Dio Ⅱ: Izolacija novih fenilpropanoidnih supstituiranih diglikozida iz cistanche salse vođena dereplikacijom i njihova inhibicijska aktivnost na proizvodnju NO u makrofagu
Mar 04, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
3-metilbutenilnu grupu, aglikonsku podstrukturu, sugerirale su COZY korelacije H-2 sa H-1a i H-1b i HMBC korelacije između H{{ 4}} i H-5 i olefinski ugljenici, na kC 120,7 (C-2) i 136,4 (C-3). Dva šećerna ostatka su utvrđena analizom NMR spektra i HPLC spektralnom analizom kiselog hidrolizata, sa uzorkom MS fragmenata. Njihova apsolutna konfiguracija je određena kao D-glukoza i L-ramnoza pomoću HPLC analize kiselog hidrolizata [17]. Ovi dijelovi šećera su definirani kao a-glukoza i a-ramnoza konstantama spajanja anomernih protona. Spektar 1H-1H COSY pokazao je sekvencijalne korelacije od H-13 do H-63 i od H-133 do H-633 (slika 4).
Proton glukoze pomjeren na niže na kH 4,70 (H-43) sugerirao je acil-supstituent na glukozi. Iz HMBC spektra, korelacija između H-43 i C-9333 je potvrdila položaj supstituenta kafeoila. HMBC korelacije između H-13 i C-1 (kC 64,5) i između H-33 (kH 3,68) i C-133 (kC 101,2) sugerirale su položaje svakog supstituenta . Shodno tome, struktura 6 je određena kao 3-metilbutenil-O- -L-ramnopiranozil-(1→3)-4-O-(E)-kafeoil- -D- glukoza-piranozid i nazvan cistansalside B.
Za Cistansalside C (12), smeđi amorfni prah, utvrđeno je da ima molekularnu formulu C26H38O13 pomoću ( plus )-HR-ESI-QTOF-MS, koji je pokazao maksimum na m/z 581,2213 [M plus Na] plus (izračunato za C26H38O13Na, 581.2205). Karakterističan ion na m/z 163 sugerirao je da u strukturi postoji supstituent kafeoila. Fragmentirani joni na m/z 325 i m/z 471 sugeriraju postojanje jedinice ramnoze i jedinice glukoze.
Poređenje NMR spektra od 12 sa onima za 6 pokazalo je da su oni slični osim strukture aglikona. U NMR spektru 12, dva parafinska ugljika na kC 38.0 (C-2) i 24,4 (C-3) su uočena umjesto dva olefinska ugljika na kC 12{{16 }}.7 (C-2) i 136.4 (C-3) u aglikonu 6. Zametne metilne grupe (kH 0.88) u aglikonu od 12 su pomaknute naviše u odnosu na H-4 i H-5 (kH 1,71 i 1,63) u aglikonu 6 (Tabela 2). Predloženo je da je aglikon od 12 3-metil butil grupa, što je potvrđeno 1H i COZY NMR spektrom. Pikovi 3-metil butil grupe su uočeni na 3,81 (1H, m, H-1a), 3,48 (1H, m, H-1b), 1,71 (1H, m , H-3), 1,44 (2H, m, H-2) i 0,88 (H-4, 5).
Dva ostatka šećera su potvrđena HPLC analizom kiselog hidrolizata i analizom NMR spektra, kao i uzorkom MS fragmenata. Apsolutne konfiguracije šećera su identifikovane kao D-glukoza i L-ramnoza pomoću HPLC analize kiselog hidrolizata [17]. A-glukozni dio i a-ramnozni dio potvrđeni su konstantama spajanja anomernih protona. 1H-1H COSY spektar pokazao je sekvencijalne korelacije od H-13 do H-53, od H-133 do H-333 i od H{{11} } do H-433 (slika 4).
Položaj supstituenata je potvrđen HMBC analizom. U HMBC spektru, korelacije između H-13 i C-1 (kC 67.2), između H-33 (kH 3.68) i C-133 (kC 101.2) i između Detektovani su H-43 (kH 4,70) i C{13}} (kC 165,7). Shodno tome, utvrđeno je da je struktura 12 3-metil butil-OaL-ramnopiranozil-(1→3)-4-O-(E)-kafeoil- -D-glukoza-piranozid i pod nazivom cistansalside C.
Za Cistansalside D (17), amorfni smeđi prah, utvrđeno je da ima molekularnu formulu C31H38O14 pomoću ESI-QTOF-MS visoke rezolucije pozitivnog moda, koji je pokazao vrh aduktivnog jona na m/z 657,2147 [M plus Na] plus (izračunato za C31H38O14Na, 657,2154). Fragmentirani joni uključujući [M plus H x Aglycone x Rha x Acetyl Glc] plus ion na m/z 147, [M plus H x Aglycone x Rha] plus ion na m/z 351 i [M plus H x Aglycone] plus jon na m/z 497 je također detektovan. Karakterističan ion na m/z 147 sugerirao je da je kumaroil supstituent prisutan u njegovoj strukturi. Fragmentirani joni na m/z 351 i m/z 497 sugeriraju postojanje ramnozne jedinice i glukozne jedinice supstituirane acetilom.
