DIO 2: Polisaharid Cistanche Deserticola inhibira OVX-induciran gubitak kostiju kod miševa i osteoklastogenezu izazvanu RANKL

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Osteoporoza je ozbiljna bolest kostiju koja pogađa stariju populaciju. Dokazano je da Cistanche deserticola (CD), tonik i medicinska hrana koja se široko koristi u Kini, pruža efikasan tretman za osteoporozu.Polisaharid Cistanche deserticola(CDP), ekstrahovan iz CD-a, ima različita farmakološka svojstva, ali njegova uloga u formiranju i funkciji osteoklastika, kao i osteoporozi, ostaje nepoznata. Svrha ove studije je bila ekstrakcija i pročišćavanje CDP-a.(Polisaharid Cistanche deserticola)kako bi se dalje istražio njegov potencijalni mehanizam djelovanja na osteoporozu. Rezultati su pokazali da CDP(Polisaharid Cistanche deserticola) liječenje je spriječilo osteoporozu izazvanu OVX-om i poboljšalo gubitak koštane mase potiskivanjem aktivnosti i funkcije osteoklasta. Nadalje, CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)tretman značajno inhibirao osteoklastogenezu izazvanu RANKL. resorpcija kostiju i ekspresija gena specifična za osteoklaste. Mehanički, CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)inhibirao RANKL-indukovanu aktivaciju NF-xB i MAPKs signalnih puteva i posljedično utjecao na aktivaciju NEATc1 nizvodno. Nalazi u ovoj studiji sugeriraju da CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)je potencijalno siguran lijek za liječenje osteoporoze.

Liječenje osteoporoze: polisaharid Cistanche Deserticola

KLIKNITE OVDJE DA LAJATE PRAT 1

3. Rezultati

3.1. CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)sprečava gubitak koštane mase izazvan OVX in vivo

Koristili smo mišji model osteoporoze izazvane OVX da bismo istražili efekte CDP-a(Polisaharid Cistanche deserticola)liječenje osteoporoze in vivo. U poređenju sa Sham grupom, tjelesna težina OVX miševa se značajno povećala, dok je indeks uterusa smanjen, što ukazuje da je model osteoporoze uspješno konstruiran (sl. 1B i D). mikro-CT analiza tibije u OVX grupi pokazala je veliki gubitak kosti. U poređenju sa OVX grupom, broj koštanih trabekula se povećao u CDP-L grupi, dok je povećanje u CDP-H i E2 grupama bilo značajnije, a trabekule u poslednje dve grupe su postale grublje i jaz je postao manji. Kvantitativna analiza je potvrdila da nekoliko histomorfometrijskih parametara kostiju, uključujući BMD, BV/TV, BS/TV i Tb. N je imao značajno povećane vrijednosti, dok je Tb. Sp je pokazao smanjene vrijednosti u CDP-H grupi (sl. 1E i F). Histopatološki pregled H&E bojenjem je otkrio da je broj koštanih trabekula u CDP-H i E2 grupama bio značajno veći nego u OVX grupi, dok nije bilo značajnog poboljšanja u CDP-L grupi (slika 1G). Dodatno, TRAcP bojenje je pokazalo da se broj osteoklasta značajno povećao u OVX grupi, ali se smanjio u CDP-H i E2 grupama (slika 1H). CDP-L, CDP-H i E2 grupe su pokazale da inhibiraju OVX-indukovano povećanje sadržaja P, ali povećavaju sadržaj Ca u krvnom serumu. Markeri koštane apsorpcije, RANKL i TRAcP-5b, pokazali su opadajući trend u CDP-L.

3.2. CDP(Polisaharid Cistanche deserticola) potiskuje osteoklastogenezu izazvanu RANKL in vitro

Pratili smo proliferaciju ćelijaCDP-tretirani BMM koristeći dugoročni dinamički analizator slike živih ćelija u realnom vremenu. U poređenju sa kontrolnom grupom, konfluencija ćelija uCDP-tretirane grupe nisu se mijenjale u dozi<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="">CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)na osteoklastogenezu izazvanu RANKL, BMM su stimulirani sa RANKL i M-CSF u prisustvuCDPfor 7 days. TRAcP, a characteristic enzyme of osteoclasts, is considered an indicator of osteoclast function (Minkin, 1982). TRAcP staining showed that the osteoclasts treated with>1,25 µg/mLCDP(Polisaharid Cistanche deserticola)pokazao značajno smanjenu veličinu i broj. Ovi rezultati su pokazali da CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)efikasno inhibirao očekivanu osteoklastogenezu izazvanu RANKL-om bez uticaja na vitalnost ćelija.

