proteina i Western blot.
Ključni nalazi:ECH(ehinakozid)stimulirao je rast BM ćelija, ali ne i BMSC-a dobivenih od miševa tretiranih 5-FU. Intragastrična primjena ECH(ehinakozid)u 5-FU tretiranim miševima moglo bi povećati broj ukupnihhematopoetskiprogenitorske ćelije i GM progenitorne ćelije na nivo zdravih kontrolnih miševa, ali ne i BFU progenitorne ćelije. BMSC iz ECH-tretiranimijelosupresijamiševi su rasli snažnije i eksprimirali više GM-CSF, ali ne i EPO. ECH je aktivirao PI3K signalni put u 5-FU suprimiranim BM ćelijama.
značaj:ECH(ehinakozid)mogao poboljšatihematopoetskifunkcija koštane srži kod 5-FU-indukovanemijelosupresijamiševi. ECH(ehinakozid)može se smatrati alternativnom efikasnom terapijom za pacijente tokom kemoterapije ili transplantacije HSC.
Ključne riječi:Ehinakozid, hematopoetski, mijelosupresija, GM-CSF, PI3K signalni put
Echinacoside inCistanche
Uvod
Fluorouracil ili 5-FU je jedan od najpropisivanijih hemoterapeutskih agenasa za pomoćno i palijativno liječenje karcinoma [2,9,28]. To je analog uracila sa atomom fluora na poziciji C-5 umjesto vodonika i djeluje tako što ireverzibilno inhibira aktivnost timidilat sintaze i naknadno inhibira replikaciju DNK [20]. Leukopenija i atrofijahematopoetskiorgani su dvije dominantne toksičnosti povezane s 5-primjenama FU kod ljudi, miševa i svinja [15,17,22].Mijelosupresija, kao rezultat inhibitornih i citotoksičnih efekata nahematopoetskiprogenitorske ćelije [10] i oksidativni stres na koštanu srž [25], ograničava kliničku primjenu kemoterapije na bazi 5-FU.
Supresija koštane srži izazvana 5-FU rezultira smanjenjem ukupnog broja krvnih zrnaca. Posljedični klinički simptomi uključuju groznicu, anemiju i krvarenje, a tretmani uglavnom ovise o transfuzijama i dodacima faktora rasta [4]. Transfuzija može biti efikasna u obnavljanju crvenih krvnih zrnaca i trombocita, ali olakšanje je kratkotrajno i zahtijeva ponovljene tretmane. Faktori rasta uključuju eritropoetin, faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF) i faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF). Ovi faktori su prirodne hemikalije i mogu povećati performanse koštane srži [7,21], ali zahtijevaju novac i nisu korisni za stimulaciju rasta bijelih krvnih stanica. Alternativne efikasne terapije su tražene. Tradicionalna kineska medicina je dostupna opcija koja postaje sve popularnija [5]. U posljednjih nekoliko godina, mnoge studije su se fokusirale na efekte kineskih biljnih lijekova na prevenciju i liječenje hemoterapijemijelosupresija[33,35].
Echinacoside(ECH) (Slika 1) je feniletanoidno jedinjenje ekstrahovano iz tradicionalne kineske medicine Herba Cistanches koje se naširoko koristi kao sredstvo za promociju cirkulacije krvi, lijekove za nedostatak bubrega kao i neurodegenerativne bolesti [24]. ECH(ehinakozid)ima višestruke farmakološke aktivnosti regeneracije kostiju [18], antioksidacije [8,14,27], imunološke regulacije, neuroprotekcije i poboljšanja ponašanja [11,16]. Otkriven je i kao zaštitni agens protiv hepatotoksičnosti [32] i akutne ozljede pluća [34]. Trk receptori i nizvodni Trk-ERK put mogu biti uključeni u njegovu zaštitnu aktivnost neurona od oštećenja rotenona [36]. Uloga i novi mehanizmi ECH u promocijimijelosupresijarast ćelija koštane srži nije u potpunosti shvaćen. U ovoj studiji smo procijenili efekte ECH(ehinakozid)onhematopoetskifunkcioniraju kod miševa s depresijom koštane srži izazvane 5-FU in vitro i in vivo i srodnim mehanizmima.