Cistansalside fromcistanche herb
13C-NMR spektar otkrio je prisustvo 31 atoma ugljika. Dva anomerna protona na kH 4,61 (1H, m, H-13) i 4,60 (1H, s, H{{10}}) uočena su u 1H i HSQC spektrima . 1H-NMR spektar je pokazao prisustvo metil grupe na 1,97 (3H, s, acetil-CH3), trans-olefina na kH 7,55 (1H, d, J=15,9 Hz, H{{). 25}}) i 6,34 (1H, d, J=15,9 Hz, H-8333) i dva para-supstituisana benzenska prstena na kH 7,53 (2H, d, J=6. 9 Hz, H-3333, 5333) i 6,79 (2H, d, J=6,9 Hz, H-2333, 6333)/ kH 6,98 (2H, d, J {{5 0}}.0 Hz, H-2, 6) i 6.65 (2H, d, J=8.0 Hz, H-3, 5) (Tabela 2) . Iz HMBC NMR spektra, korelacije između karbonilnog ugljika na kc 165,5 (C-9333) i H-8333 i između H-2333, 6333 i C-7333 (kc 145.4) sugerira (E)-kumaroil grupu. HMBC korelacija između pika metil protona i karbonilnog ugljika na kc 169,0 potvrdila je prisustvo acetilne grupe.
4-hidroksifenil grupa je predložena na osnovu HMBC korelacije između H-3, 5 i kvartarnih aromatičnih ugljika na kC 155,6 (C-4) i 128,6 (C-1) . Hidroksilovana etil grupa je potvrđena COZY NMR signalima na kH 2,66 (2H, t, J=6.1 Hz, H-7), 3,90 (1H, m, H-8a ) i 3,54 (1H, m, H-8b). HMBC korelacije između H-7 i C-1 (kC 128.6) i C-2, 6 (kC 129.7) sugerirale su 4-hidroksifeniletil grupu, kao podstrukturu aglikona.
Dva ostatka šećera, predložena iz uzorka MS fragmenata, ponovo su potvrđena HPLC analizom kiselog hidrolizata i NMR spektrom. D-glukoza i L-ramnoza su razjašnjene HPLC analizom kiselog hidrolizata [17]. A -glukozni dio i a-ramnozni dio su uspostavljeni konstantama spajanja anomernih protona. 1H-1H COZY spektar je pokazao sekvencijalne korelacije od H-13 do H-53 i od H-133 do H-633 (slika 4).
Iz 1H-NMR spektra, pomak H-23 (kH 4,69) i H-43 (kH 4,80) sugerira acil-supstituiranu poziciju na glukozi. Veze između glukoze i dvije acilne grupe potvrđene su korelacijama HMBC između H-43 (kH 4,80) i C-9333 i između H-23 i karbonilnog ugljika acetil grupe (kC 169,0 ). Položaji aglikona i ramnoze dati su korelacijama HMBC između H-33 (kH 3,95) i C-1333 i između H-8 i C-13. Shodno tome, struktura 17 je dodijeljena kao 4-hidroksifeniletil-2-O-acetil-O- -L-ramnopiranozil-(1→3)-4-O-(E)- kumaroil- -D-glukopiranozid i nazvan cistansalside D.
Cistansalside E (18) je izoliran kao amorfni smeđi prah. Njegova molekularna formula je određena kao C31H38O14 pomoću 13C-NMR podataka i vrha ESI-QTOF-MS visoke rezolucije pozitivnog moda na m/z 657,2166 [M plus Na] plus (izračunato za C31H38O14Na, 657,2154). Pored toga, detektovani su joni fragmenata uključujući kofeoil jon na m/z 163, [M plus H x Aglikone x Rha] plus jon na m/z 367 i [M plus H x Aglikon] jon na m/z 513. Fragmentirani joni sugeriraju postojanje jedinice ramnoze i glukozne jedinice supstituirane acetilom.
1H-NMR spektar ukazuje na prisustvo dva anomerna protona na kH 4,63 (1H, d, J=8.2 Hz, H-13) i 4,60 (1H, s, H-133 ) i dva acil-supstituirana protona glukoze na kH 4,71 (1H, dd, J=8,9, 8,2 Hz, H-23) i 4,81 (1H, dd, J=9,7 , 9,5 Hz, H-43). 1H i HMBC spektri sugeriraju postojanje acetilne grupe na kH 1,94 (3H, s, acetil-CH3), (E)-kafeoil dijela na kH 7,48 (1H, d, J=15},9 Hz, H-7333), 7.02 (1H, d, J=1.6 Hz, H-2333), 6.98 (1H, dd, J=8.1, 1.6 Hz, H-6333), 6.76 (1H,d, J=8.1 Hz, H-5333) i 6.21 (1H, d, J=15.9 Hz, H{ {67}}) i mono-supstituirani benzenski prsten na kH 7,29 (2H, m, H-3, 5), 7,21 (2H, m, H-2, 6) i 7,20 (1H, m, H-4) (Tabela 2). Fenilmetil grupa, aglikonska podstruktura, je sugerisana korelacijom HMBC između H-7 (2H, kH 2,80, m) i C-1 (kC 138,8) i između H-7 i C -2, 6 (kC 128.9) i COZY NMR signali H-7 sa H-8a (1H, kH 3.99, m) i H-8b (1H, kH 3,63, m).
