Dio 2: Proteinurska kronična bolest bubrega povezana je s promijenjenim životnim vijekom crvenih krvnih zrnaca, deformabilnosti i metabolizmom

Za prvi dio, klikniteOVDJE.

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Ozljeda bubrega izazvana doksorubicinom mijenja životni vijek mišjih eritrocita, morfologiju i biofizička svojstva

Dvadeset dana nakon indukcije DIN-a, što se poklapa sa razvojem redukcijefunkciju bubrega(Slika 1b), fluorescentna boja 5(6)-CFDA, SE,24 koja se brzo apsorbira u eritrocite, ubrizgana je iv kako bi se ispitala stopa klirensa eritrocita u naznačenim vremenskim tačkama in vivo. Reprezentativni histogrami, prikazani na slici 4a, ukazuju na uklanjanje označenih eritrocita iz cirkulacije i zamjenu neobilježenim eritrocitima. Povećani gubitak eritrocita bio je očigledan već 3 dana nakon primjene boje, a čišćenje eritrocita je bilo značajno brže kod 129S1/SvImJ miševa sa DIN-om do 37. dana. 41. dana, z17 posto više eritrocita je uklonjeno iz cirkulacije kod ovih miševa u poređenju sa zdravim miševima (slika 4b).

Cistanchepoboljšatifunkciju bubregaibeneficijebubrezi

Slike preuzete iz razmaza krvi otkrile su morfološke promjene u eritrocitima izvučenim iz 129S1/SvImJ miševa sa DIN (Slika 4c) i Nphs2Dipod miševa (dodatna slika S4A). Kod zdravih miševa, eritrociti pokazuju bikonkavni oblik diska. Kod 129S1/SvImJ miševa sa DIN-om, uočili smo povećan broj stomatocita (crvene zvijezde), kapljastih ćelija (crni trokut), šistocita (crne tačke) i mikrocitnih ćelija (crna strelica) (slika 4c). Nphs2Dipod miševi su pokazali povećani udio šistocita (crne tačke, dodatna slika S4A, donja slika, lijeva strana), a ćelije su bile polikromatske (dopunska slika S4A, donja slika, desna strana).

Da bi se dalje istražile funkcionalne promjene eritrocita, mjerenja deformabilnosti 30. dana izvršena su ektacitometrijom.³²Deformabilnost eritrocita značajno je smanjena kod 129S1/SvImJ miševa sa DIN-om, kao i kod Nphs2Dipod miševa, na šta ukazuje smanjeni indeks maksimalnog izduženja (EImax) (slika 4d i dodatna slika S4B). Napon smicanja za 50 posto (SS1/2) EImax (Slika 4e) i, prema tome, SS1/2 EImax omjer (Slika 4f) su značajno povećani kod 129S1/SvImJ miševa sa DIN-om, što ukazuje na čvršće eritrocite. SS1/2 od EImax bio je sličan kod miševa Nphs2Dipod (dodatna slika S4C). SS1/2 EImax omjer je imao tendenciju da bude povećan kod Nphs2Dipod miševa u poređenju sa zdravim C57BL/6 miševima; razlika, međutim, nije dostigla statističku značajnost (P=0,06) (dodatna slika S4D).

Kako izlaganje eritrocita hipertonskim ekstracelularnim uslovima in vitro oponaša osmotsko okruženje koje se nalazi u bubrežnoj meduli, kosmos se može izvesti 30. dana i određeno je nekoliko osmosenzitivnih parametara, kao što je prethodno opisano.³³ Omin predstavlja osmolalnost pri minimalnoj deformabilnosti eritrocita, iznad koje bi se eritrociti lizirali uz daljnje smanjenje osmolarnosti. Omin vrijednosti su bile veće kod 129S1/SvImJ miševa sa DIN-om i pomaknute udesno (Slike 5a i d). Slična tendencija ka višem Ominu uočena je kod miševa Nphs2Dipod (dodatna slika S4E). Vrijednosti Ohypera, koje odražavaju stanje hidratacije ćelija, bile su značajno veće kod 129S1/SvImJ miševa sa DIN-om (slika 5b), ali su bile slične kod Nphs2Dipod miševa i njihovih odgovarajućih kontrolnih miševa (dodatna slika S4F). Maksimalna deformabilnost (EImax) pri izotoničnosti je tačka u kojoj ćelije postižu maksimalnu eliptičnost. EImax kod izotoničnosti je značajno smanjen kod 129S1/SvImJ miševa sa DIN-om (Slika 5c), ali nije pokazao nikakve razlike kod Nphs2Dipod miševa u poređenju sa zdravim C57BL/6 miševima (dodatna slika S4G). Sve u svemu, ovi rezultati ukazuju na smanjen integritet i elastičnost membrane, ali i na promjene oblika kod miševa 129S1/SvImJ i Nphs2Dipod, kao i na veću osmotsku krhkost eritrocita kod 129S1/SvImJ miševa sa DIN-om.