Materijali i metode
Hemikalije i biohemije
Echinacosideje kupljen od Ronghe Medical Technology and Development Corporation (Šangaj, Kina) (čistoća veća ili jednaka 98 procenata, određeno HPLC) i rastvoren u DMSO. 5-FU je nabavljen od HaoRan Biotechnology Corporation (Šangaj, Kina). Metilcelulozni medijum sa rekombinantnim citokinima (MethoCult medijum) za ćelije miša nabavljen je od Stem Cell Technologies (Vancouver, Kanada).
cistanche bodybuilding
Životinje i eksperimentalni dizajn
Ženke miševa Balb/c bez specifičnih patogena, od 5- do 6- sedmica stare, težine između 15-18 g, kupljene su od Shanghai Laboratory Animal Company (SLAC, Šangaj, Kina). Miševi su držani u objektu za životinje na Univerzitetu Zhejiang, Kina. Eksperimenti na životinjama odobreni su od strane Komiteta za negu i upotrebu životinja Univerziteta Zhejiang i bili su u skladu sa Vodičem za njegu i upotrebu laboratorijskih životinja [1,31].
Miševima je intraperitonealno ubrizgana jedna doza od 200 mg/kg 5-FU da bi se uspostavila depresija koštane srži kako su opisali Choi EH et al. [6]. Za in vitro studiju, ćelije koštane srži (BM) i stromalne ćelije koštane srži (BMSC) su izolovane 2 dana nakon 5-FU injekcije. In vivo, miševi su nasumično podijeljeni u 4 grupe, 5-6 miševa u svakoj grupi (n=5-6): 5-FU/ECH grupa, 5-FU/kontrolna grupa, ECH(ehinakozid)grupa i kontrolna grupa. U 5-FU/ECH grupi, nakon 5-FU injekcije, miševi su dnevno hranjeni intragastrično sa ECH u dozi od 15 mg/kg dnevno tokom 12 dana. U 5-FU/kontrolnoj grupi, umjesto ECH(ehinakozid), miševima kojima je ubrizgana 5-FU primijenjena je jednaka količina normalnog fiziološkog rastvora. Za ECH grupu i kontrolnu grupu, ECH ili normalna fiziološka otopina je davana istom metodom miševima koji nisu tretirani 5-FU. Dvanaestog dana, miševi su eutanazirani i ćelije koštane srži su ekstrahovane za dalja istraživanja. Detaljnije, BM ćelije su pripremljene za ispitivanje ćelija koje formiraju kolonije (CFC), BMSC su za test proliferacije, a supernatanti ćelijske kulture BMSC su sakupljeni za GM-CSF ELISA i RNA BMSCs ekstrahovani za EPO i GM-CSF RT -PCR. Eksperimenti su ponovljeni 3 puta.
Priprema BM ćelija i BMSC
BM ćelije su pripremljene od jednoćelijskih suspenzija ekstrahovanih iz koštane srži miša. Ukratko, miševi su eutanazirani i natopljeni u etanolu 5 minuta. Ćelije su isprane iz medularnog kanala tibije i femoralne kosti ponovljenim ispiranjem 23-iglom za mjerenje i prosijane kroz sito za ćelije od 100 μm kako bi se dobile jednoćelijske suspenzije. Eritroidne ćelije koštane srži su lizirane kratkotrajnom inkubacijom (30 s) sa amonijum hloridnim puferom, nakon čega su usledili ponovljeni koraci ispiranja sa medijumom za kulturu. Viabilnost i broj ćelija određivani su metodom isključenja tripan plavog pomoću hemocitometra.
Za stvaranje BMSC-a, BM ćelije su ostavljene da rastu u jamicama TC-ploča 24 h, nakon uklanjanja ne-adherentnih ćelija i ponovljenog ispiranja medijumom za kulturu, adherentne ćelije su uzete kao BMSC.
Ćelije su kultivisane na 37 stepeni sa 5% CO2 u vlažnom inkubatoru u Dulbeccovom modifikovanom medijumu orla (DMEM) dopunjenom sa 10% toplotno inaktiviranim fetalnim goveđim serumom (FBS), penicilinom/streptomicinom (100 U/ml) i L-glutaminom. (2 nM). Svi reagensi za kultivaciju ćelija kupljeni su od Invitrogena (Šangaj, Kina).
In vitro proliferacija BM ćelija pomoću CCK8 testa
BM ćelije miševa tretiranih 5-FU su postavljene u gustinu od 1 × 103 ćelije/jažici u 96-jažicu (Costar) i uzgajane u mediju dopunjenom različitim koncentracijama ECH(ehinakozid)({{0}} μM, 0,1 μM, 1 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, respektivno). Trećeg ili šestog dana ćelije su "pulzirane" sa 20 ul reagensa rastvora CCK{10}} (Beyotime, Jiangsu) i kultivisane dodatna 4 h. Proliferacija ćelija je analizirana merenjem kolorimetrijskog CCK8 na ultra čitaču mikroploče (Molecular Devices) na 450 nm.