Dva ostatka šećera su potvrđena HPLC analizom kiselog hidrolizata i analizom NMR spektra. Apsolutne konfiguracije šećera su razjašnjene HPLC analizom kiselog hidrolizata, za koje je potvrđeno da su D-glukoza i L-ramnoza [17]. A -glukozni i -ramnozni dio utvrđeni su konstantama spajanja anomernih protona. 1H-1H COSY spektar pokazao je sekvencijalne korelacije od H-13 do H-53, od H-133 do H-233 i od H{{11} } do H-333 (slika 4).
Iz HMBC spektra, korelacije između H{{0}} i C-8 (kC 69.4), između H-23 i karbonilnog ugljenika acetilne grupe (kC 169.1), između H-33 (kH 3,95) i C-133 (kC 102,0) i između H-43 (kH 4,81) i C-9333 (kC 165,6) potvrdili su položaj supstituenata u strukturu. Stoga je utvrđeno da je struktura 18 feniletil-2-O-acetil-OaL-ramnopiranozil-(1→3)-4-O-(E)-kafeoil- -D-glukopiranozid i pod nazivom cistansalside E.
Većina trans-cinamoil supstituenata je izomerizovana u cis-izoformu in vitro. Prijavljeno je da svjetlost pretvara derivate trans-cimetne kiseline u cis-izoforme [18,19]. Uočeno je da ravnoteža trans-cis konverzije cinamoilnih supstituenata održava približno 70 posto izolata u trans-izoformi. Za olefinske protone cis forme, dostiže maksimum na približno 6,90 ppm (d, J=12~13 Hz, H-7333) i 5,80 ppm (d, J=12~13 Hz, H-8333) su se mogli dodijeliti u 1H-NMR spektrima, dok su pikovi na približno 7,55 ppm (d, J=15.8 Hz, H-7333) i 6,40 ppm (d, J { {28}}.8 Hz, H-8333) su posmatrani za transformaciju [20]. U 1H-NMR spektru trans-cis mješavina, uočeni su pikovi za dva olefinska protona (H-7333 i H-8333) u odnosu 7:3 (trans:cis). 13C-NMR pikovi cis oblika bili su slični onima u transformaciji.
Djelotvorni sastojci iz cistanchea: akteozidi
Svi izolati su testirani na njihov inhibitorni efekat na LPS-indukovanu proizvodnju NO u RAO
Svi izolati su testirani na njihov inhibitorni efekat na LPS-indukovanu proizvodnju NO u ćelijama RAW 264.7. Deksametazon je korišten kao pozitivna kontrola i njegov IC50 je bio 7.0 uM. Od testiranih jedinjenja, jedinjenja 5 (IC50 42.7 o 6.6 uM), 11 (IC50 37.3 o 2.2 uM), 13 (IC50 40.{{2{{ 24}}}} o 4.0 uM) i 18(IC50 27.9 o 0,8 uM) pokazali su umjerenu inhibitornu aktivnost na inducibilnu NO sintazu, dok su ostala jedinjenja bila neaktivna u ovom testu (IC50 vrijednosti > 100 uM). Da bi se potvrdilo da li ova jedinjenja imaju citotoksičnost, izmerena je vitalnost ćelija korišćenjem MTT testa. Kao rezultat, nijedan od njih nije pokazao značajnu citotoksičnost (dodatna slika S6-1). Ova četiri jedinjenja su odabrana da se proceni njihova inhibitorna aktivnost protiv NF-λB puta u LPS-stimulisanim RAW 264.7 ćelijama. Stimulacija ćelija RAW 264.7 sa LPS-om je izazvala fosforilaciju I入B i NF-入B (p65) nakon 0,5 h inkubacije. Fosforilacija NF-入 B (p65) je značajno smanjena predtretmanom sa jedinjenjima 11, 13 i 18 kao što je prikazano Western blot analizom (Slika 5). Stoga, jedinjenja 11, 13 i 18 mogu ispoljiti antiinflamatorne efekte putem inhibicije NF-入B u makrofagima.
Slika 5.Učinak četiri jedinjenja na fosforilaciju I入B i NF-入B (p65) u LPS-stimuliranim RAW 264.7 ćelijama. (A) Western blotovi su sprovedeni u LPS i RAW 264.7 ćelijama tretiranim uzorkom; (B, C) Imunoblot signali su kvantifikovani korišćenjem softvera za denzitometriju Molecular Analyst/PC (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Izvještava se o denzitometrijskoj analizi fosforiliranih izoforma. NF-入 B u RAW 264.7 ćeliji je normalizovan na sadržaj -aktina.
