Karakterizacija rizika od odbacivanja bubrega prije i nakon transplantacije sekvenciranjem imunološkog repertoara B ćelija

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Proučavanje imunološkog repertoara u kontekstu transplantacije organa pruža važne informacije o tome kako adaptivni imunitet može doprinijeti i modulirati odbacivanje transplantata. Ovdje karakteriziramo imunološki repertoar periferne krvi pojedinaca prije i poslijebubregtransplantaciju pomoću sekvenciranja receptora B ćelija u longitudinalnoj kliničkoj studiji. Osobe koje razviju odbacivanje nakon transplantacije imaju raznolikiji imunološki repertoar prije transplantacije, što ukazuje na predispoziciju za rizik od odbacivanja nakon transplantacije. Dodatno, tokom 2 godine praćenja, pacijenti koji razviju odbacivanje pokazuju specifičan skup proširenih klonova koji perzistiraju nakon odbacivanja. Iako postoji sveukupno smanjenje raznolikosti perifernih B ćelija, vjerovatno zbog povećane opće izloženosti imunosupresiji u ovoj kohorti, otkrivanje specifične upotrebe gena IGHV kod svih pacijenata koji odbijaju potvrđuju da zajednički skup imunogenih antigena može dovesti do odbacivanja nakon transplantacije. Naši nalazi mogu imati kliničke implikacije za predviđanje i kliničko liječenje odbacivanja transplantata bubrega.

Bubregtransplantacija je preferirani tretman završnog stadijuma bubrežne bolesti (ESRD) i hroničnebubregbolest. Iako je došlo do značajnih poboljšanja u tehnologijama i podudaranju tkiva na osnovu testiranja histokompatibilnosti za humane leukocitne antigene (HLA)l donora/primaoca, predviđanje ishoda transplantata još uvijek je neriješen problem. Izmjereno nepodudaranje tkiva na drugim manjim, ne-HLA lokusima23 također može dovesti do aloimune ozljede s akutnim i kroničnim odbacivanjem, što rezultira lošim dugoročnim ishodima transplantata4. Štaviše, oko 50 postobubregalografti, bez većih HLA nepodudarnosti, i dalje se gube unutar 10 godina od transplantacije². Prethodno smo pretpostavili da ne-HLA lokusi mogu uticati na imuni odgovor primaoca na njegovbubregdonor graft6. More research needs to be done to better understand and predict the recipient's risk of rejection to substantially improve long-term patient and graft outcomes. Nevertheless, the diversity of the immune response to various immunogenic epi-topes is as yet, poorly understood. The role of T cells in organ transplant rejection has been demonstrated, but there is increasing appreciation of the additional role of B cells and antibodies in triggering this process8. In this regard, B-cell receptor sequencing(BCRSeq)is a promising high-throughput technique that allows the sequencing of millions of Immunoglobulin (Ig)regions in parallel to study the immune response. The key feature of B cells is their enormous diversity. Each individual is capable of producing >1013 različitih antitela0, što im omogućava da prepoznaju široku lepezu stranih antigena. Ljudski BCR ili Ig se sastoje od dva identična teška lanca (I) formirana od pet izotipova: IgM, IgD, IgA, IgE i IgG, i dva laka lanca. Intaktno antitijelo sadrži varijabilni i konstantni domen. Vezivanje antigena se javlja u varijabilnom domenu, koji nastaje rekombinacijom seta varijabilnih (V), diverziteta (D) i spajanja (J) segmenata gena koji formiraju imunološki repertoar B-ćelija, a njegova raznolikost je uglavnom koncentrisana u komplementarna determinirajuća regija 3 (CDR3). Tokom procesa sazrevanja afiniteta dolazi do somatske hipermutacije (SHM) u varijabilnom regionu. Snažan adaptivni imunološki odgovor se oslanja na ekspanziju klonova B-ćelija i proces koji se naziva sazrijevanje afiniteta, tokom kojeg se somatske mutacije uvode u rearanžmane Ig gena i biraju se B ćelije sa većim afinitetom za dati antigen.

Proučavanje imunološkog repertoara kod transplantacije organa ključno je za razumijevanje onoga što pokreće i održava proces odbacivanja i kako to može na kraju ubrzati put ka neuspjehu transplantata. Sa napretkom sekvenciranja sljedeće generacije i robusnim računskim pristupima, možemo proučavati VDJ regiju do finih detalja,12. Do danas, analiza imunološkog repertoara T-ćelija ububregtransplantacija je provedena u vrlo ograničenom broju pacijenatal3-15, i iako je BCRSeq primijenjen na druge bolesti i imunološke odgovore ljudi, kao što su multipla sdleroza6, vakcina protiv gripa7 ili poremećaji imunodeficijencije8, postoji nedostatak studija o transplantaciji odbacivanje. Ububregtransplantacija, BCRSeq je proveden samo u kontekstu tolerancije, HLA senzibiliziranbubregkandidati za transplantaciju koji su podvrgnuti terapiji desenzibilizacije20, i infiltracija B-ćelija koja uspoređuje klonsku ekspanziju u krvi i transplantatu2l. Još jedna aplikacija za BCRSeq u transplantaciji je ranije objavljena u maloj skupini od 12 primatelja presađenog srca.

Prepoznajući važnost humoralnog kraka imunološkog odgovora u kasnom odbacivanju transplantata i kroničnom neuspjehu alografta, karakteriziramo imunološki repertoar periferne krvi koristeći BCRSeq u prospektivnoj, longitudinalnoj studiji. Nalazimo da je raznolikost imunološkog repertoara prije transplantacije veća kod onih osoba koje odbacujububregkoji takođe pokazuje ekspanziju određenih klonova i IGHV gena tokom 24 meseca praćenja. Ovi rezultati mogu pomoći u predviđanju rizika od odbacivanja prije presađivanja i mogu imati kliničke implikacije u otkrivanju određenih antigena koji izazivaju odbacivanje.

Cistanche je dobar za funkciju bubrega

Rezultati

Predmeti studija. Izvršili smo BCRSeq u 83 uzorka periferne krvi od 27 jedinstvenih pacijenata i izvršili analitički cevovod prikazan na Sl.1. U ovoj studiji su uzete u obzir tri grupe kliničkih fenotipova, definisane zaslijepljenim očitavanjem centralne patologije serijskih biopsija alografta koje su ocijenjene Banffovim kriterijima23,24 i indeksom kroničnog oštećenja alografta (CADI): Neprogresori (NP; n=10) imali nizak neinkrementalni CADI skor bez akutnog odbacivanja, naprednjaci bez odbacivanja (PNR;n=10) ​​su imali inkrementalni CADI skor tokom 2 godine bez odbijanja, a naprednjaci sa odbacivanjem (PR; n=7) su imali inkrementalni visoki CADI rezultati tokom 2 godine sa epizodama odbijanja. Demografija, uzrocibubregneuspjeh, a upotreba imunosupresije je data u tabeli 1. Važno je istaknuti neke karakteristike ovih pacijenata. Studija roditelja u koju su ovi pacijenti bili uključeni imala je ukupnu nisku stopu (17 posto) biopsijom potvrđenog akutnog odbacivanja (srednje{min, max}=12 {6,24}mjesečno vrijeme odbacivanja). Svi ovi pacijenti su bili pod niskim imunološkim rizikom za odbacivanje (vršni status reaktivne senzibilizacije antitijela na panelu<20%), and="" also="" had="" low="" rates="" of="" generation="" of="" donor-specific="" antibody(dsa)and="" only="" two="" of="" the="" rejection="" phenotype="" patients="" included="" in="" the="" analysis="" had="" dsa.="" the="" generation="" of="" dsa="" to="" hla="" and="" mica="" was="" measured="" in="" all="" serial="" sera="" throughout="" the="" study25.="" national="" experience="" with="" similar="" immunosuppressive="" protocols="" in="" similar="" patient="" cohorts="" have="" confirmed="" similar="" good="" clinical="" outcomes="" and="" low="" rejection="">

Sekvenciranje imunološkog repertoara B-ćelija. BCRSeq je urađen na uzorcima genomske DNK(gDNA) ekstrahovanim iz krvnih ugrušaka na 81 uzorku iz 27bubregprimaoci transplantacije u tri vremenske tačke (0,6,24 mjeseca). Sekvenciranjem je dobiven ukupan broj od 327,703 čitanja (prosječno 4045/uzorak) nakon kontrole kvaliteta (pogledajte odjeljak o metodama). Za validaciju rezultata i daljnju procjenu svakog izotipa, dodatno smo ekstrahirali RNK iz podudarnih PBMC koji su bili dostupni za 55 uzoraka, prikupljenih u isto vrijeme kada i krvni ugrušak, i izvršili komplementarno DNK(cDNA) sekvenciranje na većoj dubini da bismo dobili 1.773.330 čitanja. za IgD (prosjek 31,667/uzorak), 1,708,227 očitavanja za IgM (prosjek 30,504/uzorak), 973,444 očitavanja za IgA (prosjek 17,383/uzorak), 139,7345 očitavanja za IgG (i 5/7,{24, srednja vrijednost 24, }} čita za IgE (srednja vrijednost 5178/uzorak) (dodatna slika 1). Biblioteke za svaki izotip su posebno amplificirane i zatim objedinjene za sekvencioniranje; stoga, komparativna unakrsna analiza izotipova nije izvodljiva.