Echinacoside inCistanche
In vitro proliferacija i morfologija BMSC
BMSC-ovi su pripremljeni u jamicama 6-ploče sa početnom gustinom BM ćelija (također od miševa tretiranih 5-FU) 3,5 × 106 ćelija/jažici. Nakon 24 h, medijum za kulturu je zamenjen medijumom koji sadrži ECH (50 ug/ml). Svake nedelje, polovina supernatanata je uklonjena i zamenjena svežom podlogom za kulturu (sa ili bez ECH(ehinakozid)kako je naznačeno). Nakon 4 sedmice kulture, morfologija BMSC je uočena pod invertnim mikroskopom.
Ispitivanje ćelija koje formiraju kolonije (CFC).
CFC test u MethoCult mediju je izveden prema uputama proizvođača. Ukratko, BM ćelije iz različitih grupa miševa pripremljene su u količini od 2 × 105 po ml. Nakon toga, 0,4 ml ćelija je dodato u 4 ml MetoCult medijuma da bi se napravila mešavina ćelija. Nakon temeljitog miješanja sa 16-iglom s tupim krajem, 1,1 ml mješavine ćelija je raspoređeno u posudu za kulturu od 35 mm (Stem Cell Technologies), utrostručeno i inkubirano na 37 stepeni u vlažnoj atmosferi od 5 posto CO2 za 7 dana. Nakon 7 dana kulture, identificirane su i prebrojane kolonije koje se sastoje od najmanje 30 ćelija.
Lančana reakcija reverzne transkriptaze-polimeraze (RT-PCR) i GM-CSF ELISA
BMSC izvedeni iz različitih grupa miševa uzgajani su 4 sedmice kao što je gore opisano. Nakon 4-nedeljne kulture, BMSC-ovi su sakupljeni za ekstrakciju ukupne RNK sa kompletom RNAsimple Total RNA (TianGen, Peking). Prvi lanac cDNK je sintetiziran korištenjem 1 ug ukupne RNK (tretirane Dnazom) korištenjem iScript kompleta za sintezu cDNA (Bio-Rad, Richmond, CA). Ekspresije faktora stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF) i eritropoetina (EPO) identifikovane su semi-kvantitativnom RT-PCR. Sekvence PCR prajmera bile su sljedeće: GM-CSF: 5′-GGCCTTGGAA GCATGTAGAGG-3′ (naprijed) i 5′-GGAGAACTCGTTAGAGACGA CTT-3′ (obrnuto); EPO: 5′-CCTCATCTGCGACAGTCG AG-3′ (naprijed) i 5′-ACAACCCAT CGTGACATTTTCT-3′ (nazad); gen za održavanje beta-aktina: 5′-GTATCCTGACCCT GAAGTACC-3′ (naprijed) i 5′-TGAA GGTCTCAAACATGATCT-3′ (obrnuto). PCR amplifikacija je izvedena na 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems) i proizvodi su analizirani pomoću elektroforeze u agaroznom gelu. Nivoi ekspresije mRNA meta su normalizovani na nivo beta-aktina. Supernatanti BMSC su sakupljeni za GM-CSF ELISA test korišćenjem GM-CSF ELISA kompleta (JinSui, Šangaj) prema uputstvima proizvođača.
Western blotting
BM ćelije i BMSC iz 5-FU induciranemijelosupresijamiševi ili kontrolni miševi su postavljeni na pločice sa početnom gustinom od 5 × 106 po jažici u 6-ploče. Nakon 24 h, ECH je dodan u mediju kulture pri 50 ug/ml i ćelije su ostavljene da rastu dodatnih 24 h ili 48 h prije nego što su ćelije lizirane u 1× RIPA puferu (CST, Danvers, MA) koji sadrži 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida (PMSF). Koncentracija proteina određena je testom BCA proteina. 30 ug ukupnih proteina je podvrgnuto elektroforezi na 10 posto natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gelovima i prebačeno na PVDF membrane (Millipore, MA, SAD). Membrane su blokirane puferom za blokiranje ((Beyotime, Haimen, Kina) 1 h na 37 stepeni, a zatim inkubirane preko noći na 4 stepena sa antitelima protiv -aktina (#4967, CST), fosfo-PI3 kinaze p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) (#4228, CST), phospho-Akt (Ser473) (#4060, CST), Akt (pan) (C67E7) (#4691, CST), phosphor-Stat1 (Tyr701) (#9167, CST), Phospho-Stat3 (Tyr705) (#9415, CST), Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)(#9215, CST), Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204, #ST ), p38 MAPK(#9212, CST), p44/42 MAPK (Erk1/2)(#4695, CST), Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185)(#4668, CST) i SAPK/JNK(# 9258, CST), nakon ispiranja, membrane su ispitane sa kozjim anti-zečjim sekundarnim antitelom kozjim anti-zečjim antitelom kozjim hrenom (Lianke, Hangzhou, Kina) nakon čega je detekcija signala sa FluorChem E sistemom (Protein Simple, Santa Clara, CA, SAD).