3. Materijali i Metode
3.1. Opšti eksperiment Procedura
Optičke rotacije su mjerene digitalnim polarimetrom Jasco P-2000 (Jasco, Tokyo, Japan). UV spektri su snimljeni na spektrometru Chirascan plus Circular Dichroism (Chirascan, APL, UK). IR spektri su snimljeni pomoću Jasco FT/IR-4200 spektrofotometra. Masena spektrometrija kvadrupolne ionizacije sa elektrosprejom visoke rezolucije (HR-ESI-qTOF-MS) izvedena je na Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS opremljenom Agilent 1260 Infinity serijom (Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, Kalifornija, SAD), a korištena kolona je Jasco SFCpak Crest C18T-5 kolona (id 150 4.6 mm, 5 um). Za prikupljanje podataka korišten je softver MassHunter Workstation.
1D (1H i 13C) i 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) NMR spektri su dobijeni sa Jeol LA 300 (Jeol, Tokio, Japan), Bruker AVANCE-400, Bruker AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 i Bruker AVANCE 800 HD spektrometri u kombinaciji sa kriosondom (Bruker, Ettlingen, Njemačka). DMSO-d6 (Cambridge Isotop Laboratories, u Cistanche Andoveru, MA, SAD) je korišten kao NMR rastvarač i referentni pikovi (kH 2,50 i kC 39,5). Kromatografija na koloni (CC) je izvedena korištenjem Sephadex LH-20 (25–100 um; Pharmacia, Uppsala, Švedska) ili Kieselgel 60 silika gela (40–63 um, 230–400 mesh, Art. 9385; Merck, Darmstadt). , Njemačka). Tankoslojna hromatografija (TLC) je sprovedena na prethodno obloženim Kieselgel 60 silika gel F254 pločama (Art. 5715; Merck). Tačke na TLC detektovane su UV lampom na 254 nm i 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, Francuska). Tekuća hromatografija srednjeg pritiska (MPLC) izvedena je na RediSep 120 g fleš koloni od silicijum dioksida (Isco, Lincoln, NE, SAD) i Kiesegel 60 silika gelu (40–63 um, 230–400 mesh, Art. 9385; Merck) koristeći Combiflash pratilac (Isco). Sistem tečne hromatografije visokog pritiska (HPLC) bio je Gilson HPLC opremljen sa Gilson 321 pumpom i UV.VIS 151 detektorom (Gilson, Middleton, WI, SAD), koristeći polupreparativne ODS kolone (Luna 5 um C18 (2) 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, Kalifornija, SAD; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, Njemačka; Inno C1208 kolona Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Koreja). Analitički RP-HPLC sistem bio je Waters 2695 savezni sistem sa detektorom a996 Photodiode Array (PDA) (Waters Corp, Milford, MA, SAD), a korišćena kolona je bila Hypersil™ BDS C18 kolona (130 Å, id 150: 4.6 mm, 5 um, Thermo Scientific™). Mravlja kiselina je kupljena od Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Seul, Koreja). HPLC grade rastvarači su nabavljeni od Fisher Scientific Korea Ltd. (Seul, Koreja). H2SO4, Na2CO3 i prvoklasni rastvarači za ekstrakciju, frakcionisanje i izolaciju kupljeni su od Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Seul, Koreja). L- i D-cistein metil ester hidrohlorid i o-tolilizotiocijanat su kupljeni od Tokyo Chemical Industry (Tokio, Japan).
3.2. Plant Materijal
Cijele biljkeCistanche salsa, koji su prikupljeni od Shinjang Uyghura, uvezeni su preko Daerim Pharmaceutical Wholesale Company (Cheongju, Koreja). Identifikovao ih je prof. dr. Jehyun Lee (Dongguk Univerzitet, Seul, Koreja). Uzorak vaučera (SNUPH2016-03) deponovan je u Herbarijum vrta ljekovitih biljaka, Farmaceutski fakultet, Nacionalni univerzitet u Seulu.
3.3. Ekstrakcija i Izolacija
Osušene cijele biljkeCistanche salsa(5,7 kg) su usitnjeni i ekstrahovani tri puta sa MeOH (20 L) na sobnoj temperaturi uz obradu ultrazvukom tokom 99 min. Nakon uklanjanja rastvarača in vacuo, sirovi ekstrakt (1,35 kg) je suspendovan u H2O (5 L), zatim podeljen sa EtOAc (5 L). Ostatak EtOAc (55,3 g) je razdvojen u 16 frakcija (E01-16) hromatografijom na silika gelu eluiranjem sa CHCl3/MeOH (50:1–0:1, sistem stepena gradijenta).