Kao što je prikazano na slici 1b, definisali smo klon kao grupu ćelija koje potiču od zajedničkog molekula pretka koji ima isti IGHV i IGHJ segment, istu CDR3 dužinu i 90 posto nukleotidnog identiteta između CDR3 kao što je prethodno definisano u studijama adaptivnog B. -ćelijski odgovori'8. Ova definicija omogućava proučavanje raznolikosti, zajedničkih ili zajedničkih čunjeva i klonske ekspanzije u kontekstu aloimuniteta ububregtransplantacije. Broj jedinstvenih čunjeva po pojedincu u svakoj vremenskoj tački prikazan je kao dijagram u dodatnom materijalu (dopunska slika 1). Radi strogosti analize podataka, diskontirali smo uzorke sa<100 clones="" (69="" samples="" from="" gdna="" and="" 55="" samples="" from="" cdna="" were="" left="" for="" further="" study.="" ige="" isotype="" was="" discarded="" completely="" due="" to="" a="" very="" small="" number="" of="" reads).="" in="" addition,="" we="" filtered="" outpatient="" 8="" in="" the="" np="" group="" from="" subsequent="" analysis,="" as="" we="" recognized="" after="" the="" run,="" that="" he="" had="" developed="" ebv+post="" transplant="" lymphoproliferative="" disease(ptld)at="" 2.2="" years="" post="">bubregtransplantaciju, koju karakterizira proliferacija Epstein Barra

Slika 1. Cjelokupni cevovod studije.a Šematski prikaz strukture antitijela i procesa VDJrekombinacije odgovornog za raznolikost proizvedenu u imunološkom repertoaru.b B-ćelijski klon definisan kao ćelije zajedničkog pretka i c analitički cevovod studije: B-ćelija sekvenciranje za gDNK i cDNK, analiza raznolikosti s obzirom na broj klonova (bogatstvo) i učestalost svakog klona (Shannon entropija), analiza mreže i klonska i IGHV genska analiza

B ćelije inficirane virusom (EBV). Uočili smo povećan broj klonova u vremenu 6 kod ovog pacijenta, sa manjom klonskom raznovrsnošću ranijebubregtransplantacije i 24 mjeseca nakon transplantacije bubrega. Budući da su biblioteke amplificirane iz nepromjenjive količine šablona, ​​veća frakcija B ćelija u krvi mogla je rezultirati većim brojem klonotipova predstavljenih u sekvenciranim proizvodima. Zbog posebnog i jedinstvenog patološkog procesa kod ovog pacijenta, ovaj uzorak je isključen iz buduće analize.

Raznolikost B-ćelija prije transplantacije povezana je s odbacivanjem. Kao što je prikazano na slici 1c, ispitali smo raznolikost imunološkog repertoara B-ćelija s obzirom na bogatstvo vrsta (broj jedinstvenih klonova) i Šenonovu entropiju (jednačina (1) iz metoda) kroz vremenske tačke i kliničke ishode koristeći model linearne regresije s obzirom na broj klonova ili entropije kao zavisne varijable i kliničkog ishoda ili SHM kao nezavisne faktorske varijable. Repertoar ranijebubregtransplantacija u PR je bila znatno raznovrsnija nego u NP (bogatstvo: P-vrijednost=0.005, entropija: P-vrijednost=0.01) sa istim trendom koji je trajao 6 mjeseci nakonbubregtransplantacije (bogatstvo: P-vrijednost=0.02, entropija: P-vrijednost=0.02), i bez vidljivih grupnih razlika 2 godine nakon transplantacije (slika 2a i Dodatna slika 2). Podaci sekvencioniranja cDNK nakon transplantacije pokazali su isti trend u većoj raznolikosti repertoara 6 mjeseci nakon transplantacije, pretežno za IgD izotipove (bogatstvo: P-vrijednost=0.02, entropija: P-vrijednost=0. 03) (slika 2b i dopunska slika 2). Nije bilo zbunjujućeg efekta na podatke iz različitih demografskih i kliničkih varijabli, kao što su dob primaoca, spol, rasa, izvor donatora, tip imunosupresije, HLA neusklađenost i uzrok zatajenja bubrega. Budući da bi odgovor B-ćelija 1--godišnjaka (minimalna starost u podacima) i 19- godina (maksimalna starost u podacima) mogao biti veoma različit, izvršili smo osjetljivost analiza koja je isključila ova dva pacijenta i rezultati su ostali značajni (NP vs. PR u trenutku 0: bogatstvo: P-vrijednost=0.01, entropija: P-vrijednost=0.03). U drugoj mjeri raznolikosti imunološkog repertoara, procijenili smo SHM, definiran kao učestalost mutacija u svakom segmentu gena V, i pronašli trend za veći broj SHM za PR prije transplantacije i trend za veći SHM u IgD izotipu. u PR 6 mjeseci nakon transplantacije (P-vrijednost=0.06).

Raznolikost B-ćelija se mijenja tokom vremena prema kliničkom ishodu. Da bismo utvrdili da li se različitost imunološkog repertoara mijenja kroz vrijeme prema kliničkom ishodu, modelirali smo longitudinalne podatke koristeći linearne modele mješovitog efekta uzimajući u obzir interakciju između kliničkog ishoda i vremena. Otkrili smo da su se NP i PR različito ponašali tokom vremena nakon transplantacije, pokazujući povećanje raznolikosti u NP i smanjenje raznolikosti u PR, dok je za PNR raznolikost ostala nepromjenjiva tokom vremena. Ovo je uočeno za gDNK (bogatstvo: P-vrijednost=0.007, entropija: P-vrijednost=0.001, slika 3a) i sve izotipove za cDNK, pri čemu su najznačajnije razlike u entropiji za IgM i IgD izotipove (IgA: P-vrijednost=0.07, IgD: P-vrijednost=0.02, IgG: P-vrijednost=0.05, IgM: P-vrijednost=0.04, sl. 3b). Grafikoni za bogatstvo sa odgovarajućim P-vrednostima prikazani su na dodatnoj slici 3. Kao što je primećeno na dijagramima, jedna osoba ima dodatni uzorak u vremenu od 32 meseca, što bi moglo da iskrivi rezultate, pa je izvršena analiza osetljivosti koja je isključila ovaj uzorak iz analizu i posmatranje sličnih rezultata osim za IgG i IgM izotipove kod kojih se gubi značaj (gDNK-entropija: P-vrijednost=0.004. cDNK-entropija: IgA: P-vrijednost=0.1 , IgD: P-vrijednost=0.05, IgG: P-vrijednost=0.08, IgM: P-vrijednost=0.1).

Na mjere raznolikosti može uticati biološko i tehničko uzorkovanje. Raznolikost uzorka može se značajno razlikovati od ukupne raznolikosti u repertoaru jer je zastupljen samo djelić milijardi ćelija, što je poznato kao problem nestalih vrsta. Tehničko uzorkovanje može postojati jer svaki uzorak može varirati u dubini sekvenciranja i određenom stepenu eksperimentalnih grešaka. Da bismo se pozabavili problemom nedostajućih vrsta, koristili smo alat Recon (rekonstrukcija procijenjenih klonova iz uočenih brojeva)29, koji procjenjuje ukupnu distribuciju veličine klonova. Recon daje precizne i robusne procjene skupa mjera raznolikosti, uključujući bogatstvo i entropiju, omogućavajući robusna poređenja različitosti između pojedinaca. Da bismo se pozabavili dubinom sekvenciranja i određenim stepenom eksperimentalnih grešaka, izveli smo strategiju smanjenja uzorkovanja; veoma dobro korištena strategija u analizi imunološkog repertoara11,17,30. U Recon analizi (dodatna slika S4: A-E), i bogatstvo i raznolikost su replicirani za podatke gDNK. U podacima cDNK, izotip IgD vremena 6 pokazuje trend, ali nije dostigao značaj iako su longitudinalni rezultati za IgA, IgD i IgG izotipove replicirani. U analizi smanjenja uzorkovanja (dodatna slika S4: F–J), sve se replicira, ali vrijeme je 0 za podatke o gDNK. Ovo može biti posljedica ograničenja tog smanjenja uzorkovanja

Slika 2 Violin dijagrami koji pokazuju broj klonova (bogatstvo) u tri klinička ishoda. broj klonova u vremenima 0, 6 i 24 iz gDNK uzoraka. b Broj klonova u trenutku 6 za izotip IgD iz cDNK uzoraka. P-vrijednosti se dobijaju prilagođavanjem modela linearne regresije uzimajući u obzir broj klonova kao zavisnu varijablu i klinički ishod kao nezavisnu faktorsku varijablu (n=27 uzoraka). Violinski dijagrami predstavljaju gustinu vjerovatnoće podataka za svaku vrijednost. Marker tačke predstavlja srednju vrijednost s interkvartilnim rasponom. Izvorni podaci se daju kao izvorni fajl podataka

Slika 3 Longitudinalni podaci ucrtani uklopljenom linijom za svaki klinički ishod. a Raznolikost mjerena Šenonovom entropijom predstavljenom kroz vremenske tačke tri klinička ishoda (NP, PNR, PR) u gDNK. b Raznolikost mjerena Šenonovom entropijom predstavljenom kroz vremenske tačke tri klinička ishoda (NP, PNR, PR) izotipovima u cDNK. P-vrijednosti odgovaraju terminu interakcije definisanom vremenom × kliničkim ishodom prilagođavanjem linearnog modela miješanog efekta (n=27 uzoraka). Svaka tačka predstavlja entropiju po uzorku tokom vremena sa svojom postavljenom linijom i intervalom pouzdanosti. Izvorni podaci se daju kao izvorni fajl podataka

strategije, posebno za podatke o gDNK gdje je broj sekvenci mnogo manji nego za podatke cDNK. U gDNK smo ograničili analizu na pojedince sa najmanje 1000 klonova da sačuvamo dovoljno sekvenci. Uzorkovanje je obavljeno na minimalno 1062 klona u poređenju sa 62,173 klona u cDNK. Uprkos ovom ograničenju, uočili smo trend za vrijeme 0, sačuvali značaj za longitudinalnu analizu u gDNK i replicirali sve asocijacije u cDNK. U obje analize (recon i downsampling), ponovili smo rezultate, uprkos nekim ograničenjima koja su ovdje istaknuta, pokazujući valjanost prethodno prijavljenih rezultata.