3.3. CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)inhibira aktivnost osteoklastične resorpcije izazvane RANKL-om i ekspresiju gena specifičnu za osteoklaste

Dalje smo utvrdili efekte CDP-a(Polisaharid Cistanche deserticola)tretman na aktivnost resorpcije kostiju osteoklasta pomoću ploča obloženih hidroksiapatitom. Resorpcija kosti je glavna funkcija i standard za mjerenje aktivnosti i sposobnosti osteoklasta (Novack & Faccio, 2011). Rezultati su pokazali da CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)može značajno smanjiti resorptivno područje osteoklasta na način ovisan o dozi, što ukazuje da CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)inhibirao aktivnost resorpcije kosti izazvanu RANKL (Slike 3A i B). Konkretno, osteoklastično resorptivno područje kosti smanjilo se na približno 6,3 posto nakon tretmana sa 10 µg/mL CDP(Polisaharid Cistanche deserticola). Da bolje shvatim smetnju CDP-a(Polisaharid Cistanche deserticola)na osteoklastogenezi, mjerili smo nivoe transkripcije gena povezanih sa osteoklastima. Bez liječenja CDP-om(Polisaharid Cistanche deserticola), indukcija sa RANKL je promovirala ekspresiju gena NFATc1, CTSK, Acp5, Atp6v0d2 i Mmp9. Naprotiv, istovremena primjena CDP i RANKL značajno je smanjila regulaciju ovih pet gena.

3.4. CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)inhibira aktivaciju NFATc1 izazvanu RANKL

TRAcP bojenje je otkrilo da je CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)tretman je značajno smanjio očekivano povećanje broja zrelih osteoklasta nakon RANKL stimulacije tokom 3-7 dana (sl. 4A i B). Nadalje, istražili smo može li liječenje CDP-om djelotvorno narušiti diferencijaciju osteoklasta inhibiranjem ekspresije NFATc1. Rezultati su pokazali da je NFATc1 bio visoko izražen nakon RANKL stimulacije tokom 5 dana, što je značajno inhibirano nakon CDP-a.(Polisaharid Cistanche deserticola)tretman (sl. 4C i D). Pored toga, tretman CDP-om potisnuo je nivoe ekspresije CTSK, proteina potrebnog za normalno formiranje i funkciju osteoklasta (Bossard et al., 1996) (Slika 4E i F). Odabrali smo trenutni prikaz RANKL stimulacije tokom 5 dana kako bismo dalje istražili učinak 10 µg/mL CDP-a(Polisaharid Cistanche deserticola)tretman na translokaciju NFATc1. Očekivano, CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)tretman je značajno inhibirao RANKL-indukovanu nuklearnu translokaciju NFATc1.

3.5. CDP(Polisaharid Cistanche deserticola) inhibira RANKL izazvanu aktivaciju NF-κB i MAPKs signalnih puteva

Da bismo razjasnili mehanizme uključene u inhibiciju diferencijacije osteoklasta izazvanu CDP-om, ispitali smo uticaj CDP-a.(Polisaharid Cistanche deserticola)tretman na NF-κB i MAPKs putevima. Rezultati su otkrili da CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)tretman je imao supresivne efekte na IκB-razgradnju i fosforilaciju p65 na način ovisan o dozi. Povećana je fosforilacija tri člana porodice MAPK, posebno kinaze regulisane ekstracelularnim signalom (ERK), c-Jun N-terminalne kinaze (JNK) i p38.

Cistanche Deserticola

4. Diskusija

Osteoporoza je česta i degenerativna bolest kostiju. Trenutno postoji mnogo lijekova za kemijsku sintezu koji se koriste u kliničkom liječenju osteoporoze, kao što su estrogen i bisfosfonat. Međutim, dugotrajna upotreba ovih lijekova postupno će oslabiti kliničku učinkovitost i čak uzrokovati mnoge ozbiljne nuspojave, uključujući povećan rizik od karcinoma jajnika, dojke i endometrija i osteonekroze čeljusti (Beral, 2003; Khan et al., 2009; Lacey et al., 2002). U ovoj studiji odabrali smo CDP(Polisaharid Cistanche deserticola), efikasna komponenta ekstrahovana iz CD-a, kao terapeutsko sredstvo i pokazala da je CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)imao zaštitni efekat protiv

gubitak koštane mase kod OVX miševa i inhibiranje formiranja i funkcije osteoklasta izazvanog RANKL-om. U međuvremenu, prema teoriji tradicionalne kineske medicine "kost koja upravlja bubrezima", gubitak koštane mase pripisuje se nedostatku bubrega. Kao medicinska hrana koja tonizira bubrege, dokazano je da CD pruža efikasan tretman za osteoporozu (Fan et al., 2019; Jiang, Wang, Li i Zhang, 2016). Dakle, CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)izvađen iz ove prirodne biljke je bolja i sigurnija opcija za lijek.

