Imunomodulatorni faktori u Cistanche Salsa

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Shinjiro MARUYAMA," Koji YAMADA, Hirofumi TACHIBANA

Cistanche salsa(CAMever) G.Beck, Orobanchaceae je parazitska biljka koja se koristi kao orijentalni medicinski tonik u Japanu. U našoj prethodnoj studiji, otkrili smo da C, ekstrakt salsa pojačava proizvodnju IgM i IgG u limfocitima humanih Ivmph čvorova. Nadalje, C, salsa dijalizat (CSD) pripremljen korištenjem membrane za dijalizu sa a3.500-Da molekularna težina cut-off pojačala proizvodnju IgM u ljudskoj B-ćelijskoj liniji BALL-1; osim toga, izazvao je blagu ćelijsku proliferaciju. Međutim, nasuprot tome, CSD je inducirao inhibiciju rasta praćenu apoptozom u ćelijskoj liniji ljudskog Burkittovog limfoma Namalwa. Ovi rezultati ukazuju na moguće prisustvo aktivnih sastojaka u CSD koji su specifični za limfocite. Do sada nisu razjašnjena hemijska svojstva ovih sastojaka. U ovoj studiji smo istraživali hemijska svojstva aktivnih sastojaka u CSD. Obje gore navedene aktivnosti u B-ćelijskim linijama nisu inaktivirane autoklavnim tretmanom CSD. Koristeći kolonsku hromatografiju za gel filtraciju, otkrili smo da su pikovi aktivnih frakcija koncentrirani u različitim frakcijama. Naši rezultati sugeriraju da postoje najmanje 2 vrste aktivnih sastojaka u CSD-u, a oni mogu biti polisaharidi jer su vodotopivi sastojci visoke molekularne težine i termostabilni.

Ključne riječi: Cistanche salsa, visoka molekularna težina, IgM, inhibicija rasta.

Uvod

Cistanche salsa(CA Meyer) G.Beck, Orobanchaceae je parazitska biljka koja se koristi kao orijentalni medicinski tonik u Japanu. U Kini je ova biljka važna tradicionalna medicina koja se koristi za liječenje nedostatka bubrega i neurastenije. Kroz in vitro studije, već smo prijavili efekte C. salsa na imuni sistem. Prvo. pokazali smo da ekstrakt C. salsa pojačava proizvodnju IgM i IgG u limfocitima ljudskih limfnih čvorova. Drugo, pokazali smo da dijalizat C. salsa (CSD) pripremljen upotrebom 3,500-Da molekularne težine cut-off dijalizne membrane pojačava proizvodnju IgM u ljudskoj B-ćelijskoj liniji BALL-1; osim toga, u maloj mjeri inducira ćelijsku proliferaciju.2 Nadalje, CSD ima suprotan učinak pri čemu inducira inhibiciju rasta praćenu apoptozom u ćelijskoj liniji humanog Burkittovog limfoma, Namalwa.3) Ovi nalazi sugeriraju da je ovaj efekat CSD povezan s aktivacija B stanica, dok je apoptoza rezultat nedostatka drugih signala koji su potrebni za diferencijaciju B-ćelija, kao što su citokini i kontakt stanica-ćelija; međutim, hemijska svojstva CSD-a nisu razjašnjena ni u jednoj od prethodnih studija. Stoga smo u ovoj studiji istraživali hemijska svojstva aktivnih sastojaka u CSD.

Materijali i metode

CSD je pripremljen istom metodom u našem prethodnom istraživanju. CSD je otopljen u fosfatnom puferu (PBS) na 20 mg/ml. Pripremljena otopina (0.8 ml) je propuštena kroz filter (0.22 um) prije nanošenja i zatim eluirana istom otopinom kroz kolone koje sadrže TOYOPEARL HW-40F (1.0×96,5 cm; Tosoh Corp, Japan),TOYOPEARL HW-55F(1.0 × 98.0 cm; Tosoh Corp.,Japan) , i Sephacryl S-400HR(1.0×98,0 cm; GE Healthcare UK Ltd.,.Engleska); a zatim su sakupljene frakcije od 1 ml (30 kapi). Za određivanje zapremine praznine gelova i približne molekularne težine (MW) frakcionisanih sastojaka, plavi dekstran (BD) (Sigma-Aldrich Japan KK, Japan); i dekstrani poznatih MW dobijenih od Leuconostoc spp. (Sigma-Aldrich Japan KK, Japan), odnosno od MW2,000kDa(D1),500kDa(D2),70 kDa (D3) i 6 kDa (D4); i cijanokobalamin (VB12, MW:1355.4) (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japan). Ukupni sadržaj šećera i proteina svake frakcije određen je metodom fenol-sumporne kiseline i Lowry metodom sa PIERCETM bicinhoninskom kiselinom (BCA) kompletom za analizu proteina (Thermo Fisher Scientific Inc., SAD). Glukoza i goveđi serumski albumin korišteni su kao odgovarajući standardi. Nadalje, mjerena je apsorbancija svake frakcije na 320 nm (A:2o). Vrhovi elucije plavog dekstrana i cijanokobalamina određeni su njihovom vrijednošću apsorbancije na 260 nm, a pikovi dekstrana poznate MW su određeni metodom fenol-sumporne kiseline. CSD je autoklaviran na 120 stepeni 20 min radi procjene njegove termostabilnosti. U biološkim testovima, ćelijska kultura i mjerenje IgM su rađeni istom metodom u našoj prethodnoj studiji.