B-ćelijske mreže pokazuju razlike u klonskoj ekspanziji. Repertoar B-ćelija može se prirodno predstaviti kao mreža zasnovana na raznolikosti sekvenci31. U našim podacima, razvili smo vizuelnu mrežu za svaki uzorak (slika 4 i dopunske slike 5-7) gde je svaki vrh predstavljao jedinstveni BCR, a broj identičnih BCR na osnovu njihovih nukleotidnih sekvenci je definisao veličinu vrha. Ivica postoji između vrhova kada pripadaju istom klonu, tako da se klasteri B ćelija mogu prikazati kao grupe međusobno povezanih vrhova koji formiraju klon. Za kvantifikaciju mreže koristili smo Gini indeks, koji je mjera neujednačenosti koja je primijenjena na distribucije vrhova i klastera. Kada se primeni na veličinu temena, Gini(V), predstavljena je ukupna klonska priroda. Ako je Gini(V) bliži 1, vrhovi su nejednaki pokazujući proširenje nekih od njih, au suprotnom bliže 0. Kada se primjenjuje na veličinu klastera, Gini(C), predstavljena je klonska dominacija. Ako je bliže 1, klasteri su nejednaki i stoga predstavljaju dominantne klonove, ako su bliže 0, svi klasteri su jednake veličine.

Na slici 4 prikazujemo primjer izraženih vizuelnih i kvantitativnih razlika između reprezentativnih repertoara B-ćelija iz svake od tri grupe kliničkih ishoda, u tri različite vremenske tačke (prije transplantacije i nakon transplantacije 6 i 24 mjeseca) . U PR repertoaru postoji obilje sekvenci B-ćelija koje formiraju sve veće klastere klonova u poređenju sa NP dok se PNR nalazi između. Tokom vremena, PR grupa pokazuje smanjenje broja BCR i jedinstvenih klonova u poređenju sa NP. Detaljne mreže B-ćelija svakog pojedinca u studiji date su na dodatnim slikama. 5–7. Zanimljivo je promatrati vrlo raznolik obrazac mreže B-ćelija kod pojedinca koji je razvio PTLD u NP grupi (dodatna slika 5), ​​bez ekspanzije B-ćelija prije transplantacije, praćenog povećanjem B-ćelija nakon 6. mjeseci i jasna klonska ekspanzija praćena smanjenjem raznolikosti 24 mjeseca nakon transplantacije.

Daljnjom evaluacijom mjere Gini indeksa (slika 5), ​​PR grupa je dosljedno pokazivala značajno veće mjere i za vrh i za klaster u odnosu na grupu NP, što sugerira da su pacijenti iz PR grupe imali veću klonsku ekspanziju na početku,

Slika 4 Mreže repertoara B-ćelija od tri osobe koje predstavljaju tri klinička ishoda kroz vremenske tačke. Svaki vrh predstavlja jedinstveni BCR koji je veličina temena definisana brojem identičnih BCR-ova s ​​obzirom na nukleotidne sekvence. Ivica postoji između vrhova kada pripadaju istom klonu kao što je prethodno definisano, tako da su klasteri grupe međusobno povezanih vrhova koji formiraju klon. Svaki uzorak pokazuje Gini indeks dobiven za veličinu temena (Gini(V)) i veličinu klastera (Gini(C)). BCR odražava ukupne receptore B-ćelija za taj specifični uzorak, a klonovi odražavaju ukupan broj jedinstvenih klonova. Izvorni podaci se daju kao izvorni fajl podataka

i dalja ekspanzija nakon transplantacije podskupa dominantnih klonova (P-vrijednost [linearna regresija] < 0.05,="" slika="" 5).="" pnr="" grupa="" se="" nalazi="" između="" np="" i="" pr="" kao="" što="" je="" prethodno="" prikazano,="" iako="" se="" ovo="" vrijeme="" značajno="" razlikuje="" u="" odnosu="" na="" np="" grupu="" u="" trenutku="" 24="" (p-vrijednost="" [linearna="" regresija]="">< 0,05).="" iako="" su="" podaci="" za="" sliku="" 5="" generirani="" iz="" gdnk="" podataka,="" igm="" izotip="" za="" cdnk="" pokazao="" je="" iste="" razlike="" (p-vrijednost="" [linearna="" regresija]="0.05)" (dopunska="" slika="">

Određeni klonovi i IGHV geni su uključeni u odbacivanje.

Iako je naš primarni fokus bio da okarakteriziramo repertoar B-ćelija po grupama kliničkih ishoda, pružajući globalnu sliku imunološkog odgovora prije i nakon transplantacije, naši podaci su nam također omogućili da izvršimo analizu specifičnu za Ig sekvencu na klonu i IGHV-u. nivo gena.

Za klonsku analizu, procijenili smo povezanost prisustva ili odsustva svakog pojedinog klona (ukupno 118.223 klona) s kliničkim ishodom (PR, PNR, NR) u svakoj vremenskoj tački. Primjenom Fisherovog egzaktnog testa, pronašli smo 8, 4 i 21 klon koji je nominalno povezan s kliničkim ishodima za svaki od 0, 6, odnosno 24 mjeseca (dopunska tabela 1). Iako nijedan nije prošao višestruku korekciju testiranja, uglavnom zbog nedostatka snage pošto imamo ograničenu veličinu uzorka u analizi sa hiljadama parametara (klonova), mogli smo primijetiti da je nekoliko klonova koji su se približili značajnosti (P-vrijednost < {{="" 11}}.05)="" podijeljeni="" su="" među="" pacijentima="" samo="" u="" pr="" grupi="" i="" obogaćeni="" 24="" mjeseca="" nakon="">

Također smo razmotrili da li su neki klonovi opstali tokom vremena uzorkovanja, više od drugih, unutar svakog kliničkog ishoda (dopunska slika 9). Uzimamo u obzir dvije različite mjere: (1) broj upornih klonova i (2) klonsku ekspanziju. Primijetili smo da su klonovi koji su bili uporni u PR-u bili značajno više prošireni (P-vrijednost [linearna regresija]=0.01, PR vs. NP) i pokazali trend većeg broja perzistentnih klonova (P- vrijednost [linearna regresija]=0.09). Dalje smo ispitali da li su ovi uporni klonovi također podijeljeni među različitim pojedincima unutar svakog kliničkog ishoda. Od 263 otkrivena trajna klona, ​​23 su podijeljena među pojedincima. Pet je podijeljeno unutar istog PNR-a, a šest unutar PR grupe i nijedan klon nije podijeljen između NP grupe. Ukupno, 12 zajedničkih klonova bilo je uobičajeno u obje grupe pacijenata s progresivnom kroničnom ozljedom transplantata i fibrozom tijekom vremena (PR i PNR). Spisak klonova koji se dijele među pojedincima dat je u dodatnom materijalu (Dopunska tabela 2).

Zatim smo izvršili analizu gena IGHV, posmatrajući upotrebu IGHV gena po uzorku, definisanu kao broj puta kada je svaki IGHV gen korišten, normaliziran brojem klonova (da bi se izbjegla pristranost uzorkovanja određenih IGHV gena), filtriranjem nisko izraženih gena.

Slika 5 Vertex Gini indeks ucrtan u odnosu na klaster Gini indeks. Dijagram raspršenosti predstavlja svaki uzorak u vremenima 0, 6 i 24. Okvirni grafikoni pokazuju razlike Gini(V) i Gini(C) u trenutku 24. P-vrijednosti se dobijaju iz prilagođavanja modela linearne regresije uzimajući u obzir Gini(V) i Gini(C) kao zavisnu varijablu i klinički ishod kao nezavisnu faktorsku varijablu za svaku vremensku tačku (n=27 uzoraka). U dijagramu okvira prikazano je samo vrijeme 24, ali vrijeme 0 i 6 gdje su također značajni za NP naspram PR: vrijeme 0: P (Gini (V))=0.1, P ( Gini(C))=0.05; vrijeme 6 P (Gini(V))=0.02, P (Gini(C))=0.01; vrijeme 24: P (Gini(V))=0.003, P (Gini(C))=0.01. Traka unutar okvira predstavlja srednju vrijednost, okvir definira interkvartilni raspon (IQR), a brkovi definiraju prvi i treći kvartil ± 1,5 × IQR. Izvorni podaci se daju kao izvorni fajl podataka