E08 (611,7 mg) je podvrgnut tečnoj hromatografiji srednjeg pritiska na silika gelu (25 g) i eluiran sa CHCl3/MeOH (18:1–0:1, sistem stepenastog gradijenta) i dao 11 razlomaka (E08a-k). Iz E08g, jedinjenja 13 (0,7 mg) i 18 (0,6 mg) su pročišćena upotrebom Luna 5 um HPLC kolone i izokratskim eluiranjem sa 28 posto vodene otopine. MeCN. HPLC prečišćavanje (Hypersil GOLD, 25 posto vodeni MeCN) E08h (138,5 mg) dalo je jedinjenja 7 (10,6 mg), 8 (17,2 mg), 14 (13,4 mg) i 17 (4,9 mg).
E09 (1,15 g) je dalje pročišćen na koloni silika-MPLC (20 g) eluiranjem sa CHCl3/MeOH (10:1–0:1, korak- sistem gradijenta) da bi se dobilo 11 podfrakcija (E09a-k). E09e (398,7 mg) je podvrgnut Sephadex LH-20 (MeOH) i dao je osam subfrakcija (E09e1-8). E09e6 je zatim prečišćen korišćenjem Hypersil GOLD HPLC kolone (22 procenta vodene MeCN) da bi se dobilo jedinjenje 11 (0,4 mg). Iz E09e7, jedinjenje 5 (0,6 mg) je pročišćeno izokratskom elucijom iz Luna 5 um HPLC kolone sa 40 posto vodene otopine. MeOH.
E10 (1,20 g) je razdvojen na devet frakcija (E10ai) na Sephadex LH-20 koloni eluiranjem sa MeOH. Iz E10g (147,5 mg), jedinjenja 4 (13,4 mg), 9 (8,0 mg) i 15 (5,0 mg) izolovana su HPLC separacijom (Inno, 23 procenta vodene MeCN). Frakcija E10h (470,0 mg) je prečišćena na Hypersil GOLD koloni izokratskim eluiranjem (40 posto vodenog MeOH) da bi se dobila jedinjenja 1 (3,8 mg), 10 (42,1 mg) i 16 (3,0 mg).
E11 (2,96 g) je podvrgnut Sephadex LH-20 eluiranju sa MeOH da bi se dobilo devet frakcija (E11a-i). E11e je odvojen Sep-Pak C18 kartridžom eluirajući postupno sa 10 posto, 20 posto, 30 posto, 50 posto i 100 posto aq. MeOH da bi se dobilo sedam frakcija (E11e1-7), a zatim Luna 5 um HPLC (28 posto vodenog MeCN) da bi se dobila jedinjenja 3 (3,4 mg), 6 (1,4 mg) i 12 (1,2 mg).
E12 (19.0 g) podvrgnut je silicijum dioksidu MPLC (120 g) koristeći CHCl3/MeOH sistem stepenastog gradijenta da se dobije šest frakcija (18:1–0:1 , E12a-f). E12f je hromatografiran na Sephadex LH-20 koloni (MeOH), dajući sedam frakcija (E12f1-7). HPLC prečišćavanje (Hypersil GOLD, 25 posto vodeni MeCN) E12f7 dalo je jedinjenje 2 (3,3 mg). Svi rastvarači korišćeni za HPLC bili su 0,05 posto pufera mravlje kiseline. Uobičajena brzina protoka za HPLC i MPLC hromatografiju bila je 3 i 40 mL/min, respektivno.
3.4.Karakterizacija
Cistansalside A (5): smeđi amorfni prah; [ |20 x33,7 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 332 (3,18); IR (uredno) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) i 13C-NMR (200 MHz) podaci, vidi tabelu 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 645,2146 (izračunato za C30H38O14Na, 645,2154).
Cistansalside B (6): smeđi amorfni prah; [ |20 x72,9 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 333 (3,32); IR (uredno) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; 1H-NMR (500 MHz) i 13C-NMR (125 MHz) podaci, vidi tabelu 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 579,2054 (izračunato za C26H36O13Na, 579,2048).
Cistansalside C (12): smeđi amorfni prah; [ |20 x61,6 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 337 (3,25); IR (uredno) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) i 13C-NMR (200 MHz) podaci, vidi tabelu 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 581,2213 (izračunato za C26H38O13Na, 581,2205).
Cistansalside D (17): smeđi amorfni prah; [ |20 x51,1 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 221 (3,53), 315 (3,52); IR (uredno) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; 1H-NMR (400 MHz) i 13C-NMR (75 MHz) podaci, vidi tabelu 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 657,2147 (izračunato za C31H38O14Na, 657,2154).