Statistička analiza
Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM. Značajnost razlika između svake grupe određena je Studentovim t-testom. P-vrijednost b 0.05 se smatra statistički značajnom.
cistanche bodybuilding
Rezultati
ECH isporučen in vitro(ehinakozid)stimuliše 5-FU potisnutu proliferaciju BM ćelija
BM ćelije iz 5-FU induciranemijelosupresijamiševi su tretirani sa ECH(ehinakozid)u različitim koncentracijama u rasponu od 0.01 do 50 μM tokom 3 dana ili 6 dana, a proliferacija ćelija je procijenjena CCK8 testom. Kao što je prikazano na slici 2, nivo proliferacije ECH-tretiranih BM ćelija bio je viši od ECH-netretiranih ćelija i nakon 3 ili 6 dana kulture. Efekat stimulacije pokazao je način ovisan o dozi.
ECH isporučen in vitro(ehinakozid)nema efekta na 5-FU potisnutu proliferaciju BMSC
BMSC-ovi iz 5-FU induciranimijelosupresijamiševi su tretirani sa ECH(ehinakozid)pri koncentraciji od 50 ug/ml tokom 4 nedelje, a proliferacija ćelija je procenjena posmatranjem ćelijske morfologije pod svetlosnim invertnim mikroskopom. Kao što je prikazano na slici 3, obrazac rasta i morfologija ćelija bili su slični sa ili bez tretmana ECH.
Intragastrično primijenjen ECH(ehinakozid)stimuliše hematopoetsku funkciju 5-FU indukovanih mijelosupresivnih granulocit-makrofaga (CFU-GM), ali ne i eritroidnih (BFU-E) progenitornih ćelija
Obrasci proliferacije i diferencijacije BM ćelija iz 5-FU/ ECH, 5-FU/kontrola, ECH(ehinakozid), a kontrolna grupa je procijenjena CFC testom. Nakon 7 dana kulture BM ćelija u MethoCult medijumu, CFC su klasifikovani i pobrojani in situ pod svetlosnim mikroskopom. Kao što je prikazano na slici 4, analiza nivoa progenitora otkrila je značajan (pb 0.0001) povećan broj CFU-GM u 5-FU/ECH grupi u poređenju sa 5-FU/kontrolnom grupom (169,3 ± 11,1 naspram 54,5 ± 3,1), kao i kontrolnom grupom (169,3 ± 11,1 naspram 129,3 ± 5,6) (pb 0,05, respektivno). Broj BFU-E u svakoj grupi nije imao razlike (73,0 ± 11,1 naspram 74,7 ± 8,6 naspram 91,2 ± 5,5). Broj CFU-GM i BFU-E u ECH grupi bio je skoro isti kao u kontrolnoj grupi (podaci nisu prikazani).
Slika 4. Intragastrično primijenjen ECH(ehinakozid)stimulišehematopoetskifunkcija 5-FU indukovanemijelosupresijagranulocitno-makrofagne (CFU-GM), ali ne i eritroidne (BFU-E) progenitorne ćelije. (A) Reprezentativna slika jedinica koje formiraju kolonije. CFU-GM: jedinice koje formiraju kolonije-makrofag granulocita. BFU-E: jedinica za formiranje praska-eritroid. (B) Reprezentativne slike jedinica koje formiraju kolonije svake grupe. (C) Broj jedinica koje formiraju kolonije svake grupe. BM ćelije su izolovane iz svake grupe i zasijane za CFU-GM i BFU-E test formiranja kolonije ćelija potomaka kao što je opisano u Materijalima i metodama. Rezultati su dobijeni iz 3 nezavisna eksperimenta i izraženi kao srednja vrijednost ± SEM, n=5–6. * pb 0.05 u poređenju sa kontrolnom grupom, ## pb 0,0001 u poređenju sa 5-FU grupom.