geni (upotreba gena IGHV > {{0}}.05 u najmanje 10 posto uzoraka), i primjena modela linearne regresije da se pronađu oni geni koji su povezani sa svakim kliničkim ishodom, u svakoj vremenskoj tački. Od 27 IGHV gena koji su prošli filter niske ekspresije, pronašli smo značajne gene između PR i NP grupe (P-vrijednost < 0.05)="" sa="" tri="" gena="" u="" trenutku="" 0,="" 7="" u="" trenutku="" 6="" i="" 16="" u="" vreme="" 24="" (sl.="" 6a–c).="" od="" ovih="" gena,="" 1="" (ighv3-11)="" na="" vrijeme="" 0,="" 5="" gena="" (ighv3-7,="" ighv3-15,="" ighv3-21,="" ighv3-23,="" ighv{="" {22}})="" u="" vremenu="" 6="" i="" 16="" gena="" (ighv1-8,="" ighv1-18,="" ighv1-46,="" ighv2-="" 5,="" ighv3-7,="" ighv{{="" 30}},="" ighv3-15,="" ighv3-23,="" ighv3-30,="" ighv3-33,="" ighv3-48,="" ighv3-74,="" ighv{{37="" }},="" ighv4-59,="" ighv4-61,="" ighv5-51)="" u="" vrijeme="" 24="" prošli="" su="" višestruku="" korekciju="" testiranja="" false="" discovery="" rate="" (fdr).="" zanimljivo="" je="" da="" smo="" otkrili="" da="" je="" ighv3-23="" bio="" najznačajniji="" i="" najzastupljeniji="" gen="" u="" sve="" tri="" vremenske="" tačke="" u="" poređenju="" np="" i="" pr="" (vrijeme="" 0:="" p-vrijednost="0.04," vrijeme="" 6:="" p-="" vrijednost="0.003," vrijeme="" 24:="" p-vrijednost="0.02)" (slika="" 6d).="" osim="" toga,="" procijenili="" smo="" da="" li="" su="" ighv3-23="" sekvence="" previše="" zastupljene="" među="" zajedničkim="" sekvencama="" iz="" prethodne="" klonske="" analize.="" otkrili="" smo,="" koristeći="" analizu="" obogaćivanja="" sa="" fišerovim="" egzaktnim="" testom,="" da="" su="" sekvence="" ighv3-23="" bile="" značajno="" prezastupljene="" u="" oba,="" upornih="" klonova="" koji="" su="" podijeljeni="" među="" pojedincima="" (dopunska="" tabela="" 2)="" (p-vrijednost="">< 2,2="" ×="" 10="" -="" 16="" ),="" i="" klonovi="" povezani="" s="" kliničkim="" ishodom="" u="" trenutku="" 24="" (dodatna="" tabela="" 1)="" (p-vrijednost="">< 2,2="" ×="" 10-16).="" primetili="" smo="" da="" je="" pojedinac="" 9="" u="" nr="" grupi,="" za="" koji="" je="" utvrđeno="" da="" deli="" neke="" uporne="" klonove="" sa="" naprednjacima="" u="" prethodnim="" analizama,="" klasifikovan="" u="" pr="" grupu="" u="" svim="" vremenskim="" tačkama.="" nije="" bilo="" zbunjujućeg="" efekta="" na="" podatke="" iz="" različitih="" demografskih="" i="" kliničkih="" varijabli,="" kao="" što="" su="" dob="" primaoca,="" spol,="" rasa,="" izvor="" donatora,="" tip="" imunosupresije,="" hla="" neusklađenost="" i="" uzrok="" zatajenja="" bubrega.="" osim="" toga,="" utvrđeno="" je="" da="" je="" ovaj="" gen="" značajan="" i="" za="" igm="" (p-vrijednost="" [linearna="" regresija]="0.008)" i="" igd="" (p-vrijednost="" [linearna="" regresija]="0.05)" izotipove="" na="" osnovu="" cdnk="" 24="" mjeseca="" nakon="" transplantacije,="" u="" skladu="" s="" prethodnim="" rezultatima="" koji="" pokazuju="" konzistentnost="" sa="" ova="" dva="" izotipa="" koja="" su="" najviše="" obogaćena="" u="" pr="" grupi.="" samo="" tri="" druga="" gena="" su="" pronađena="" kao="" značajna="" u="" cdnk="" analizi,="" i="" svi="" su="" bili="" 24="" mjeseca="" nakon="" transplantacije="" u="" igd="" i="" igm="" izotipovima="" (ighv3-15="" i="" ighv4-="" 61="" u="" igd="" i="" ighv4-39="" u="">

Diskusija

Raznolikost je suštinska karakteristika imunološkog sistema, a kod zdravih ljudi ključna je protiv patogena za borbu protiv bolesti. Kod transplantacije organa, klinički se uspostavlja namjerna terapijska manipulacija kako bi se omogućilo da se strani organ aktivno ignorira ili prihvati od strane imunološkog sistema vlastitog pacijenta kako ne bi pokrenuo aloimuni odgovor, što bi dovelo do odbacivanja. B ćelije su važna komponenta ovog procesa, a naša grupa i drugi su pokazali da su ključne u prezentaciji antigena32,33 i proizvodnji aloantitijela34,35. U ovom radu koristili smo visoko propusno sekvenciranje B-ćelija kako bismo bolje razumjeli raznolikost i klonalnost B-ćelija ububregcirkulaciju primaoca transplantata, i prije presađivanja i nakon 24 mjeseca praćenja, uz longitudinalnu procjenu imunološkog repertoara B-ćelija. Sveukupno, naša analiza pokazuje veću raznolikost B-ćelija prije presađivanja, uzdužne razlike sa smanjenjem raznolikosti praćenom klonskom ekspanzijom, i povećanje upotrebe određenih IGHV gena među onima koji odbacuju transplantaciju.

Ključna nezadovoljena klinička potreba za transplantacijom organa je nedostatak neinvazivnog, osjetljivog i preciznog predviđanja transplantacijske ozljede i loših ishoda. Ovaj zadatak je komplikovan činjenicom da postoje različiti faktori koji utiču na preživljavanje transplantata36. U ovoj studiji smo otkrili da stabilne osobe imaju smanjenu raznolikost imunološkog repertoara B-ćelija prije transplantacije u odnosu na one koji su odbacili organ. Sljedeći korak bi trebao biti demonstriranje prediktivne vrijednosti raznolikosti repertoara B-ćelija, pružanje potencijalnih boljih biomarkera za predviđanje odbacivanja prije presađivanja, te mogućnost primjene u kliničkoj njezi i odabiru imunosupresije prije i poslijebubregtransplantacija. Ako je ova osobina rezultat bilo kojeg faktora koji doprinosi smanjenju raznolikosti kod stabilnih jedinki, kao što su okolišni ili genetski faktori, mogli bismo ne samo predvidjeti odbacivanje nego ga i spriječiti. Zaista, vrlo nedavna otkrića su pokazala da su varijacije u imunološkom sistemu vođene okolišno-mentalnim i genetskim faktorima37,38. U našoj studiji nismo mogli pronaći nikakvu povezanost s bilo kojim demografskim i drugim kliničkim karakteristikama pacijenata (dob, spol, rasa, imunosupresija, izvor organa, neusklađenost HLA i ESRD). U tom smislu, potrebna nam je nova analiza kako bismo potvrdili da li specifični faktori utiču na raznolikost repertoara B-ćelija i ishode transplantacije.

Još jedno zanimljivo otkriće u našoj studiji pokazuje da se imunološki repertoar ponaša različito tokom vremena u zavisnosti od grupe kliničkog ishoda. Za one koji pokazuju odbacivanje organa nakon transplantacije, raznolikost B-ćelija je u početku veća, a zatim opada s vremenom, dok se obrnuti trend raznolikosti vidi kod pacijenata koji ne razviju odbacivanje ili kroničnu ozljedu transplantata. Iako su svi pojedinci primili isto opterećenje imunosupresije nakon transplantacije, neko moguće objašnjenje za smanjenu raznolikost kod pacijenata koji razviju odbacivanje može se odnositi na činjenicu da ti pacijenti primaju privremeno znatno povećano opterećenje imunosupresije za liječenje odbacivanja, a zatim se drže na višoj bazi. Iako bi ovo moglo objasniti smanjenje raznolikosti B-ćelija tokom vremena i objasniti razliku 24 mjeseca nakon transplantacije, malo je vjerovatno da će to biti uzrok, jer je smanjena raznolikost u PR grupi

Slika 6 Heatmap i boxplot za analizu upotrebe gena IGHV. Toplotna karta koja prikazuje IGHV gene odabrane kao nominalno značajne (P-vrijednost < 0.05)="" u="" vrijeme="" 0="" (a),="" 6="" (b)="" i="" 24="" (c)="" za="" np="" vs.="" pr.="" crvena="" skala="" boja="" predstavlja="" ekspresiju="" svakog="" gena="" u="" uzorcima.="" trake="" na="" vrhu="" pokazuju="" klinički="" ishod="" i="" uzrok="" esrd-a.="" okvirni="" grafikon="" koji="" prikazuje="" ighv3-23="" izraz="" u="" vremenskim="" tačkama="" za="" np="" naspram="" pr="" (vrijeme="" 0:="" p-vrijednost="0.04," vrijeme="" 6:="" p-vrijednost="0.003," vrijeme="" 24:="" p="" -vrijednost="0.02)" (d).="" traka="" unutar="" okvira="" predstavlja="" srednju="" vrijednost,="" okvir="" definira="" interkvartilni="" raspon="" (iqr),="" a="" brkovi="" definiraju="" prvi="" i="" treći="" kvartil="" ±="" 1,5="" ×="" iqr.="" p-vrijednosti="" se="" dobijaju="" iz="" prilagođavanja="" modela="" linearne="" regresije="" uzimajući="" u="" obzir="" v="" gene="" kao="" zavisnu="" varijablu="" i="" klinički="" ishod="" kao="" nezavisnu="" varijablu.="" (n="12" uzoraka).="" izvorni="" podaci="" se="" daju="" kao="" izvorni="" fajl="">

također se vidi 6 mjeseci nakon transplantacije, u vrijeme kada pacijenti još nisu razvili odbacivanje, što sugerira da će vjerovatno biti uključeni i drugi aktivni procesi. Opažanje selektivne klonalne ekspanzije s dominantnijim klonovima samo kod pacijenata koji razviju i odbacivanje i/ili progresivnu hroničnububregozljeda transplantacije, sugerira biološki relevantnu selekciju vođenu aloantigenom, postojanost i ekspanziju određenih klonova tokom vremena, što objašnjava ukupno smanjenje vremenske raznolikosti. Iako možemo pretpostaviti da je ekspanzija ovih klonova vjerovatno povezana s aloimunom ozljedom transplantata, direktni dokazi da je ekspanzija ovih klonova aloimuna zahtijevaju dodatne in vitro i studije na životinjama.