Cistansalside E (18): smeđi amorfni prah; [ |20 x59,2 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 336 (3,22); IR (uredno) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) i 13C-NMR (200 MHz) podaci, vidi tabelu 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 657,2166 (izračunato za C31H38O14Na, 657,2154)
3.5.HPLC-QTOF-MS Analiza
Analiza hromatografsko-masenom spektrometrijom izvedena je na Agilent 1260 Infinity seriji LC sistemu (Agilent Technologies, Inc., SAD). Analitička kolona je bila SFCpak Crest C18T-5 kolona (id 15{{10}} : 4,6 mm, 5 um, Jasco, Japan). Mobilna faza se sastojala od 0.1 posto (v/v) mravlje kiseline u MeCN (A) i vode (B) korištenjem gradijentnog eluiranja od 0–35 min (23 posto A), 35–45 min ( 23–28 posto A), 45–75 min (28 posto A) i 75–80 min (90 posto A). Brzina protoka je održavana na 0,3 mL/min. Apsorbanca je izmjerena na 320 nm. Uslovi ESI izvora bili su sljedeći: brzina protoka gasa za sušenje (N2), 10 L/min; temperatura gasa za sušenje, 350 stepeni; nebulizator, 30 psig; protok gasa u omotaču, 12,0 L/min; temperatura gasa u omotaču, 350 stepeni; kapilarni, 4000 V; skimer, 60 V; oktapolni RF, 750 V; napon fragmentatora, 180 V; pozitivan mod. Sistem je radio pod softverom Masshunter radne stanice. Raspon mase je postavljen na m/z 50–1000.
3.6.Kiselina Hidroliza
Jedinjenja su hidrolizovana upotrebom 1 N H2SO4 (100 uL) zagrejana u vodenom kupatilu na 90 stepeni tokom 2 h, a zatim neutralizovana zasićenim vodenim rastvorom Na2CO3. Nakon što su rastvori osušeni u struji N2, proizvodi i standardni šećeri (D-Glc, L-Glc, L-Rha) su rastvoreni u piridinu (100 uL) koji sadrži L-cistein metil ester hidrohlorid (0,5 mg). Uzorak L-ramnoze je otopljen u piridinu (100 uL) koji sadrži D-cistein metil ester hidrohlorid (0,5 mg). Nakon toga su grijani na 60 stepeni 1 h. Rastvori su tretirani sa 1 uL (1,11 mg) o-tolilizotiocijanata, koji su ponovo zagrevani na 60 stepeni 1 h. Svaka konačna smeša je direktno analizirana analitičkom RP-HPLC (Hypersil™ BDS C18 kolona, 17 posto vodeni MeCN, 0,8 mL/min, 40 min, 35 stepeni). tR maksimuma na 21,9 i 40,4 minuta poklopio se sa onim za tiokarbamoil tiazolidin derivat D-glukoze i L-ramnoze, respektivno.
3.7. Cell Kultura
Mišji makrofagi, RAW 264.7, dobijeni su od Korejskog istraživačkog instituta za bionauku i biotehnologiju (Daejeon, Koreja) i uzgajani u RPMI mediju koji sadrži 10 posto fetalnog goveđeg seruma i 100 U/mL penicilin/streptomicin sulfata. Ćelije su inkubirane u vlažnoj atmosferi od 5 posto CO2 na 37 stepeni.
3.8. Droge i hemikalije
RPMI, penicilin i streptomicin su kupljeni od HyClone (Logan, UT, SAD). Goveđi serum albumin i LPS su nabavljeni od Sigme (St. Louis, MO, SAD).
3.9. Mjerenje proizvodnje NO
Koncentracija nitrita u mediju kulture je izmjerena kao indikator proizvodnje NO prema Griessovoj reakciji. Ćelije su zasijane u omjeru 2:105 ćelija/jažici u 96-ploče za kulturu jažica. Nakon pre-inkubacije ćelija RAW 264.7 u trajanju od 18 sati, ćelije su prethodno tretirane jedinjenjima (50 uM, 10 uM, 5 uM ili 1 uM) i stimulirane sa LPS (500 ng/mL) tokom 24 h. Ispitna jedinjenja rastvorena u DMSO. Ćelije su također tretirane sa 0,05 posto DMSO kao kontrola nosača. RAW 264.7 ćelije (2: 105 ćelija/bažirić) su kultivisane u 96-pločama sa rupicama koristeći RPMI bez fenol crvenog i prethodno tretirane uzorcima 0,5 h. Ćelijska proizvodnja NO je indukovana dodatkom 500 ng/mL konačne koncentracije LPS i inkubacijom od 24 sata. Nakon inkubacije, 100 uL kondicionirane podloge je pomiješano sa istom količinom Griessovog reagensa i inkubirano 15 minuta. Apsorbancija smeše na 540 nm merena je čitačem ELISA mikroploča (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Ričmond, Kalifornija, SAD). Dobijene vrijednosti su upoređene sa standardnim koncentracijama natrijum nitrita rastvorenog u RPMI i izračunate su koncentracije nitrita u kondicioniranoj sredini ćelija tretiranih uzorkom.
3.10.3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum bromid (MTT) test za vitalnost ćelije
Ćelije su posađene u {{0}} ploče sa gustinom od 5:104 ćelije/jažici i inkubirane sa podlogom bez seruma u prisustvu uzoraka. Ispitna jedinjenja rastvorena u DMSO. Ćelije su također tretirane sa 0,05 posto DMSO kao kontrola nosača. Nakon inkubacije od 24 h, dodano je 10 uL MTT (5 mg/mL u fiziološkom rastvoru) i inkubacija je nastavljena još 4 h. Mitohondrijska sukcinat dehidrogenaza u živim ćelijama pretvara MTT u vidljive kristale formazana tokom inkubacije. Kristali formazana su zatim rastvoreni u dimetil sulfoksidu i apsorbancija je izmerena na 540 nm korišćenjem čitača mikroploča za enzimski imunosorbentni test (ELISA) (Benchmark, Bio-Rad Laboratories). Izračunata je relativna vitalnost ćelija u poređenju sa apsorbancijom netretirane kontrolne grupe. Svi eksperimenti su izvedeni u tri primjerka.