RBC se metabolički reprogramiraju tokom proteinurične bolesti bubrega kod miševa

Kako bi bolje razumjeli molekularne adaptacije povezane s promjenama u obilju i morfologiji eritrocita u funkciji ozljede bubrega, eritrociti iz 129S1/SvImJ miševa s DIN i Nphs2Dipod miševima analizirani su metabolomikom zasnovanom na spektrometriji mase (slika 6a i dodatna slika S5A). Koristeći ovaj pristup, određeni su relativni nivoi 256 metabolita za 129S1/SvImJ miševe i Nphs2Dipod miševe. Da bi se ovi podaci analizirali na sistematičan način, izvršene su multivarijantne analize, uključujući diskriminantnu analizu parcijalnih najmanjih kvadrata i analizu hijerarhijskog klasteriranja. Zanimljivo je da je analiza parcijalnih najmanjih kvadrata diskriminacijskih metaboloma eritrocita iz oba modela otkrila slične obrasce grupiranja.

Konkretno, iako su se uzorci u vrijeme indukcije modela grupirali zajedno sa zdravim uzorcima iz svih vremenskih tačaka, uzorci nefrotičnih miševa grupirani su nezavisno od zdravih kontrolnih uzoraka zajedno sa komponentom 1 (slika 6b i dodatna slika S5B). U skladu sa obrascima grupiranja koji su evidentni u 2 modela, hijerarhijska analiza klasteriranja metabolomskih podataka za svaki model istakla je slične trendove za metabolite uključene u upravljanje oksidativnim stresom, kao i nukleotide, aminokiseline, acilkarnitine i masne kiseline (Slika 6c). i dodatne slike S5C, S6 i S7). Na primjer, nivoi alantoina, purinskog katabolita i markera oksidativnog stresa u eritrocitima,³⁴ i smanjeni glutation su se značajno akumulirali tokom vremena u oba modela nefrotskih miševa, što ukazuje na kontinuirano stvaranje reaktivnih vrsta kiseonika i aktivaciju antioksidativnog glutationskog sistema (slika 6d i dodatna slika S5D). Slično, nivoi prekursora koenzima A (CoA) pantotenata su se akumulirali tokom vremena (slika 6e i dodatna slika S5E).

Slični obrasci bili su evidentni u nivoima slobodnih masnih kiselina heksadecenske kiseline (C16:1), oktadecenoične kiseline (C18:1) i dokozapentaenske kiseline (C22:5), iako je svaki model imao jedinstvene vremenske obrasce (slika 6f i dodatna slika S5F).

Pored masnih kiselina, reagovali su i acilkarnitini, uključujući hidroksioktanoil-karnitin (AC C8-OH), hidroksidekanoil-karnitin (AC C10-OH) i dodekanoil-karnitin (AC C12:1). do indukcije proteinurične nefropatije u oba modela (slika 6g i dodatna slika S5G).

Uzeti zajedno, ovi nalazi upućuju na indukciju proteinurijebolest bubregau 2 slična modela miševa, povećani nivoi oksidativnog stresa mogu uzrokovati oštećenje acilnih lanaca na membranskim lipidima. Budući da su eritrociti lišeni sposobnosti da sintetiziraju nove lipide, oni koriste sistem koji ovisi o uklanjanju oštećenih acilnih lanaca posredovanom fosfolipazom i zamjeni neoštećenim masnim kiselinama. Nazvan Landsov ciklus,35 ovaj sistem zavisi od aktivacije acilnog lanca konjugacijom sa CoA, što uspostavlja ravnotežu sa acilkarnitinom za zamjenu membrane36 (slika 6h i dodatna slika S5H).