Trenutno, OVX model miša je klasičan model postmenopauzalnog gubitka koštane mase kod žena, koji istražuje uzroke gubitka koštane mase i provodi intervenciju (Wehrle et al., 2015.). U skladu s tim, izveli smo bilateralnu ooforektomiju na ženkama miševa C57BL/6J kako bismo konstruirali model osteoporoze. U prethodnim studijama, doze CDP-a davane životinjama bile su 50-200 mg/kg (niska doza) i 1800 mg/kg (visoka doza) (Guo et al., 2016; Zhang et al., 2018). Ovdje je visoka doza CDP-a(Polisaharid Cistanche deserticola)kod miševa je bila 600 mg/kg, što se zasnivalo na visokoj kliničkoj dozi od 30 g CD-a u dekociji; stoga je sličan trenutnoj kliničkoj praksi. U ovoj studiji, liječenje CDP-om(Polisaharid Cistanche deserticola)značajno inhibirao OVX-indukovano povećanje tjelesne težine, što je uobičajena pojava uočena kod OVX miševa (Davis et al., 2019). Koristeći mikro-CT skeniranje i 3D rekonstrukciju, otkrili smo da je OVX doveo do primjetnog smanjenja BMD, BV/TV, BS/TV i Tb. N, i povećanje Tb. Sp, dok je CDP tretman poništio sve ove promjene. Konkretno, u poređenju sa pozitivnim lijekom, CDP bi mogao značajno poboljšati BMD OVX miševa, što je važan marker kvaliteta kostiju i koristi se za odraz stepena osteoporoze (Fuggle et al., 2019), što ukazuje da CDP ima prednost nad pozitivnim lijekom u poboljšanju BMD. Nadalje, histološki rezultati su pokazali da liječenje CDP-om može smanjiti povećanu količinu TRAcP-pozitivnih osteoklasta izazvanih OVX-om. Ovi rezultati sugeriraju da je primjena CDP-a efikasno ublažila gubitak koštane mase kod osteoporoze izazvane OVX, vjerovatno inhibiranjem formiranja osteoklasta. U skladu s gore navedenim rezultatima, otkrili smo da je CDP ovisno o dozi inhibirao formiranje i funkciju osteoklasta izazvanog RANKL-om, dok je CDP imao mali utjecaj na proliferaciju stanica prekursora osteoklasta inducirane M-CSF u našim in vitro eksperimentima.

Vezivanje RANKL i RANK može dovesti do regrutacije TRAF6 i naknadne aktivacije nekoliko nizvodnih signalnih puteva, kao što su NF-κB i MAPK (Boyle et al., 2003; Huang et al., 2006). NF-κB signalni put igra važnu ulogu u regulaciji diferencijacije osteoklasta, a utišavanje gena koji kodiraju ključne proteine ​​na ovom putu može dovesti do abnormalnog razvoja kostiju (Leibbrandt & Penninger, 2008). Dobro je utvrđeno da je NF-κB prisutan u citoplazmi nestimulisanih ćelija u kompleksu sa IκB, ali brzo ulazi u jezgro nakon RANKL stimulacije (Boyle et al., 2003). Oslobođeni IκB se zatim brzo razgrađuje, dok NF-κB aktivira specifičnu transkripciju gena, posljedično promovirajući diferencijaciju osteoklasta, sazrijevanje i apoptozu (Abdelmagid et al., 2015). U ovoj studiji rezultati su pokazali da CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)tretman je potisnuo RANKL-indukovanu aktivaciju NF-κB signalnog puta, što je pokazano inhibicijom degradacije IκB i fosforilacije p65 na način ovisan o dozi, što može uključiti njegov anti-osteoklastogeni efekat. Osim toga, signalni put MAPK, uključujući ERK, JNK i p38, usko je uključen u osteoklastogenezu izazvanu RANKL (Li et al., 2002). Nadalje, dominantni inhibitori p38 i JNK mogu spriječiti osteoklastogenezu izazvanu RANKL (Chang et al., 2008; Kim et al., 2019), dok ERK igra značajnu ulogu u preživljavanju osteoklasta (Miyazaki et al., 2000). Dobro je utvrđeno da RANKL aktivira signalni put MAPKs povećanjem fosforilacije ERK, JNK i p38 (Mizukami et al., 2002). U našoj studiji, pokazali smo da CDP potiskuje RANKL-indukovanu fosforilaciju ključnih proteina u MAPKs signalnom putu. Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da inhibicija aktivacije NF-κB i MAPKs signalnih puteva doprinosi inhibitornom efektu CDP-a na osteoklastogenezu.