Akutno odbacivanje ostaje najjači negativni faktor za dugotrajno preživljavanje transplantata uprkos brzom poboljšanju imunosupresivnih terapija39,40. Ova studija takođe pronalazi povezanost upotrebe nekih IGHV gena sa odbacivanjem, iako bi uzročnu vezu trebalo istražiti u budućim studijama. IGHV3-23 je najzanimljiviji gen u gDNA analizi jer se značajno više koristi kod pacijenata koji razviju odbacivanje u svim izmjerenim vremenskim tačkama i previše je zastupljen u upornim klonovima koji se dijele među pojedincima i klonovima obogaćenim među odbačeni pacijenti 24 mjeseca nakon transplantacije. Ovaj gen je također potvrđen 24 mjeseca nakon transplantacije u oba izotipova IgD i IgM u cDNK analizi. IGHV3-23 je u velikoj mjeri povezan s lošom prognozom kod hronične limfocitne leukemije41 i pokazalo se da je velika većina IGHV3-23 sekvenci zadržala sposobnost posredovanja u interakcijama superantigena42. B-ćelijske superantigene proizvode virusi i bakterije, za koje je poznato da se vežu za imunoglobuline izvan uobičajenih mjesta vezanja antigena43. Pokazalo se da susreti B ćelija sa superantigenom izazivaju proliferaciju, aktivaciju, migraciju i deleciju44. U transplantiranombubregpostoji mogućnost kontinuirane izloženosti virusnim i bakterijskim antigenima, što se odnosi na etiologiju primarnog vezikoureteričnog refluksa kao uzroka ESRD-a ili sekundarnog urinarnog refluksa nakon reimplantacije transplantiranog uretera, ili refluksa nakon infekcije urinarnog trakta, rizik od koji se povećava s izloženošću kroničnoj imunosupresiji nakon transplantacije. Prilagodili smo rezultate analiza za uzrok zatajenja bubrega, između ostalih kliničkih i demografskih faktora; rezultati o kojima se prethodno raspravljalo ostaju značajni iako smo shvatili da je NP pogrešno klasifikovan pacijent u analizi (slika 6) imao refluksnu bolest. Cheng et al. su također ranije otkrili da klonovi u tkivu biopsije primaoca transplantacije bubrega infiltrirani B ćelijama imaju prevlast IGHV3-23 gena između ostalih45. Grover i saradnici 46 su pokazali da antitela za ovaj određeni gen ne prepoznaju donorske HLA antigene, već da su specifična za E. coli, a Modena i sar.47 su pokazali da je opterećenje broja bakterija u urinu mnogo veće kod pacijenata sa intersticijske fibroze i tubularne atrofije u odnosu na one sa graftom koji je dobro funkcionisao. Proširujemo ove nalaze pokazujući da je upotreba gena IGHV3-23 značajno veća kod pacijenata koji višestruko odbijaju u perifernoj krvi i može implicirati određene uobičajene antigene u izazivanju odbijanja. U budućnosti, ekspresija IGHV3-23 bi se potencijalno mogla koristiti za praćenje imunološkog odgovora prema transplantiranombubreg.

Proširujući našu studiju pomoću sekvenciranja cDNK, mogli bismo replicirati većinu naših rezultata u dva od izotipa (IgM i IgD), pokazujući manju raznolikost prije transplantacije u NP, kao dva najznačajnija u longitudinalnoj analizi s većom ekspanzijom i dominantnijim klonove u mrežnoj analizi i replikaciju IGHV3-23 gena. Prva antitijela koja se proizvode u humoralnom imunološkom odgovoru uvijek su IgM i brzo napreduju do proizvodnje svih različitih izotipova, IgD, IgA, IgG i IgE, ali poseban interes zahtijeva IgD izotip48. IgD je ko-eksprimiran sa IgM, a izlučeni IgD postoji i ima funkciju u krvi, sekretima sluzokože i na površini efektorskih ćelija urođenog imuniteta kao što su bazofili49. Bazofili su bijele stanice koje se bore protiv virusa, bakterija, parazita i gljivica, a uključene su u bubrežne bolesti i odbacivanje transplantata50. Dakle, još jedan dokaz koji povezuje odgovore B-stanica na proces odbacivanja virusa i bakterija.

Potrebne su buduće studije kako bi se pokazalo da je ova aktivacija posljedica razlika u mikrobiomu primatelja s implikacijama u dijagnostici i terapiji.

Ova studija nam je omogućila da identifikujemo relevantnost nekih od ovih BCR klonova, identifikujemo BCR klonove od kliničkog značaja sa odbacivanjem alografta i pokažemo da postoji verovatna relevantnost ovih klonova sa heterolognim imunitetom, s obzirom na obogaćivanje ovih klonova kod pacijenata sa kolonizirani urinarni trakt prije transplantacije i njihov biološki značaj za reakcije patogena. Bolje razumijevanje ponašanja imunološkog repertoara ububregtransplantacije ne bi bile moguće bez primjene BCRSeq u kombinaciji sa robusnom implementacijom računskih i statističkih cevovoda. Ipak, postoji nekoliko ograničenja našeg pristupa koja treba prepoznati: Prvo, veličina našeg uzorka je visoko odabrana i relativno mala u grupi pedijatrijskih pacijenata i iako smo u našoj analizi postigli statističku značajnost i potvrdili u dva različita izvora podataka, bit će potrebna daljnja analiza kako bi se potvrdili naši rezultati. Drugo, naši rezultati nisu izuzeti od uticaja koji biološko i tehničko uzorkovanje može imati u našoj analizi. Mjere raznolikosti zavise od nekoliko pitanja: činjenice da je samo dio milijardi ćelija u repertoaru zastupljen u uzorku, razlike u dubini sekvenciranja i moguće eksperimentalne greške. Opsežno smo kontrolisali sve ove probleme, prvo u laboratoriji, provodeći istu količinu krvi za svaki uzorak u istoj seriji, a zatim, računski i statistički, primjenjujući alat za izviđanje za procjenu ukupnog repertoara i izvodeći smanjenje uzorkovanja za kontrolu dubine sekvenciranja. i eksperimentalne greške. Treće, izveli smo BCRSeq koristeći dva različita izvora, gDNK i cDNK. Sekvenciranje gDNK olakšava procjenu klonalnosti date sekvence Ig jer će broj očitanih sekvenci biti proporcionalan broju gDNK molekula. Sekvenciranje cDNK daje procjenu relativnog nivoa ekspresije različitih Ig sekvenci u repertoaru. Pokazalo se da za T-ćelijske receptore, karakterizacija klonotipa izvedena na cDNK nije tako dobra kao kod gDNK pokazujući da se relativni udio pojedinačnih klonova uvelike razlikuje15 ili da je praćenje HIV-specifičnih klonova uspješno samo s gDNK, ali ne mRNA51. Četvrto, uticaj imunosupresije može biti zbunjujući faktor u ovoj vrsti analize. U ovoj studiji, svi uzorci dolaze iz kliničkog ispitivanja u kojem su svi pacijenti nakon transplantacije primili isto opterećenje imunosupresijom. Ipak, kontrolirali smo dvije vrste na bazi steroida i bez steroida kako bismo bili sigurni da ovo nije problem, ne primjećujući nikakve razlike u rezultatima. Konačno, kohorta koju ovdje predstavljamo je ona dječjih transplantacija. Većina transplantiranih kliničkih aspekata je slična kod djece i odraslih. Imunosupresija i korišteni režimi su slični, kreatinin je glavni serumski biomarker, akutno odbacivanje se utvrđuje prvenstveno biopsijom uz korištenje Banffovih kriterija, a mehanizmi odbacivanjabubregtransplantacije su generalno slične52, stoga se većina istraživanja urađenih kod odraslih ili djece može primijeniti na oboje. Međutim, drugi aspekti kao što su neusklađenost/nepridržavanje imunosupresije, imunološki aspekti, primarne bolesti bubrega, koje dovode do zatajenja bubrega, često povezane s urološkim problemima, i imunizacije koje su potrebne prije transplantacije mogu se razlikovati, stoga daljnje analize u odrasla populacija će biti neophodna za generalizaciju ovih nalaza.

Unatoč ovim ograničenjima, naši podaci otkrivaju da je veća raznolikost prije transplantacije uočena kod osoba koje odbacuju organ, što ukazuje na predispoziciju odbacivanja, što može imati buduće implikacije u predviđanju rizika od odbacivanja prije ugrađivanja, izbora imunosupresije i kliničke skrbi. prakse. Nakon 24 mjeseca praćenja, uočeno je ukupno smanjenje raznolikosti tokom vremena praćeno postojanošću i ekspanzijom određenih klonova i većom upotrebom nekoliko IGHV gena u grupi koja je odbacila, što može implicirati određene uobičajene antigene u pokretanju odbacivanja. Poseban interes je uočen za povećanu upotrebu gena IGHV3-23 među pacijentima koji su odbacili jer je ranije bio povezan sabubregtransplantacije i može biti ključna komponenta za pokretanje procesa odbacivanja. Ovaj rad predstavlja longitudinalnu analizu imunološkog repertoara B-ćelija u transplantaciji organa čime se promovira više studija koje potvrđuju ove nalaze jer mogu imati kliničke implikacije u predviđanju, kontroli, praćenju i liječenju.bubregodbacivanje.