Ekstrakt Cistanche salsa

Rezultati i diskusija

Slika 1 prikazuje hromatograme kolone za gel filtraciju CSD-a na HW-40F. Na slici la, MW aktivnih sastojaka procijenjeno je na više od 6 kDa na osnovu dekstran markera D4. Nadalje, obje aktivnosti CSD-a, tj. povećanje proizvodnje IgM i izazivanje inhibicije rasta, nisu inaktivirane tretmanom u autoklavu (Slika 2), iako su se neki sastojci agregirali i izgubili nakon što je CSD prošao kroz 0.{{6} }um filter. Obrasci eluiranja CSD i autoklaviranog CSD bili su gotovo identični, međutim, relativna aktivnost povećanja proizvodnje IgM u autoklaviranom CSD bila je niža od netretiranog CSD. Čini se da su neki od razloga što su agregati držali aktivne sastojke ili su neki od aktivnih sastojaka bili inaktivirani. Rezultati hromatografije na HW-55F su pokazali moguće prisustvo 2 vrste imunomodulatornih faktora: prvi, koncentrisan u fr. br.32. je bio aktivni sastojak visoke molekularne težine (HCS) koji bi mogao povećati proizvodnju IgM, dok je drugi, koncentriran u fr. br.50, bio je aktivni sastojak srednje molekularne težine (MCS) koji je mogao inhibirati proliferaciju ćelija (Slika 3). Međutim, pikovi dobijeni i za HCS i za MCS (fr.br.32 i 50 respektivno) nisu bili tako oštri kao oni za dekstrane poznate MW (podaci nisu prikazani). Ova zapažanja ukazuju na mogućnost postojanja nusproizvoda koji se umjetno stvaraju tokom pripreme CSD-a, polimera aktivnih sastojaka koji se lako uništavaju i sastoje se od više jedinica, ili različitih aktivnih sastojaka koji imaju različite originalne MW. Obrasci eluiranja na hromatogramima pokazuju da nije lako dobiti čiste sastojke iz HCS i MCS jer izgleda da postoje različiti sastojci koji imaju neznatno različite MW kao što je gore spomenuto. Iako su oba mješavina aktivnih sastojaka, čini se da HCS sadrži sastojke MW veće od 70 kDa, dok MCS sadrži one od MW veće od 6 kDa. HCS je eluiran na HW-55F u frakciji koja je bila izvan opsega razdvajanja. Na Sephacryl-S400.deo HCS(fr.no.36) je eluiran u istoj frakciji kao i D1 marker, koji ima MW 2,000 kDa (Slika 4). Općenito, polisaharidi i proteini se uzimaju u obzir kao vodotopivi sastojci visoke MW u biljnim ekstraktima. Budući da se gotovo svi funkcionalni proteini inaktiviraju toplinskom obradom, čini se da su polisaharidi. Međutim, Park et. al. izvijestili su o termostabilnom citotoksičnom malom proteinu zvanom viskotoksin, koji se priprema iz ekstrakta imele (Viscum album L., Viscaceae).4 Štaviše, pokazalo se da viskotoksini povećavaju imunomodulatornu aktivnost ljudskih prirodnih ćelija ubica.5 Na slici 3, MCS, koji ima manji MW, pokazuje veći sadržaj proteina. Uzimajući u obzir ove činjenice, MCS može biti polisaharid vezan za proteine8 ili može biti termostabilan protein poput viskotoksina. Ovi rezultati pokazuju da 2 aktivna sastojka mogu biti polisaharidi. U suprotnom, MCS bi mogli biti termostabilni proteini.

Reference

1) Deng, M., Zhao, JY, Ju, XD, Tu, PF, Jiang, Y., Li, ZB: Zaštitni efekat tubulozida B na apoptozu izazvanu TNF alfa u neuronskim ćelijama.Acta Pharmacol. Sin., 25, 1276-1284, 2004.

2) Maruyama, S., Yamada, K., Tachibana, H.:Ekstrakt Cistanche salsapoboljšana proizvodnja IgM u ljudskoj B ćelijskoj liniji, BALL-1.J. Trad. Med.,24,209-211,2007.

3) Maruyama, S., Yamada, K., Tachibana, H:Cistanche salsaekstraktom indukovanu apoptozu u ćelijskoj liniji ljudskog Burkittovog limfoma Namalwa. J.Trad. Med.,25,24-27,2008.

4) Park. JH,Hyun, CK,Shin HK: Citotoksični efekti komponenti u termički obrađenoj imeli (Viscum album).Cancer Let, 139, 207-213,1999.

5) Tabasco, J., Pont, F, Fournic, JJ, Vercellone, A.: Viskotoksini imele povećavaju citotoksičnost posredovanu prirodnim ćelijama ubojicama. Eur.J. Biochem., 269, 2591-2600, 2002.

6) Fisher, M., Yang, LX: Antikancerogeni efekti i mehanizmi polisaharida-K (PSK): implikacije imunoterapije raka. Anticancer Res.,22,1737-1754,2002.

cistanche suplementi