Aktivacija NF-κB i MAPKs signalnih puteva promovira ekspresiju nekoliko ključnih faktora transkripcije, kao što su ćelijski onkogen fos, aktivator protein 1 i NFATc1 (Huang et al., 2006; Wagner & Matsuo, 2003). NFATc1, važan član porodice NFAT, uključen je u terminalnu diferencijaciju osteoklasta kao glavni regulator transkripcije (Asagiri et al., 2005). Prijavljeno je da embrionalne matične ćelije s nedostatkom NFATc1- ne mogu da se diferenciraju u osteoklaste pod stimulacijom RANKL-a, a ektopična ekspresija NFATc1 uzrokuje da se prekursorske stanice podvrgnu diferencijaciji zaobilazeći RANKL signalizaciju, što sugerira da NFATc1 ima ključnu ulogu u diferencijacija osteoklasta (Takayanagi et al., 2002). Rezultati našeg istraživanja pokazali su supresivni efekat CDP-a(Polisaharid Cistanche deserticola)na ekspresiju NFATc1 i njegov prateći protein CTSK. Zanimljivo je da smo primijetili da se nivo ekspresije proteina NFATc1 prvo povećava, a zatim smanjuje, dostižući najviši nivo 5. dana nakon RANKL stimulacije. Ovo je bilo u skladu sa rezultatima Baek et al. (2014), koji je posmatrao M-CSF-indukovanu degradaciju NFATc1 tokom kasne faze osteoklastogeneze kroz Cbl-indukovanu ubikvitinaciju NFATc1 na način ovisan o Src kinazi. Rezultati imunofluorescentnog testa su dosledno podržavali inhibitorni efekat CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)na aktivaciju transkripcije NFATc1. Nadalje, geni specifični za osteoklaste, uključujući CTSK, Acp5, Mmp9 i Atp6v0d2, su svi direktno regulirani NFATc1 (Y. Kim et al., 2005), supresirani su CDP-om. Ovi nalazi ilustruju da je NFATc1 meta inhibitornog efekta CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)na NF-κB i MAPKs signalnim putevima.

Polisaharid Cistanche deserticola

5. Zaključak

Ukratko, ekstrahovali smo i pročistili aktivni polisaharid iz CD-a i pokazali da je CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)pokazao zaštitni efekat na osteoporozu izazvanu OVX-om i poboljšao gubitak koštane mase potiskivanjem aktivnosti i funkcije osteoklasta. Nadalje, CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)može inhibirati diferencijaciju i funkciju osteoklasta izazvanu RANKL ometajući signalne puteve NF-κB i MAPKs i posljedično utječući na aktivaciju NFATc1 nizvodno. Zaključno, naša otkrića pružaju osnovu za širenje i primjenu CDP-a u liječenju osteoporoze.

Reference

1. Abdelmagid, SM, Sondag, GR, Moussa, FM, Belcher, JY, Yu, B., Stinett, H., … Safadi, FF (2015). Mutacija u osteoaktivinu potiče receptorski aktivator NFkappaB liganda (RANKL) posredovanu diferencijaciju i preživljavanje osteoklasta, ali inhibira funkciju osteoklasta. Journal of Biological Chemistry, 290(33), 20128–20146. https://doi.org/10.1074/jbc.M114.624270.

2. Baek, JM, Kim, JY, Cheon, YH, Park, SH, Ahn, SJ, Yoon, KH, … Lee, MS (2014). Aconitum pseudolaeve var. erektum inhibira aktivator receptora nuklearnog faktora kapa-B ligandom izazvanu osteoklastogenezu preko c-Fos/nuklearnog faktora aktiviranih T-ćelija, citoplazmatskog 1 signalnog puta i sprječavapolisaharida-indukovanog gubitka koštane mase kod miševa. Molecules, 19(8), 11628–11644. https://doi.org/ 10.3390/molecules190811628.