Intragastrično primijenjen ECH(ehinakozid)stimuliše 5-FU indukovanu mijelosupresiju BMSC proliferaciju.
Nakon 4 sedmice kulture, proliferacija BMSC je procijenjena posmatranjem ćelijske morfologije pod svjetlosnim invertiranim mikroskopom. Kao što je prikazano na slici 5, BMSC u 5-FU/ECH(ehinakozid)grupa je rasla snažnije od kontrolne grupe.
Intragastrično primijenjen ECH(ehinakozid)stimulira proizvodnju GM-CSF-a 5-FU indukovanih mijelosupresivnih BMSC-a
Nakon 4 sedmice kulture BMSC, ekspresija mRNA GM-CSF i EPO ćelija određena je RT-PCR. Kao što je prikazano na slici 6A, ekspresija GM-CSF u BMSCs kod miševa za supresiju koštane srži tretiranih ECH bila je značajno povećana u poređenju sa 5-FU/kontrolnom grupom. Proizvodnja GM-CSF-a u supernatantima ćelijske kulture određena je ELISA-om. Kao što je prikazano na slici 6B, u poređenju sa 5-FU/ kontrolnom grupom, 5-FU/ECH(ehinakozid)grupa je pokazala veću ekspresiju GM-CSF (pb 0.05) i bila je skoro ista kao i kontrolna grupa.
ECH(ehinakozid)aktivira PI3K signalni put u 5-FU suprimiranim BM ćelijama
BM ćelije i BMSC iz 5-FU induciranemijelosupresijaili kontrolni miševi su stimulirani sa ECH(ehinakozid)u koncentraciji od 50 ug/ml tokom 24 h ili 48 h pre nego što su ćelije sakupljene za ekstrakciju proteina i Western blot. Pošto su mehanizmi ECH(ehinakozid)nisu mnogo proučavani, pregledali smo panel povezanih signalnih puteva, uključujući JAK/STAT1, JAK/STAT3, SAPK/JNK, p-38 MAPK, p44/42 MAPK i PI3K/Akt signalne puteve. Kao što je prikazano na slici 7, ECH bi mogao inducirati visoku ekspresiju p-PI3K p85/p55 u BM ćelijama izvedenim od 5-FU miševa za koje indukcija nije bila očigledna u BMSC ili u kontrolnim grupama. Za sve ostale puteve nismo uočili velike razlike (podaci nisu prikazani).
Diskusija
Činilo se da je ECH(ehinakozid)nije imao efekta na miševe sa normalnom hematopoezom, jer za miševe bez 5-FU tretmana, broj hematopoetskih progenitornih ćelija u ECH(ehinakozid)grupa je bila skoro ista kao i ona u kontrolnoj grupi, kao i proliferacija i aktivacija BMSC-a na što ukazuje morfologija, GM-CSF i EPO sekrecije. Dakle, u sesiji rezultata, podaci iz ECH-a(ehinakozid)grupe su kombinovane sa kontrolnom grupom i opisane kao kontrolna.
5-FU kao hemoterapijski lijek u liječenju raka ima utjecaja na funkciju koštane srži. Upotreba visokih doza 5-FU može uzrokovati ozbiljnu supresiju koštane srži [19]. U našoj studiji, model supresije koštane srži uspješno je uspostavljen kod miševa tretmanom 5-FU, što je podržano smanjenim jedinicama koje formiraju kolonije i morfologijom BMSC-a.
Koštana srž je glavnahematopoetskiorgan sastavljen od hematopoetskih matičnih ćelija (HSC) i stromalnih ćelija koštane srži (BMSC) [13]. Prve ćelije mogu proizvoditi krvna zrnca uključujući crvena zrnca, trombocite, monocite, granulocite i limfocite. Potonje ćelije mogu proizvoditi masnoću, hrskavicu i kosti koje su definirane kao mezenhimalne ili stromalne stanice [26]. Dobro je prihvaćeno da su BMSC ključne komponente HSC niše u kojoj se ove dvije populacije matičnih ćelija blisko slažu.hematopoetskii skeletnu homeostazu [29]. BMSC bi mogli stimulirati i pojačati proliferaciju HSC-a izlučivanjem regulatornih molekula i citokina, kao što su FL [23], GM-CSF [12] i SCF [12,3].