Metode

Dizajn studija. Proučavali smo 81 uzorak za gDNK i 56 odgovarajućih uzoraka za cDNK uzdužno u vremenima 0, 6 i 24 mjeseca od ukupnog broja od 27 pedijatrijskih primatelja koji su primili primarnibubregtransplantacija. Ispitanici u ovoj studiji dolaze iz kliničkog ispitivanja (SNSO1 multicentrična studija) gdje su ispitanici randomizirani (1:1) na tradicionalni režim imunosupresije na bazi niskih doza steroida (steroidi, standardna indukcija daklizumaba do drugog mjeseca nakon transplantacije, i održavanje imunosupresije takrolimusom (Prograf, Astellas Pharma) i MMF (CellCept, Hoffman-La Roche) ili režimom imunosupresije bez steroida (produžena indukcija daklizumaba do šestog mjeseca nakon transplantacije, takrolimus i MMF). upisani nakon odobrenja IRB-a i imali informirani pristanak. U ovoj studiji, 14 pacijenata je primilo režim izbjegavanja steroida, dok je 13 primalo imunosupresivni režim zasnovan na steroidima53 i nijedan od ovih pacijenata nije primio imunosupresiju prije transplantacije jer je to bio jedan od kriterija isključenja. Tretman za odbacivanje sastojao se od tri impulsa intravenoznog kortikosteroida (10 mg/kg) i intenziviranja početne imunosupresije.

Svi uzorci korišteni u studiji imali su pridruženu serijsku biopsiju alografta, koju je očitao centralni patolog, koristeći semi-kvantitativne histološke rezultate. Kliničko akutno odbacivanje je definirano kao epizoda akutnog odbacivanja, povezana s disfunkcijom transplantata, na osnovu više od 10 posto porasta serumskog kreatinina u odnosu na početne vrijednosti, a potvrđeno je centralnim patološkim očitavanjem biopsija prema ažuriranoj Banffovoj klasifikaciji23,24. Hronična ozljeda alografta je definirana korištenjem indeksa kroničnog oštećenja alografta (CADI). Pacijenti su klasificirani u tri klinička ishoda definirana CADI rezultatom i epizodama odbacivanja. Neprogresori (NP) su imali nizak non-inkrementalni CADI skor na tri serijske biopsije tokom 2 godine, bez akutnog odbacivanja, progresori bez odbacivanja (PNR) su imali veći CADI rezultat na svojim serijskim biopsijama tokom 2 godine i inkrementalni kroz vremenske tačke bez odbacivanja, a progresori sa odbacivanjem (PR) imali su inkrementalno visoke CADI rezultate na svojim serijskim biopsijama tokom 2 godine sa epizodama odbijanja. Ovi pacijenti su vrlo pažljivo odabrani iz veće grupe od 120 pacijenata, koji su odgovarali za demografske varijable, i za sve NP i PNR da nisu imali dokaza o upali na biopsiji ili subkliničkoj ozljedi mjereno odsustvom antitijela specifičnih za donora. Nijedan nije imao HLA ili haploidentičan graft jer je to bio kriterijum isključenja za upis54. Svi uzorci su prikupljeni iz 12 različitih američkih pedijatrijskih programa transplantacije između 2004. i 2006. godine, prema protokolima koje je odobrio IRB. Studiju je također odobrio The Human Research Protection Program (HRPP) Univerziteta Kalifornije, San Francisko i Univerziteta Stanford kako bi se omogućila analiza uzoraka biobanke. Svi pacijenti/staratelji dali su informirani pristanak za učešće u istraživanju, uz potpuno poštovanje Helsinške deklaracije. Kliničke i istraživačke aktivnosti o kojima se izvještava u skladu su sa principima Istanbulske deklaracije kako je navedeno u Istanbulskoj deklaraciji o trgovini organima i transplantacijskom turizmu.

Izolacija gDNK i RNK. Uzorci krvi (4,5 ml) su sakupljeni u epruvetu sa crvenim vrhom od 5 ml i inkubirani na sobnoj temperaturi 30 minuta dok se ne formira ugrušak. Uzorak je zatim centrifugiran na 2000 × g tokom 5 minuta pomoću rotora koji se okreće. Gornji sloj seruma je zatim prebačen u drugu krioepruvetu i ugrušak je čuvan u istoj epruveti na -80 stepeni do upotrebe. Genomska DNK iz ugrušaka cijele krvi ekstrahirana je korištenjem Clotspin Baskets i Gentra PuregeneBlood Kit (Qiagen, Valencia, CA).

Za ekstrakciju RNK izbubregbiopsija iglom (Qiagen, Valencia, CA) i pohranjena na -80 stepeni; ukupna RNK je ekstrahirana upotrebom glavne mješavine od 790 µl TRIzola i 10 µl glikogena. Uzorci tkiva su homogenizovani, inkubirani na 15 do 25 stepeni 5 minuta i dodato je 160 µl hloroforma za razdvajanje faza. Smeša je ponovo inkubirana na 25 stepeni tokom 2 minuta, nakon čega je usledilo centrifugiranje na 4 stepena i korišćena za ekstrakciju RNK koristeći RNeasy Micro Kit (Qiagen Katalog br.4004). Količina i integritet RNK određivani su pomoću Thermo Scientific NanoDrop ND-2000 UV-Vis spektrofotometra i Agilent Bioanalyzera, respektivno.

Sekvenciranje B-ćelija. Pripremljene su PCR reakcije sa šablonom genomske DNK

od 100 ng gDNK alikvota za generiranje šest nezavisnih barkodiranih biblioteka po uzorku. Korišteni su multipleksirani prajmeri za IgH J ili FR1 ili FR2 okvirne regije prema BIOMED-2 dizajnu55. Deset nukleotidnih 'barkod sekvenci' u prajmerima korišćene su za označavanje identiteta uzorka i repliciranja identiteta biblioteke za svaku PCR reakciju. PCR je obavljen sa AmpliTaq Gold (Roche) polimerazom po sledećem programu: 94 stepena 5 min; 35 ciklusa (94 stepena za 30 s, 60 stepeni za 45 s, 72 stepena za 90 s); i konačno produženje na 72 stepena u trajanju od 10 min. Provedena je druga PCR reakcija kako bi se osiguralo da biblioteke nisu amplificirane do zasićenja prije pročišćavanja gelom i sekvenciranja. Sve u svemu, 0,4 ul svakog prvog PCR proizvoda je šabloniziralo drugu PCR reakciju koristeći eksterne prajmere specifične za 454 sekvence linkera; amplifikacija je izvedena po programu: 94 stepena u trajanju od 15 minuta, 12 ciklusa (94 stepena za 30 s, 60 stepeni za 45 s, 72 stepena za 90 s), i finalno proširenje na 72 stepena u trajanju od 10 minuta. Stopa greške AmpliTaq Golda trebala bi imati minimalan učinak na identifikaciju klonski srodnih sekvenci ili procjenu stopa somatskih mutacija u sekvencama kao što je diskutovano negdje drugdje56. cDNA je sintetizirana iz ukupno 300 ng RNK uz prajming pomoću nasumičnih heksamera. Šabloni su amplificirani PCR-om upotrebom Biomed IGHV prajmera u okviru 1 (FR1) i prajmera specifičnih za izotip koji se nalaze u prvom egzonu konstantnih regiona. Ovi prajmeri18,57 takođe su kodirali otprilike polovinu sekvenci Illumina linkera potrebnih za generisanje klastera i sekvenciranje na MiSeq instrumentu. Identitet uzorka je kodiran bar kodovima identifikatora od osam nukleotida multipleksa u svakom prajmeru. Za prepoznavanje Illumina klastera, četiri randomizirana nukleotida su kodirana u prajmerima odmah nakon Illumina linker sekvence u prajmerima konstantnog regiona. Svaki izotip antitijela za svaki uzorak je amplificiran u zasebnoj PCR reakciji, kako bi se spriječilo stvaranje unakrsnih himernih PCR proizvoda izotipova. PCR je sproveden sa AmpliTaq Gold (Roche) prema uputstvima proizvođača i korišćen je program od 94 stepena u trajanju od 7 minuta, 35 ciklusa (94 stepena za 30 s, 58 stepeni za 45 s, 72 stepena za 120 s) i konačno produžetak na 72 stepena 10 min. Drugi PCR korak je korišten za dodavanje preostalog dijela Illumina linkera u amplikone i izveden je s Qiagen Multiplex PCR kitom (Qiagen) prema uputama proizvođača, koristeći 0,4 mikrolitra prvog PCR proizvoda kao šablonu u Reakcija od 30 mikrolitara. PCR program za drugi PCR korak bio je 94 stepena tokom 15 minuta, 12 ciklusa (94 stepena za 30 s, 60 stepeni za 45 s, 72 stepena za 90 s), i konačno produženje na 72 stepena za 10 minuta. Proizvodi svake PCR reakcije su spojeni u procijenjenim ekvimolarnim količinama, podvrgnuti elektroforezi na agaroznim gelovima i gel ekstrahiran s QIAquick kompletima (Qiagen). Visoko propusno sekvencioniranje šablonskih biblioteka genomske DNK izvedeno je na platformi 454 (Roche) upotrebom titanijumske hemije. Sekvenciranje biblioteke cDNK je izvedeno na Illumina MiSeq instrumentu korištenjem 600-kitova za sekvenciranje ciklusa. Potpuna lista prajmera koji se koriste sa MiSeq (M154 i M155) i 454 Titanium (T7) uključena je u Dopunske podatke 1.