3. Black, DM, Bauer, DC, Schwartz, AV, Cummings, SR, & Rosen, CJ (2012). Nastavak liječenja bisfosfonatima zaosteoporozaza koga i koliko dugo? New England Journal of Medicine, 366(22), 2051–2053. https://doi.org/10.1056/ NEJMp1202623.

4. De Martinis, M., Di Benedetto, MC, Mengoli, LP, i Ginaldi, L. (2006). Senileosteoporoza: Da li je to imunološki posredovana bolest? Istraživanje inflamacije, 55(10),399–404. https://doi.org/10.1007/s00011-006-6034-x.

5. Fuggle, NR, Curtis, EM, Ward, KA, Harvey, NC, Dennison, EM, & Cooper, C. (2019). Predviđanje loma, snimanje i skriningosteoporoza. Nature Reviews Endocrinology, 15(9), 535–547. https://doi.org/10.1038/s41574-019-0220-8.

6. Hu, Y., Huang, J., Li, Y., Jiang, L., Ouyang, Y., Li, Y., … Zeng, Q. (2020).Polisaharid Cistanche deserticolainducira melanogenezu u melanocitima i smanjuje oksidativni stres putem aktivacije NRF2/HO-1 puta. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 24(7), 4023–4035. https://doi.org/10.1111/jcmm.15038.

7. Huang, H., Ryu, J., Ha, J., Chang, EJ, Kim, HJ, Kim, HM, … Kim, HH (2006). Diferencijacija osteoklasta zahtijeva TAK1 i MKK6 za indukciju NFATc1 i transaktivaciju NF-kapaB pomoću RANKL-a. Cell Death & Differentiation, 13(11), 1879–1891.

8. Liu, Y., Wang, C., Wang, G., Sun, Y., Deng, Z., Chen, L., … Xu, J. (2019). Loureirin B potiskuje osteoklastogenezu izazvanu RANKL-om i ovariektomiziraosteoporozaputem slabljenja NFATc1 i ROS aktivnosti. Theranostics, 9(16), 4648–4662. https://doi. org/10.7150/thno.35414.

9. Rachner, TD, Khosla, S., & Hofbauer, LC (2011).Osteoporoza: Sada i budućnost. Lancet, 377(9773), 1276–1287. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(10)62349-5.

10. Strom, O., Borgstrom, F., Kanis, JA, Compston, J., Cooper, C., McCloskey, EV, & Jonsson, B. (2011).Osteoporoza: Opterećenje, pružanje zdravstvene zaštite i mogućnosti u EU: Izvještaj pripremljen u saradnji sa InternationalOsteoporozaFondacija (IOF) i Evropska federacija udruženja farmaceutske industrije (EFPIA). Archives ofOsteoporoza, 6, 59–155. https://doi.org/10.1007/ s11657-011-0060-1.

11. Identifikacija i karakterizacija apolisaharidaiz korijena Morinda officinalis, kao induktor formiranja kostiju putem regulacije ekspresije ciljnog gena. International Journal of Biological Macromolecules, 133, 446–456.

12. Zhang, A., Yang, X., Li, Q., Yang, Y., Zhao, G., Wang, B., & Wu, D. (2018). Imunostimulirajuća aktivnost ekstrakta vodompolisaharidiiz Cistanche deserticola kao biljni dodatak in vitro i in vivo. PLoS One, 13(1), član e0191356. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191356.

13. Zhang, K., Ma, X., He, W., Li, H., Han, S., Jiang, Y., … Tu, P. (2014). Ekstrakti Cistanche deserticola mogu antagonizirati imunosenescenciju i produžiti životni vijek kod miševa 8 (SAM-P8) sklonih ubrzanom starenju. Komplementarna i alternativna medicina zasnovana na dokazima, 2014(2), član 601383. https://doi.org/10.1155/2014/601383.

14. Zhang, S., Zhang, Q., Zhang, D., Wang, C., & Yan, C. (2018).Anti-osteoporoza aaktivnost romana Achyranthes Biden tatapolisaharidaputem stimulacije formiranja kostiju. Carbohydrate Polymers, 184, 288–298. https://doi.org/10.1016/j.

15. Zheng, H., He, B., Wu, T., Cai, J., & Wei, J. (2020). Ekstrakcija, pročišćavanje i anti-osteoporotska aktivnost apolisaharidaod Epimedium Maxim. in vitro. International Journal of Biological Macromolecules, 156, 1135–1145. https://doi. org/10.1016/j.ijbiomac.2019.11.145.

Cistanche deserticola suplementi