Proteinurski pacijenti sa CKD sa anemijom pokazuju povećanu smrtnost eritrocita

To confirm that PS-exposing RBCs occur also in human CKD, as described earlier,37 we analyzed blood samples from 25 patients treated by our outpatient clinic. To match the mouse models that represent nephrotic syndrome with preserved GFR during the first 10 days, and then advanced CKD with reduced GFR from day 20 onwards (Figure 1 and Supplementary Figure S2), we analyzed 10 patients with primary nephrotic syndrome representing proteinuric CKD with preserved GFR (>60 ml/min na 1,73 m2) i 15 pacijenata sa CKD sa proteinurijom nefrotskog opsega i GFR<60 ml/min="" per="" 1.73="">². Karakteristike pacijenata su prikazane u Tabeli 1. Anemija povezana sa bolešću bubrega, definisana koncentracijom hemoglobina<13.5 g/dl="" in="" men="" and=""><12 g/dl="" in="" women,="" was="" observed="" in="" 4="" of="" the="" 10="" primary="" nephrotic="" patients="" (red="" triangles="" in="" figure="" 7),="" whereas="" 14="" of="" 15="" ckd="" patients="" with="" nephrotic-range="" proteinuria="" and="" reduced="" gfr="" were="" anemic="" (figure="" 7a).="" in="" the="" latter="" group,="" plasma="" epo="" concentrations="" and="" reticulocyte="" production="" index="" were="" not="" increased="" (figure="" 7b="" and="" c),="" consistent="" with="" reduced="" erythropoiesis.="" in="" fluorescence-activated="" cell="" sorting="" analysis,="" primary="" nephrotic="" patients="" and="" patients="" with="" advanced="" ckd="" had="" a="" higher="" rate="" of="" ps-exposing="" cells="" (mean,="" 1.0%="" 0.3%="" and="" 1.4%="" 0.7%,="" respectively)="" compared="" with="" healthy="" subjects="" (mean,="" 0.6%="" 0.1%;="" figure="" 7d).="" rbc="" cell="" death="" in="" patients="" with="" primary="" nephrotic="" syndrome="" and="" advanced="" ckd="" was="" triggered="" by="" higher="" levels="" of="" reactive="" oxygen="" species="" (figure="" 7e)="" and="" increased="" ceramide="" levels="" (figure="" 7f).="" augmented="" intracellular="" calcium="" concentration="" was="" found="" in="" patients="" with="" advanced="" ckd="" (figure="">

Ljudski eritrociti pacijenata sa primarnim nefrotskim sindromom i uznapredovalom CKD pokazali su morfološke promjene, kao što je uočeno na modelima miševa (slike 4c i 7j-l i dodatna slika S4A). Iako je morfologija eritrocita bila normalna u kontrolnoj skupini, anemični pacijenti s primarnim nefrotskim sindromom i pacijenti sa uznapredovalom CKD imali su povećan broj suznih stanica (crni trouglovi) i ehinocita (crni križići) (Slika 7k i l). Pored toga, ciljne ćelije su se pojavile kod primarnih nefrotičnih pacijenata sa anemijom i kod pacijenata sa uznapredovalom CKD (crveni krstići; slika 7k i l). Sve grupe pacijenata, uključujući primarne nefrotične pacijente bez anemije, imale su povećan udio sferocita (plave strelice; Slika 7j–l). Za analizu deformabilnosti ljudskih eritrocita urađena je ektacitometrija. U poređenju sa zdravim kontrolama, maksimalna deformabilnost (EImax) je smanjena kod pacijenata sa uznapredovalom CKD (Slika 7h); EImax je imao tendenciju da bude niži kod pacijenata sa primarnim nefrotskim sindromom bez postizanja statističke značajnosti (Slika 7h). Parametri SS1/2, Omin, Ohyper i EImax pri izotoničnosti nisu se značajno razlikovali između zdravih kontrola, primarnih nefrotičnih pacijenata i pacijenata sa uznapredovalom CKD (dodatna slika S8A-D).

Cistanche koristibubrezi i pomoć kod CKD.