Čitanja sekvencioniranja obrađena su na sljedeći način: očitavanja uparenih krajeva spojena su korištenjem FLASH58 gdje su nakon toga sekvence demultipleksirane i odrezane od bar kodova i IGHV prajmerskih sekvenci. V, D i J regioni i V–D (N1), D–J (N2) spojevi su identifikovani pomoću programa za poravnanje IgBLAST59. Sekvence su filtrirane da bi se uklonili ne-IGH artefakti, sekvence sa insercijom ili delecijama V gena, himerne sekvence i nefunkcionalne sekvence. Na nivou uzorka isključili smo one sa<100 clones="" (defined="" by="" same="" v="" and="" j="" segments,="" same="" cdr3="" length,="" and="" 90%="" nucleotide="" identity)="" as="" a="" control="" for="" bad="" quality="" samples.="" after="" quality="" control,="" for="" gdna,="" we="" had="" complete="" longitudinal="" data="" for="" 69="" samples="" at="" times="" 0,="" 6,="" and="" 24="" with="" a="" total="" number="" of="" 327,703="" reads="" (mean="" 4045="" per="" sample).="" for="" cdna,="" we="" had="" complete="" data="" for="" 55="" matched="" samples,="" although="" no="" time="" 0="" samples="" were="" further="" available.="" in="" this="" case,="" we="" had="" isotype-="" specific="" information="" (1,773,330="" reads="" for="" igd="" (31,667="" per="" sample),="" 1,708,227="" reads="" for="" igm="" (30,504="" per="" sample),="" 973,444="" reads="" for="" iga="" (17,383="" per="" sample),="" 139,7345="" reads="" for="" igg="" (24,953="" per="" sample),="" and="" 29,000="" reads="" for="" ige="" (5,178="" per="">

Analiza diverziteta. Raznolikost se mjeri bogatstvom vrsta s obzirom na broj klonova po uzorku. Ova mjera ne uzima u obzir učestalost svake vrste, tako da smo također koristili Shanonovu entropiju (H) za mjerenje raznolikosti koja pruža

informacije o distribuciji vrsta u populaciji. H je definisan kao:

gdje je N broj jedinstvenih klonova, a pi frekvencija klona i. H se kreće od 0 (uzorak sa samo jednim klonom) do Hmax ¼ log2N (uzorak sa ujednačenom distribucijom klonova).

Zatim smo koristili opći linearni model da pronađemo povezanost između bogatstva i entropije s kliničkim ishodom u različitim vremenskim točkama. Ovaj model smo prilagodili svim dostupnim kliničkim varijablama prikazanim u Tabeli 1 kako bismo bili sigurni da je bilo koja od karakteristika pacijenta zbunjujući faktor

Za modeliranje longitudinalne komponente podataka, primijenili smo model linearnog mješovitog efekta uzimajući u obzir model uslovnog rasta kao što je prikazano na dodatnoj slici 10. Da bismo primijenili ovaj model, koristili smo paket lme4 u R uzimajući u obzir interakciju između kliničkog ishoda i vremena do pronađite povezanost s bogatstvom i raznolikošću s vremenom kao slučajnim efektom.

Da bismo se pozabavili činjenicom da na mjere raznolikosti mogu utjecati problem nestalih vrsta (zastupljen je samo djelić milijardi ćelija u repertoaru) i greške u sekvenciranju i eksperimentalne greške, izveli smo dvije strategije uz potpunu analizu podataka. Prvo smo koristili alat Recon (rekonstrukcija procijenjenih klonova iz uočenih brojeva)29 za rješavanje problema nestalih vrsta. Recon je modifikovana metoda maksimalne vjerovatnoće koja daje ukupnu raznolikost repertoara iz mjerenja na uzorku. Recon daje precizne i robusne procjene skupa mjera raznolikosti, uključujući bogatstvo i entropiju, omogućavajući robusna poređenja različitosti između pojedinaca. Drugo, izveli smo strategiju smanjenja uzorkovanja uzimajući nasumični podskup očitavanja za svaki uzorak jednak najmanjoj veličini sekvenciranja, nakon čega je uslijedilo ponovno izračunavanje klonova B-ćelija da bi se prilagodili dubini sekvenciranja i riješili moguće eksperimentalne greške. Za gDNK postoje uzorci s vrlo niskim očitavanjem (<1000), a="" kako="" bismo="" izbjegli="" gubitak="" mnogih="" sekvenci="" i="" stvarnosti="" podataka,="" isključili="" smo="" ukupno="" devet="" uzoraka="" koji="" su=""><1000 reads.="" in="" the="" case="" of="" cdna,="" this="" was="" not="" necessary.="" we="" generated="" ten="" random="" subsamples="" to="" account="" for="" possible="" stochastic="" effects="" and="" performed="" the="" diversity="" analysis="" at="" each="" time="" point="" and="" the="" longitudinal="" data="" analysis="" on="" the="" mean="" value="" of="" ten="" independently="" downsampled="" diversity="">

Analiza mreže. Algoritam generiranja mreže je vrlo sličan onom prije definiranom31. Ukratko, svaki vrh predstavlja sekvencu B-ćelije gdje je veličina definirana svim identičnim sekvencama. Rubovi se izračunavaju pomoću definicije klona (isti V i J segmenti, ista dužina CDR3 i 90 posto nukleotidnog identiteta između CDR3) i klasteri predstavljaju svaki klon u repertoaru. Analiza je urađena korištenjem paketa grafova u R koristeći layout_sa_graphopt opcijom za generiranje dijagrama.

Da bismo kvantifikovali mrežu, izračunali smo Gini indeks za veličinu vrha i veličinu klastera. Gini indeks je mjera neravnomjernosti koja se intenzivno koristi za mjerenje raspodjele bogatstva. Mjeri nejednakost između vrijednosti raspodjele frekvencija. Koristili smo Gini funkciju iz jednog paketa u R da izračunamo Gini koeficijent za veličinu vrha i distribuciju veličine klastera. Gini koeficijent od nule izražava savršenu jednakost, a Gini koeficijent od 1 izražava maksimalnu nejednakost.

Klonska analiza. Da bismo proučavali specifične klonove povezane s kliničkim ishodima, napravili smo matricu sa svim klonovima koji su prisutni u više od jednog uzorka (ukupni broj=118, 223) po svim uzorcima u svakoj vremenskoj tački. Zatim smo proučavali povezanost s kliničkim ishodom svakog pojedinog klona definirajući jednu varijablu po klonu kao prisutna/neprisutna. Konačno, primijenili smo Fisherov egzaktan test da uzmemo u obzir značaj u tabelama 2 × 3 za svaki klon u svakoj vremenskoj tački. Također smo proučavali klonove postojanosti definirane onim klonovima koji se nalaze u više od jedne vremenske točke kod svake individue. Zatim, da bismo uzeli u obzir razlike prema kliničkom ishodu, primijenili smo linearni model koji je kao zavisnu varijablu definirao broj klonova (za mjerenje razlika u postojanosti) i broj brojanja svakog klona (za mjerenje klonalne ekspanzije) i klinički ishod kao nezavisni prediktor.

Analiza upotrebe gena IGHV. Da bismo proučavali IGHV gene, procijenili smo upotrebu IGHV gena po uzorku kao broj puta kada je svaki gen korišten normaliziran brojem klonova kako bi se izbjegla prevelika zastupljenost određenih IGHV gena. Za statističku analizu, filtrirali smo one gene sa vrlo niskom ekspresijom (upotreba IGHV-a/klonovi < {{0}}.05)="" u="" najmanje="" 10="" posto="" uzoraka.="" ukupno="" smo="" analizirali="" 27="" ighv="" gena="" koji="" odgovaraju="" 63="" uzorka.="" zatim="" smo="" primijenili="" linearni="" model="" da="" bismo="" pronašli="" one="" gene="" koji="" su="" bili="" povezani="" s="" kliničkim="" ishodom="" u="" svakoj="" vremenskoj="" tački="" i="" ispravili="" ove="" rezultate="" višestrukim="" testiranjem="" koristeći="" benjamini="" i="" hochberg="" fdr="">< 0,05.="" ovaj="" model="" smo="" prilagodili="" svim="" dostupnim="" kliničkim="" varijablama="" prikazanim="" u="" tabeli="" 1="" kako="" bismo="" bili="" sigurni="" da="" je="" bilo="" koja="" od="" karakteristika="" pacijenta="" zbunjujući="">

Sažetak izvještavanja. Dodatne informacije o dizajnu istraživanja dostupne su u Sažetku izvještavanja o istraživanju o prirodi koji je povezan s ovim člankom.

Reference

1.Cai,J.& Terasaki,PI Praćenje antitijela nakon transplantacije i HLA 1.(identifikacija epitopa antitijela. Curr.Opin.Immunol. 20,602-606(2008).

2. Sigdel, TKet al. Non-HLA antitela na imunogene epitope predviđaju evoluciju hronične povrede bubrežnog alografta.J. Am. Soc. Nephrol.23, 750-763 (2012).

3. Li, L. et al. Kompartmentalna lokalizacija i klinička važnost MICA antitijela nakon transplantacije bubrega. Transplantacija 89,312-319(2010).

4. Lamb, KE, Lodhi, S. & Meier-Kriesche, H.-U. Dugoročno preživljavanje bubrežnog alografta u Sjedinjenim Državama: kritička ponovna procjena. Am.J. Transplant. 11, 450-462(2011).

5. Naučni registar primalaca transplantata. Dostupno na: https://rtr. transplant.hrsa.gov/annual_reports/2012/Default.aspx.(Pristup: 24. maja 2018.) Pineda, S. et al. Nove neusklađene varijante antigena koji nisu histokompatibilni

6. Poboljšati sposobnost predviđanja rizika od odbacivanja posredovanog antitijelima kod transplantacije bubrega. Front. Immunol. 8,1687 (2017).

7. Valuiskikh, A.Baldwin, WM& Fairchild, RLNedavni napredak i nove perspektive u proučavanju odgovora T ćelija na alografte. Am.J. Transplant.10, 117-1125 (2010).

8. Zarhin, V, Chalasani, G. & Sarwal, MM Jin i jang B ćelija u odbacivanju i toleranciji presatka. Transplantacija. Rev.24,67-78(2010).