3.11.Imunoblot analiza
Ekspresija proteina je procijenjena Western blottingom prema standardnim procedurama. Ukratko, ćelije RAW264.7 su uzgajane u posudama za kulturu od 6{{20}} mm (2: 106/mL), nakon čega je uslijedila prethodna obrada od 5{57} uM jedinjenja . Ćelije su dva puta isprane u ledeno hladnom PBS (pH 7,4), ćelijske pelete su resuspendirane u puferu za lizu na ledu 15 minuta, a ćelijski ostaci su zatim uklonjeni centrifugiranjem. Koncentracija proteina je određena korištenjem Bio-Rad reagensa za analizu proteina prema uputama proizvođača. Protein (20-30 ug) je pomiješan 1:1 sa 2: pufer za uzorke (20 posto glicerol, 4 posto SDS, 10 posto 2- ME, 0,05 posto bromofenol plavo i 1,25 M Tris [pH 6,8]), nanesene na 8 ili 15 posto SDS-PAGE gelove i rade na 150 V 90 min. Ćelijski proteini su prebačeni na Immunoblot poliviniliden difluoridne membrane (Bio-Rad) koristeći Bio-Rad polusuhi transfer sistem prema uputstvima proizvođača. Membrane su zatim inkubirane preko noći sa odgovarajućim p-NF-入B, NF-入B, pI入B i -actin primarnim antitijelima (Abcam, Cambridge, UK) u Tris puferiranoj fiziološkoj otopini koja sadrži 5 posto obranog mlijeka i 0,1 posto Tween-a 20. Sljedećeg dana, mrlje su isprane tri puta s Tris puferiranim fiziološkim rastvorom (0,1 posto Tween 20) i inkubirane 1 h sa HRP-konjugiranim sekundarnim anti-IgG antitijelom (razrijeđenim 1:2000–1 :20.000). Mrlje su ponovo tri puta isprane sa Tris puferovanim fiziološkim rastvorom (0,1% Tween 20), a imunoreaktivne trake su razvijene korišćenjem hemiluminiscentnog supstrata ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, SAD).
3.12.Statistička analiza
Eksperimentalni podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost o SEM. Nivo statističke značajnosti određen je analizom varijanse (ANOVA) praćeno Dunnettovim t-testom za višestruka poređenja.p Vrijednosti manje od 0.05 smatrane su značajnim.
Ekstrakt Cistanche salsa
4. Zaključci
U ovoj studiji izolovali smo i razjasnili strukture pet novih glikozida supstituisanih fenilpropanoidom, nazvanih cistansalside AE (5, 6, 12, 17 i 18), uz izolaciju i identifikaciju 13 poznatih jedinjenja, koristeći strategiju dereplikacije. Utvrđeno je da su poznata jedinjenja lipedozid AI (1) [21], 23-acetilakteozid (2) [22], izocistanozid C (3) [15], osmantuzid B (4) [21], epimeridinozid A ( 7) [15], cistanozid D (8) [23], salsaside B (9) [6], tubulozid E (10) [16], cistanozid M (11) [15], izomartinozid (13) [24], salsaside C (14) [6], jionoside C (15) [25] i salsaside F (16) [6]. Njihove strukture su utvrđene analizom opsežnih spektroskopskih podataka i poređenjem sa podacima iz literature. Potvrđeno je da su probno predviđene strukture glikozida supstituiranih s fenilpropanoidom ispravno usklađene sa njihovim stvarnim strukturama.