DISKUSIJA

Ova studija otkriva nove patofiziološke mehanizme koji dovode do anemije povezane s bubrežnom bolešću u 2 mišja modela proteinurije.bolest bubregasa teškim oštećenjimafunkciju bubrega. Naša studija pokazuje da je u ovim modelima anemija rezultat smanjenog životnog vijeka eritrocita izazvanog izlaganjem PS i ubrzanim fagocitnim klirensom. Intrigantno je da se anemija kod ovih miševa razvila uprkos stimulisanoj eritropoezi, što sugeriše da skraćeni životni vek eritrocita, kroz povećanu smrt eritrocita, može biti alternativno objašnjenje za ove nalaze. Za razliku od pacijenata sa CKD sa anemijom (Slika 77), oba mišja modela su bila okarakterisana povećanom koncentracijom EPO u plazmi. Ovo se može pretpostaviti očuvanjem sposobnosti za izlučivanje EPO u ovim modelima koji vjerovatno poštede ćelije koje luče EPO smještene u intersticijumu bubrega. Povećano lučenje EPO u ovim modelima, međutim, ne poništava zaključak da je smrt eritrocita glavni igrač u patogenezi anemije povezane s bubrežnom bolešću. Naprotiv, stimulacija eritropoeze povećanom sekrecijom EPO može se smatrati kompenzacijskim mehanizmom za povećanu smrt eritrocita uzrokovanuotkazivanja bubregau ovim modelima. U skladu s tim, povećana ekstramedularna eritropoeza s povećanim volumenom slezene nedavno je primijećena u drugom proteinuričkom mišjem modelu s anemijom.³⁸

Kod pacijenata sa proteinurskom CKD i pratećom anemijom, također smo primijetili povećani postotak eritrocita izloženih PS zajedno s višim nivoima reaktivnih vrsta kisika i ceramida. Ovo sugerira da bi ubrzana smrt eritrocita mogla biti uključena u patogenezu anemije povezane s bubrežnom bolešću u humanoj CKD. Koncentracije EPO u plazmi i indeks proizvodnje retikulocita nisu povećani kod anemičnih pacijenata sa CKD, što ukazuje na smanjenu eritropoezu, za koju se očekuje da će zajedno sa smrću eritrocita pogoršati anemiju povezanu sa bubrežnom bolešću. Razlozi gubitka EPO sekrecije bubrega kod humane CKD ostaju nejasni. Zanimljivo je da, iako nisu svi pacijenti sa normalnom GFR imali anemiju, oni sa smanjenom GFR su svi bili anemični, što ukazuje na efekat dugotrajne i uznapredovale CKD. Značajno je da se relativni EPO deficit u CKD može prevladati upotrebom nove klase inhibitora prolil hidroksilaze,³⁹sugerirajući poremećeni senzor kisika kao mogući uzrok hiposekrecije EPO.

Cistanchepoboljšatifunkciju bubregai pomoć kod CKD.

Naši podaci pokazuju smanjenu deformabilnost eritrocita u oba mišja modela proteinurične nefropatije, što može biti direktno povezano sa povišenim nivoima Ca2 u citoplazmi.⁴⁰ Zajedno, ovi mehanizmi mogu djelovati zajedno kako bi olakšali indukciju smrti eritrocita i uklanjanje starih i povrijeđenih eritrocita iz cirkulacije.¹⁵Nadalje, uočili smo metaboličko reprogramiranje u ovim stanicama, što ukazuje na oksidativni stres i remodeliranje membranskih lipida. Iako CoA i acil-CoA nisu direktno izmjereni u ovim uzorcima, oni se aktivno pretvaraju u eritrocitima u acilkarnitine pomoću karnitin palmitoil transferaze.³⁶Akumulirajući nivoi poslednje klase jedinjenja ukazuju na aktivaciju ovih mehanizama kod nefropatije, pošto se ovi metaboliti ne transportuju lako kroz membrane eritrocita.⁴¹ Dalju potporu, uočili smo akumulaciju u oba modela prekursora CoA, uključujući pantotenat, koji se apsorbira⁴²i metabolizira⁴³eritrocitima, paralelno sa povećanjem slobodnih masnih kiselina i smanjenjem slobodnog karnitina. Zanimljivo je da smo ranije otkrili da se ove promjene javljaju u vezi sa suprafiziološkim nivoima intracelularnog Ca2þ.¹⁶Iako su ti rezultati generirani ex vivo, ovdje izvještavamo o sličnim odgovorima in vivo. Nadalje, acilkarnitini su sposobni direktno modulirati svojstva membrane⁴⁴i koreliraju sa deformabilnosti eritrocita^,45, kao i osmotska i oksidativna hemoliza.⁴⁶Nekonjugirani slobodni karnitin, promoviše deformabilnost membrane posredovanjem interakcija između membranskih proteina.⁴⁷ Naša zapažanja značajno smanjenih nivoa karnitina u eritrocitima kod miševa sa nefropatijom, verovatno zbog povećane potrošnje za stvaranje acilkarnitina, mogu doprineti smanjenju reoloških parametara koje smo posmatrali paralelno.