In vitro podaci su pokazali da ECH(ehinakozid)može stimulirati proliferaciju BM stanica izmijelosupresijamiševi na način ovisan o dozi, iako su, generalno, ćelije rasle snažnije 3. dana nego 6. dana, vjerovatno kao rezultat okruženja kulture in vitro. Naprotiv, ECH(ehinakozid)nije imao efekta na proliferaciju BMSC kod miševa tretiranih 5-FU. Da bismo isključili mogućnost da negativni efekat nije bio posledica stanja ćelija, u eksperimentalno okruženje smo uključili i Rg1, biljnu komponentu za koju je dokazano da stimuliše BMSC izmijelosupresijarast miševa, kao pozitivna kontrola [33].
Podaci in vivo su dokazali da ECH(ehinakozid)mogao efikasno rekonstruisati hematopoezu, najvjerovatnije granulocitopoezu i megakariocitopoezu, ali ne i eritropoezu, umijelosupresijamiševi. Intragastrična primjena ECH(ehinakozid)do 5-FU tretiranih miševa tokom 12 dana rezultiralo je povećanim brojem obahematopoetskiprogenitorske ćelije i progenitorne ćelije granulocita-makrofaga, ali ne i eritroidne progenitorne ćelije kao što je naznačeno brojem CFU-GM i BFU-E iz CFC testova. Zanimljivo je da smo primijetili da je broj CFU-GM u 5-FU/ECH(ehinakozid)grupa je čak bila veća od one u kontrolnim grupama. Nagađali smo o brzoj ekspanziji CFU-GM koja se dogodila kao kompenzacija zamijelosupresijastanje koje vodi 5-FU. Naši podaci su također otkrili da ECH može stimulirati proliferaciju BMSC i GM-CSF, ali ne i proizvodnju EPO umijelosupresijamiševa, koji su bili u skladu sa rezultatima CFC.
Dosadašnji rezultati su ukazali na novi način ECH(ehinakozid)koji bi se mogao iskoristiti za njegovo poboljšanjehematopoetskifunkcija umijelosupresijamiševi (kao što je prikazano na slici 8): U okruženju niše HSC, bilo miješanom BM kulturom in vitro ili u koštanoj srži in situ, ECH stimulira proliferaciju BMSC i proizvodnju GM-CSF, tako stimulira i pojačava proliferaciju i diferencijaciju HSC-ova. Bez postojanja HSC, ECH nije u stanju da stimuliše proliferaciju BMSC.
GM-CSF receptor se sastoji od (vezivanje liganda) i (signalizirajuće) podjedinice. GM-CSF se prvo vezuje za podjedinicu, a zatim indukuje nizvodne signalne kaskade kroz interakciju efektorskih proteina sa podjedinicom [30]. podjedinica transaktivirana JAK2, koja inicira nizvodnu signalizaciju. Aktivirani signalni moduli uključuju Janus kinazu/pretvornik signala i aktivator transkripcije (JAK/STAT), put protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK) i put fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K) [30]. Zanimljivo je da je rezultat našeg skrininga pokazao da je PI3K put aktiviran u BM ćelijama izvedenim od 5-FU-tretiranih miševa, ali nije bio očigledan u 5-FU potisnutim BMSCS i normalnim BM ćelijama ili BMSC. Vjerovatno je da preko aktivacije GM-CSF/PI3K puta, ECH(ehinakozid)selektivno stimulira rast BM stanica.
Zaključci
Ukratko, pokazali smo da ECH(ehinakozid)ima obećavajući promotivni efekat nahematopoetskifunkcioniraju kod miševa za supresiju koštane srži izazvane FU, posebno na granulocitnim i makrofagocitnim stanicama, što sugerira da ECH(ehinakozid)mogu imati potencijal za kliničku primjenu u inhibiciji koštane srži tijekom kemoterapije ili transplantacije HSC nakon liječenja hemikalijama.
Izjava o sukobu interesa
Nema sukoba interesa.
Reference
[1] ESD Alleva, Vodič za njegu i korištenje laboratorijskih životinja, Ethology 103 (1997) 1072–1073.
[2] J. Bergh, T. Wiklund, B. Eriksen, E. Lidbrink, H. Lindman, P. Malmstrom, et al., Prilagođeni fluorouracil, epirubicin i ciklofosfamid u poređenju sa visokim dozama hemoterapije podržane srži kao pomoćnim tretmanom za visokorizični rak dojke: randomizirano ispitivanje. Studija Scandinavian Breast Group 9401, Lancet 356 (2000) 1384–1391.