Prednost ekstrakta Cistanche salsa
Reference
1. Shimamura, H.; Miyazawa, M.; Enomoto, K.; Nakamura, S.-I.; Kameoka, H. Supresija SOS-inducirajuće aktivnosti Trp-P-1 masnim kiselinama iz Cistanche salsa u Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002 umu testu. Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 261–265. [CrossRef]
2. Jeon, E.; Chung, K.-S.; An, H.-J. Anti-proliferacijski efekti Cistanches salsa na progresiju benigne hiperplazije prostate. Može. J. Physiol. Pharmacol. 2016, 94, 104–111. [CrossRef] [PubMed]
3.Xu, C.; Jia, X.; Xu, R.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Sun, S. Rapid Discrimination of Herba Cistanches by multi-step infrared macro-fingerprinting u kombinaciji sa mekim nezavisnim modeliranjem analogije klasa (SIMCA). Spectrochim. Acta Part A Mol. Biomol. SpectrosCistanche2013, 114, 421–431. [CrossRef] [PubMed]
4. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Diferencijacija Herba Cistanches prema otisku prsta sa tečnom hromatografijom visokih performansi – detekcija niza dioda – masena spektrometrija. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]
5. Kobayashi, H.; Karasawa, H.; Miyase, T.; Fukushima, S. Studije o sastojcima Cistanchis Herba. V. Izolacija i strukture dva nova fenilpropanoidna glikozida, cistanozida E i F. Chem. Pharm. Bik. 1985, 33, 1452–1457. [CrossRef]
6.Lei, L.; Jiang, Y.; Liu, X.-M.; Tu, P.-F.; Wu, L.-J.; Chen, F.-K. Novi glikozidi iz Cistanche salsa. Helv. Chim. Acta 2007, 90, 79–85. [CrossRef]
7. Kartbaeva, EB; Sakipova, ZB; Ibragimova, LN; Kapsalyamova, EN; Ternynko, II Studija kompozicije fenolnih jedinjenja Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck, koja raste u Republici Kazahstan. J. Chem. Pharm. Res. 2015, 7, 120–122.
8. Liu, J.-Y.; Guo, Z.-G.; Zeng, Z.-L. Poboljšana akumulacija feniletanoidnih glikozida hranjenjem prekursora u suspenziju kulture Cistanche salsa. Biochem. inž. J. 2007, 33, 88–93. [CrossRef]
9. Maruyama, S.; Akasaka, T.; Yamada, K.; Tachibana, H. Cistanche salsa ekstrakt djeluje slično kao vezan za proteine
polisaharida-K (PSK) na različitim tipovima ćelijskih linija. J. Tradit. Med. 2008, 25, 166–169.
10. Tian, X.-F.; Pu, X.-P. Feniletanoidni glikozidi iz Cistanches salsa inhibiraju apoptozu izazvanu 1-metil-4-fenilpiridinijum jonom u neuronima. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 59–63. [CrossRef] [PubMed]
11.Michel, T.; Halabalaki, M.; Skaltsounis, AL Novi koncepti, eksperimentalni pristupi i strategije dereplikacije za otkrivanje novih fitoestrogena iz prirodnih izvora. Planta Med. 2013, 79, 514–532. [CrossRef] [PubMed]
12. De Medeiros, LS; Abreu, LM; Nielsen, A.; Ingmar, H.; Larsen, TO; Nielsen, KF; Rodrigues-Filho, E. Dereplikacijom vođena izolacija depsida teaflavina ST i lecanora DF iz endofitske gljive Setophoma sp. Phytochemistry 2015, 111, 154–162. [CrossRef] [PubMed]
13.Rakotondraibe, LH; Rasolomampianina, R.; Park, H.-Y.; Li, J.; Slebodnik, C.; Brodie, PJ; Blasiak, LC; Hill, R.; TenDyke, K.; Shen, Y.; et al. Antiproliferativna i antiplazmodijalna jedinjenja iz odabranih vrsta Streptomyces. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2015, 25, 5646–5649. [CrossRef] [PubMed]
14.Jiang, Y.; Liu, F.-J.; Wang, Y.-M.; Li, H.-J. Izolacija novih hepatoprotektivnih triterpenoidnih saponina iz semena Celosiae vođena dereplikacijom tečnom hromatografijom visokih performansi u kombinaciji sa tandemskom spektrometrijom masenog kvadrupola i vremena leta sa elektrosprej jonizacijom. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017, 132, 148–155. [CrossRef] [PubMed]
15. Zhang, J.; Li, C.; Che, Y.; Wu, J.; Wang, Z.; Cai, W.; Li, Y.; Ma, Z.; Tu, P. Strategija zasnovana na LTQ-Orbitrapu za tradicionalnu kinesku medicinu usmjerena na otkrivanje klasa, identifikaciju i njeno istraživanje omike: studija slučaja o feniletanoidnim glikozidima u tri različite vrste Herba Cistanches. RSC Adv. 2015, 5, 80816–80828. [CrossRef]
16. Yoshizawa, F.; Deyama, T.; Takizawa, N.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. The Constituents of Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. II. Izolacija i strukture novog feniletanoidnog glikozida i novog neolignan glikozida. Chem. Pharm. Bik. 1990, 38, 1927–1930. [CrossRef]
17. Tanaka, T.; Nakashima, T.; Ueda, T.; Tomii, K.; Kouno, I. Laka diskriminacija aldoznih enantiomera pomoću HPLCistancheChem reverzne faze. Pharm. Bik. 2007, 55, 899–901. [CrossRef] [PubMed]
18. Wong, WS; Guo, D.; Wang, XL; Yin, ZQ; Xia, B.; Li, N. Studija cis-cimetne kiseline u Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. Biochem. 2005, 43, 929–937. [CrossRef] [PubMed]
19.Kahnt, G. Trans-Cis-ekvilibrijum hidroksicimetnih kiselina tokom zračenja vodenih rastvora pri različitim pH. Phytochemistry 1967, 6, 755–758. [CrossRef]