Naši nalazi ukazuju na uobičajene mehanizme koji dovode do smrti eritrocita kod miševa s nedostatkom DIN-a i podocina, što može biti povezano i s proteinurijom nefrotskog raspona i, što je još važnije, s razvojem teškihotkazivanja bubregana modelima miševa posmatranim od 20. dana nadalje. Kod ljudi, uznapredovala CKD sa smanjenom GFR je snažan prediktor anemije,⁴⁸a stimulacija smrti eritrocita mogla bi biti povezana sa uremičnim miljeom. Mora se priznati da u uznapredovaloj CKD mnogi faktori i poremećaji mogu doći u igru ​​i podstaći anemiju povezanu sa bubrežnom bolešću. Doprinos teške proteinurije stimulaciji smrti eritrocita ostaje nejasan, ali, iako nije dokazan, može uključivati ​​faktore koji se gube u urinu, kao što je transferin ili drugi koji regulišu metabolizam eritrocita.⁴⁹Do sada se trenutno liječenje anemije povezane s bubrežnom bolešću fokusira na povećanje eritropoeze zamjenom gvožđa ili EPO,⁵⁰primjenom proteinskih stabilizatora faktora koji izazivaju hipoksiju,⁵¹ili oralnom ili iv primjenom gvožđa.⁵²Međutim, ovi tretmani ne uzimaju u obzir povećanu smrtnost eritrocita. U prethodnoj studiji poprečnog presjeka kod pacijenata na hemodijalizi i peritonealnoj dijalizi, otkrili smo da su pacijenti s većim postotkom eritrocita izloženih PS liječeni većim dozama EPO.¹⁴ Stoga, ublažavanje smrti eritrocita obećava da će biti mogući terapijski pristup u liječenju anemije povezane s bubrežnom bolešću. U tom kontekstu, inhibitorni efekat različitih farmakoloških agenasa na smrt eritrocita53 zahteva dalje studije na ljudima i životinjama.

U zaključku, izmijenjeni ćelijski metabolizam doprinosi disfunkciji eritrocita, pojačanoj smrti eritrocita, a time i anemiji kod mišjih modela proteinurične CKD, uprkos povećanim nivoima EPO u serumu. Nalazi ove studije mogu djelomično objasniti mehanizme anemije povezane s CKD kod ljudi.

Cistanche beneficijefunkcije bubrega i pomoć kod CKD.

OTKRIVANJE

Iako nisu u vezi sa sadržajem članaka, ADA i TN su osnivači Omix Technologies, Inc. Svi ostali autori su se izjasnili da nemaju suprotstavljene interese.

IZJAVA PODATAKA

Podaci će biti dostupni na razuman zahtjev.

ZAHVALNICA

Autori priznaju stručnu tehničku pomoć Andree Janesse. Ove studije su podržane grantom Njemačke istraživačke fondacije za RB (BI 2149/2-1) i FA (AR 1092/2-2). LS je podržan grantom Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) od strane medicinskog fakulteta Univerziteta u Tübingenu. SMQ je podržan sredstvima iz Kanadske službe za krv. Kao uslov za finansiranje kanadske vlade, ovaj izvještaj mora sadržavati izjavu "Ovdje izraženi stavovi ne predstavljaju nužno stav savezne vlade Kanade."