[3] A. Bernstein, L. Forrester, AD Reith, P. Dubreuil, R. Rottapel, The murine W/c-kit and steel loci and the control of hematopoiesis, Semin. Hematol. 28 (1991) 138–142.
[4] PJ Carey, Lekovimijelosupresija: dijagnostika i upravljanje, Drug Saf. 26 (2003) 691–706.
[5] F. Cheung, TCM: proizvedeno u Kini, Nature 480 (2011) S82–S83.
[6] EH Choi, HE Ok, Y. Yoon, BA Magnuson, MK Kim, HS Chun, Zaštitni efekat ekstrakta borovnice bogatog antocijaninom (Vaccinium myrtillus L.) protiv mijelotoksičnosti izazvane 5-fluorouracilom, BioFactors ( Oxf. England) 29 (2007) 55–65.
[7] J. Crawford, H. Ozer, R. Stoller, D. Johnson, G. Lyman, I. Tabbara, et al., Redukcija groznice i neutropenije izazvane kemoterapijom kod pacijenata sa malim granulocitom koji stimulira koloniju granulocita, ćelija raka pluća, N. Engl. J. Med. 325 (1991) 164–170.
[8] L. Dalby-Brown, H. Barrett, AK Landbo, AS Meyer, P. Molgaard, Sinergistički antioksidativni efekti alkamida, derivata kafeinske kiseline i frakcija polisaharida iz Echinacea purpurea na in vitro oksidaciju ljudskih lipoproteina niske gustine, J. Agric. Food Chem. 53 (2005) 9413–9423.
[9] WH de Vos tot Nederveen Cappel, HJ Meulenbeld, JH Kleibeuker, FM Nagengast,
FH Menko, G. Griffioen, et al., Preživljavanje nakon adjuvantnog 5-FU tretmana za stadijum III raka debelog crijeva u nasljednom nepolipoznom kolorektalnom karcinomu, Int. J. Cancer 109 (2004) 468–471.
[10] LE Friberg, MO Karlsson, Mehanistički modeli zamijelosupresija, Investig. Nove droge 21 (2003) 183–194.
[11] X. Geng, X. Tian, P. Tu, X. Pu, Neuroprotektivni efektiechinacosideu mišjem MPTP modelu Parkinsonove bolesti, Eur. J. Pharmacol. 564 (2007) 66–74.
[12] JY Han, RY Goh, SY Seo, TH Hwang, HC Kwon, SH Kim, et al., Kotransplantacija krvi iz pupkovinehematopoetskimatične ćelije i kulturom proširene i GM-CSF-/SCF- transficirane mezenhimske matične ćelije kod SCID miševa, J. Korean Med. Sci. 22 (2007) 242–247.
[13] EL Herzog, L. Chai, DS Krause, Plastičnost matičnih ćelija dobijenih iz srži, Blood 102 (2003) 3483–3493.
[14] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, et al., Metabolism ofechinacoside, dobar antioksidans, kod pacova: izolacija i identifikacija njegovih bilijarnih metabolita, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 431–438.
[15] S. Kojima, K. Takaba, N. Kimoto, T. Takeda, M. Kakuni, M. Mizutani, et al., Zaštitni efekti glutationa na 5--induciran fluorouracilmijelosupresijakod miševa, arh. Toxicol. 77 (2003) 285–290.
[16] R. Kuang, Y. Sun, W. Yuan, L. Lei, X. Zheng, Zaštitni efektiechinacoside, jedan od feniletanoidnih glikozida, na citotoksičnost izazvanu H(2)O(2) u PC12 ćelijama, Planta Med. 75 (2009) 1499–1504.
[17] JC Laurenz, M. Hadžisavas, GW Chovanec, FW Bazer,Mijelosupresijakod svinja (Sus scrofa): uteroferin smanjuje mijelosupresivne efekte 5-fluorouracila kod mladih svinja, Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 116 (1997) 369–377.
[18]
F. Li, Y. Yang, P. Zhu, W. Chen, D. Qi, X. Shi, et al.,Echinacosidepromovira regeneraciju kostiju povećanjem omjera OPG/RANKL u MC3T3-E1 ćelijama, Fitoterapia 83 (2012) 1443–1450.
[19] A. Lindner, D. Santilli, J. Hodgett, C. Nerlinger, Efekti 5-fluorouracila nahematopoetskisistem miša, Cancer Res. 20 (1960) 497–502.