9. Georgiou, G. et al. Obećanje i izazov visokopropusnog sekvenciranja plus repertoara antitijela. Nat. Biotechnol.32,158-168(2014).

10. Schroeder, HW Sličnost i divergencija u razvoju i ekspresiji repertoara mišjih i ljudskih antitijela. Dev. Comp. Immunol. 30, 119-135(2006).

11. Yaari, G. & Kleinstein, SH Praktične smjernice za analizu sekvenciranja repertoara receptora B-ćelija. Genome Med.7,121 (2015).

12. Shugay, M. et al. VDJtools: Objedinjujuća post-analiza repertoara T ćelijskih receptora. PLOS Comput. Biol.11, e1004503 (2015).

13. Alachkar, H. et al. Kvantitativna karakterizacija repertoara T-ćelija i biomarkera u odbacivanju transplantata bubrega. BMC Nephrol.17,181(2016). 14. Morris, H.et al. Praćenje T ćelija reaktivnih donora: Dokazi za klonsku deleciju kod tolerantnih pacijenata sa transplantacijom bubrega. Sci. Transl. Med.7,272ral0 (2015).

15. Dziubianau, M.et al. Analiza repertoara TCR sekvenciranjem nove generacije omogućava kompleksnu diferencijalnu dijagnozu patologije povezane s T ćelijama. Am. J.Transplant.13,2842-2854 (2013).

16. Palanichamy, A.et al. B ćelije sa zamenjenom klasom imunoglobulina formiraju aktivnu imunološku osovinu između CNS-a i periferije kod multiple skleroze. Sci. Transl. Med.6, 248ra{4}ra106(2014).

17. Strauli, NB & Hernandez, RD Statistički zaključak o odgovoru konvergentnog repertoara antitela na vakcinu protiv gripa. Genome Med. 8,60 (2016).

18. Roskin, KM i dr. IgH sekvence kod uobičajene varijabilne imunodeficijencije otkrivaju promijenjen razvoj i selekciju B ćelija. Sci. Transl. Med.7,302ra135 (2015).

19.Massart, A.,Ghisdal,L.,Abramowicz, M.& Abramowicz,D.Operativna tolerancija u transplantaciji bubrega i povezani biomarkeri. Clin. Exp. Immunol.189,138-157(2017).

20. Beausang, JFet al.B ćelijski repertoari u HLA-senzibiliziranim kandidatima za transplantaciju bubrega koji su podvrgnuti terapiji desenzibilizacije.J. Transl. Med.15, 9(2017).

21. Ferdman, J. et al. Ekspanzija i somatska hipermutacija klonova B-ćelija u odbačenim ljudskim bubrežnim transplantacijama. Transplantacija 98,766-772(2014).

22. Vollmers, C. et al. Praćenje farmakološki izazvane imunosupresije sekvenciranjem imunološkog repertoara radi otkrivanja akutnog odbacivanja alografta kod pacijenata sa transplantacijom srca: Studija o dijagnostičkoj tačnosti dokazanog koncepta. PLOS Med. 12,e1001890 (2015).

23. Solez, K. et al. Banff'05 Izvještaj sa sastanka: Diferencijalna dijagnoza hronične ozljede alografta i eliminacija kronične nefropatije alografta (CAN). Am. J. Transplant.7,518-526(2007). imunosupresija u transplantaciji bubrega: da li je vrijeme da se to razmotri kao standardna terapija? Kidney Int.76,825-830(2009).

28. Legendre, C. et al. Trogodišnji ishodi kod pacijenata sa transplantacijom bubrega randomiziranih na imunosupresiju bez steroida ili ukidanje steroida, s enterično obloženim mikofenolat natrijem i ciklosporinom: studija beskonačnosti. J. Transplant.2014,1-8(2014).

29. Kaplinsky, J. & Arnaout, R. Robustne procjene ukupne raznolikosti imunološkog repertoara iz mjerenja visoke propusnosti na uzorcima. Nat. Commun.7, 11881 (2016).

30. Stern, JNHet al. B ćelije koje naseljavaju mozak multiple skleroze sazrevaju u drenirajućim cervikalnim limfnim čvorovima. Sci. Transl. Med.6,248ra107 (2014).

31. Bashford-Rogers, RJMet al. Mrežna svojstva izvedena iz dubokog sekvenciranja repertoara ljudskih B-ćelijskih receptora ocrtavaju populacije B-ćelija. Genom Res.23, 1874-1884 (2013).

32. Sarwal, Met al. Molekularna heterogenost u akutnom odbacivanju bubrežnog alografta

identifikovan profilisanjem DNK mikromrežom. N.Engl.J. Med.349, 125-138(2003). 33.Zarhhin, V., Lovelace, PA, Li, L., Hsieh, S.-C. & Sarwal, MMPhenotypic Evaluacija b-ćelija podskupova nakon rituksimaba za liječenje akutnog odbacivanja renalnog alografta u pedijatrijskih primatelja. Transplantacija 91, 1010-1018 (201).

34. Clatworthy, MR& Targeting, B. Ćelije i antitijela u transplantaciji.Amm. J. Transplant.11,1359-1367 (2011).

35. Dijke,EIet al.Bcells in transplantation.J. Transplantacija srca i pluća.35,704-710(2016).

36. Nankivell, BJ& Kuypers, DR Dijagnostika i prevencija hroničnog gubitka alografta bubrega. Lancet 378,1428-1437(2011).

37. Patin, E. et al. Prirodne varijacije u parametrima urođene imunološke ćelije prvenstveno su vođene genetskim faktorima. Nat.Immunol.19,302-314(2018). 38. Liston, A.& Goris,A. Poreklo različitosti u ljudskom imunitetu. Nat. Immunol. 19, 209-210(2018).

39. Meier-Kriesche, H.-U, Schold, JD, Srinivas, TR& Kaplan, B. Nedostatak poboljšanja preživljavanja bubrežnog alografta uprkos značajnom smanjenju stopa akutnog odbacivanja u najnovijoj eri. Am.J. Transplant.4, 378-383 (2004).

40. Keith, DS, Vranić, G. & Nishio-Lucar, A. Funkcija grafta i srednjoročni ishodi transplantacije bubrega poboljšani u posljednjoj deceniji: Analiza baze podataka o transplantaciji bubrega u Sjedinjenim Državama. Transplant. direktno 3, el66 (2017).

41. Bomben, R. et al. Ekspresija mutiranih IGHV3-23 gena u hroničnoj limfocitnoj leukemiji identifikuje podskup bolesti sa posebnim kliničkim i biološkim karakteristikama. Clin. Cancer Res. 16, 620-628(2010).

42. Levinson, AI, Kozlowski, L, Zheng, Y. & Wheatley, L. Superantigeni B-ćelija: definicija i potencijalni uticaj na imuni odgovor.J. Clin.Immunol.15, 26S-36S(1995.

43. Silverman, GJ& Goodyear, CSA model B-ćelijskog superantigena i imunobiologija B limfocita. Clin.Immunol.102,117-134(2002).

44. Silverman, GJ& Goodyear, CSConfounding B-cell defence: lekcije iz stafilokoknog superantigena. Nat. Rev. Immunol.6,465-475(2006). 45. Cheng, J.et al. Ektopične grupe B-ćelija koje se infiltriraju u transplantirane ljudske bubrege su klonske. Proc. Natl Acad. Sci. 108, 5560-5565 (2011).

46. ​​Grover, RKet al. Kostimulacijski imunogen LPS inducira klonove B-ćelija koji se infiltriraju u transplantirane ljudske bubrege. Proc. Natl Acad. Sci. SAD 109, 6036-6041(2012).

47,Modena,BDet al. Promjene u populaciji urinarnog mikrobioma koreliraju u transplantaciji bubrega s intersticijskom fibrozom i tubularnom atrofijom dokumentovanom u ranim nadzornim biopsijama. Am. J. Transpl.17, 712-723 (2017).

48. Chen, K. & Cerutti, A. Novi uvidi u enigmu imunoglobulina D. Immunol. Rev. 237, 160-179 (2010).

49. Chen, K. et al. Imunoglobulin D poboljšava imunološki nadzor aktiviranjem antimikrobnih, proinflamatornih i programa koji stimuliraju B ćelije u bazofilima. Nat. Immunol. 10, 889-898(2009).

50. Mack, M. & Rosenkranz, AR Bazofili i mastociti kod ozljede bubrega. KidneyInt.76,1142-1147 (2009).

51. Nixon, DFet al. Molekularno praćenje virusa ljudske imunodeficijencije

nef specifični citotoksični klon T-ćelija pokazuje perzistentnost DNK receptora T-ćelija specifične za klon, ali ne i mRNA nakon rane kombinovane antiretrovirusne terapije. Immunol. Lett.66, 219-228(1999).

52. Dharnidharka, VR, Fiorina, P. & Harmon, WEK Transplantacija bubrega kod djece.N.Engl. J. Med. 371, 549-558(2014).

53. Sarwal, Mmet al. Potpuno izbjegavanje steroida je efikasno i sigurno kod djece sa transplantacijom bubrega: multicentrično randomizirano ispitivanje s trogodišnjim praćenjem. Am.J.Transplant.12,2719-2729(2012).

24. Solez, K. et al.Banff 07 klasifikacija patologije bubrežnog alografta: ažuriranja i budući pravci. Am.J.Transplant.8,753-760 (2008).

54. Li, L et al. imunosupresija bez steroida od 1999:129 pedijatrijske transplantacije bubrega sa trajnim transplantatom i dobrobitima za pacijente. Am.J. Transpl. 9, 1362-1372(2009).

25. Chaudhuri, A.et al. Klinički uticaj humoralnog imuniteta u pedijatrijskoj transplantaciji bubrega.J. Am. Soc.Nephrol.24,655-664 (2013).