DOPRINOSI AUTORA

RB i FA su dizajnirali studiju. Prikupljanje podataka vršili su RB, TN, MG, TD, DE, MW, LS, MX, JMB, MZK, KO, LK, IG-M i BF.

Statističke analize su sproveli RB, TN, MG, TD, LS, JMB, LK, IG-M i ADh; a brojke su generirali RB, TN, MZK, IG-M, LQ-M, BF i ADh. RB, TN, ADA, MG, BNB, LS, AS, TB, MS, ALB, FG, SMQ,

i FA je interpretirao podatke. Rukopis su napisali, pregledali i uredili RB, TN, ADA, MG, BNB, TB, ALB, FG, SMQ i FA.

DODATNI MATERIJAL

Dodatni fajl (PDF)

Dodatni materijali i metode.

Slika S1. Dizajn eksperimenta na 129S1/SvImJ i Nphs2Dipod miševima.

Slika S2. Brisanje ekspresije podocina i obilježja nefrotskog sindroma kod Nphs2Dipod miševa.

Slika S3. Smanjena stopa preživljavanja crvenih krvnih zrnaca u eksperimentalnom nefrotskom sindromu kod Nphs2Dipod miševa.

Slika S4. Promijenjena morfologija i smanjena deformabilnost crvenih krvnih stanica kod miševa Nphs2Dipod.

Slika S5. Metabolomika ukazuje na akumulaciju oksidativnog stresa i aktivaciju remodeliranja membranskih lipida unutar crvenih krvnih zrnaca kod Nphs2Dipod miševa.

Slika S6. Metabolomika ukazuje na izmijenjen metabolizam unutar crvenih krvnih zrnaca dobivenih od 129S1/SvImJ miševa.

Slika S7. Metabolomika ukazuje na izmijenjen metabolizam unutar crvenih krvnih zrnaca primljenih od Nphs2Dipod miševa.

Slika S8. Napon smicanja na polovini maksimalne deformabilnosti crvenih krvnih zrnaca (RBC) i osmotska osjetljivost eritrocita ne razlikuju se značajno kod primarnog nefrotskog sindroma i uznapredovalih pacijenata s kroničnom bubrežnom bolešću (CKD).

REFERENCE

1. Finkelstein FO, Story K, Firanek C, et al. Kvaliteta života vezan za zdravlje i razina hemoglobina kod pacijenata s kroničnom bubrežnom bolešću. Clin J Am Soc Nephrol. 2009;4:33–38.

2. Efstratiadis G, Konstantinou D, Chytas I, et al. Sindrom kardio-renalne anemije. Hipokratija. 2008;12:11–16.

3. Staples AO, Wong CS, Smith JM, et al. Anemija i rizik od hospitalizacije kod pedijatrijske hronične bubrežne bolesti. Clin J Am Soc Nephrol. 2009;4: 48–56.

4. Kurella Tamura M, Vittinghoff E, Yang J, et al. Anemija i rizik od kognitivnog pada kod hronične bolesti bubrega. BMC Nephrol. 2016;17:13.

5. Toft G, Heide-Jørgensen U, van Haalen H, et al. Anemija i klinički ishodi kod pacijenata s teškom kroničnom bolešću bubrega koja nije zavisna od dijalize ili o dijalizi: studija bazirana na danskoj populaciji. J Nephrol. 2020;33:147–156.

6. Geddes CC. Patofiziologija renalne anemije. Transplantacija Nephrol Dial. 2018;34:921–922.

7. Artunc F, Risler T. Koncentracije eritropoetina u serumu i odgovori na anemiju kod pacijenata sa ili bez hronične bolesti bubrega. Transplantacija Nephrol Dial. 2007;22:2900–2908.

8. Erslev AJ, Besarab A. Eritropoetin u patogenezi i liječenju anemije kronične bubrežne insuficijencije. Kidney Int. 1997;51:622–630.

9. Wish JB, Aronoff GR, Bacon BR, et al. Pozitivan balans gvožđa kod hronične bolesti bubrega: koliko je previše i kako reći? Am J Nephrol. 2018;47:72–83.

Howard RL, Buddington B, Alfrey AC. Izlučivanje albumina, transferina i željeza u urinu kod dijabetičara. Kidney Int. 1991;40:923–926.

I itd.