[20] DB Longley, DP Harkin, PG Johnston, 5-fluorouracil: mehanizmi djelovanja i kliničke strategije, Nat. Rev. Cancer 3 (2003) 330–338.
[21] BR Luce, JW Singer, JM Weschler, CD Buckner, SH Sheingold, K. Shannon-Dorcy, et al., Rekombinantni humani faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga nakon autologne transplantacije koštane srži za limfoidni karcinom: ekonomska analiza randomizirano, dvostruko slijepo, placebom kontrolirano ispitivanje, PharmacoEconomics 6 (1994) 42–48.
[22] M. Malet-Martino, R. Martino, Kliničke studije tri oralna prolijeka 5-fluorouracila (kapecitabin, UFT, S-1): pregled, Oncologist 7 (2002) 288–323 .
[23] S. Mishima, A. Nagai, S. Abdullah, C. Matsuda, T. Taketani, S. Kumakura, et al., Efektivna ex vivo ekspanzijahematopoetskimatične ćelije koje koriste osteoblast diferencirane mezenhimske matične ćelije zavisne su od CXCL12, Eur. J. Haematol. 84 (2010) 538–546.
[24] M. Mostafa, N. Nahar, M. Mosihuzzaman, T. Makhmoor, MI Choudhary, AU Rahman, Feniletanoid glikozidi za uklanjanje slobodnih radikala iz Leucas indica Linn, Nat. Prod. Res. 21 (2007) 354–361.
[25] S. Numazawa, K. Sugihara, S. Miyake, H. Tomiyama, A. Hida, M. Hatsuno, et al., Moguća uključenost oksidativnog stresa u 5--posredovanu fluorouracilommijelosupresijakod miševa, Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 108 (2011) 40–45.
[26] DJ Prockop, Stromalne ćelije srži kao matične ćelije za kontinuirano obnavljanjenehematopoetskitkiva i kao potencijalni vektori za gensku terapiju, J. Cell. Biochem. (1998) 284–285.
[27] BD Sloley, LJ Urichuk, C. Tywin, RT Coutts, PK Pang, JJ Shan, Poređenje hemijskih komponenti i kapaciteta antioksidansa različitih vrsta Echinacea, J. Pharm. Pharmacol. 53 (2001) 849–857.
[28] C. Twelves, A. Wong, MP Nowacki, M. Abt, H. Burris III, A. Carrato, et al., Kapecitabin kao pomoćni tretman za stadijum III raka debelog creva, N. Engl. J. Med. 352 (2005) 2696–2704.
[29] M. Valtteri, A. Sorrentino, Doprinos mezenhimskih stromalnih stanica homeostazi, J. Cell. Physiol. 217 (2008) 296–300.
[30] L. van de Laar, PJ Coffer, AM Woltman, Regulacija razvoja dendritskih ćelija pomoću GM-CSF: molekularna kontrola i implikacije na imunološku homeostazu i terapiju, Blood 119 (2012) 3383–3393.
[31] JMBK Worley, M. Bloomsmith, K. Coleman, TL Koban, Osmo izdanje Vodiča za njegu i korištenje laboratorijskih životinja (2011); implikacije za upravljanje ponašanjem, Am. J. Primatol. 73 (2011) 98.
[32] Y. Wu, L. Li, T. Wen, YQ Li, Zaštitni efektiechinacosideo hepatotoksičnosti izazvanoj tetrahloridom ugljika kod pacova, Toxicology 232 (2007) 50–56.
[33] SF Xu, LM Yu, ZH Fan, Q. Wu, Y. Yuan, Y. Wei, et al., Poboljšanje ginsenoside Rg1 nahematopoetskifunkcija u ciklofosfamidu izazvanamijelosupresijamiševi, Eur. J. Pharmacol. 695 (2012) 7–12.
[34] Y. Zhang, J. Xing, T. Ai, T. Wen, L. Guan, J. Zhao, Zaštitaechinacosideprotiv akutne ozljede pluća uzrokovane oleinskom kiselinom kod pacova, slobodni radikal. Res. 41 (2007) 798–805.
[35] AB Zhao, B. Yu, XL Wu, KJ Cao, EQ Li, QM Li, et al., Zaštitni efekti namijelosupresijamiševi tretirani s tri različite formule klasične kineske medicine, Pharmacogn. Mag. 7 (2011) 133–140.
[36] M. Zhu, C. Lu, W. Li, Transient exposure toechinacosideje dovoljan da aktivira Trk signalizaciju i zaštiti neuronske ćelije od rotenona, J. Neurochem. 124 (2013) 571–580.
