Dio 1: ehinakozid izaziva apoptotičku smrt ćelija raka inhibirajući enzim za dezinfekciju nukleotida MTh1

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

sažetak:Inhibicija enzima MTH1 za saniranje nukleotidnog bazena uzrokuje opsežna oksidativna oštećenja DNK i apoptozu u stanicama raka i stoga se može koristiti kao strategija protiv raka. Budući da su prirodni proizvodi bili bogat izvor medicinskih hemikalija, u ovoj studiji koristili smo enzimsku reakciju kataliziranu MTH1- kao visokopropusnu analizu u vitro testu za traženje prirodnih spojeva sposobnih da inhibiraju MTH1.Echinacoside, jedinjenje dobiveno iz ljekovitog biljaCistanchei Echinacea, efikasno inhibirali katalitičku aktivnost MTH1 u in vitro testu. Liječenje različitih humanih ćelijskih linija raka saEchinacosiderezultiralo je značajnim povećanjem ćelijskog nivoa oksidiranog gvanina (8-oksoguanina), dok je nivo ćelijskih reaktivnih vrsta kiseonika ostao nepromijenjen, što ukazuje daEchinacosidetakođe inhibira aktivnost ćelijskog MTH1. Posljedično, liječenje ehinakozidom je izazvalo trenutno i dramatično povećanje markera oštećenja DNK i povećanje regulacije G1/S-CDK inhibitora p21, nakon čega je uslijedila izražena apoptotska ćelijska smrt i zaustavljanje ćelijskog ciklusa u kanceroznim, ali ne i u ćelijama koje nisu raka. Uzeti zajedno, ove studije su identifikovale prirodno jedinjenje kao inhibitor MTH1 i sugerišu da prirodni proizvodi mogu biti važan izvor sredstava protiv raka.

Ključne riječi: Echinacoside, MTH1, 8-oxoG, oštećenje DNK, apoptoza, zaustavljanje ćelijskog ciklusa

Cistancheekstrakt imaprotiv rakazdravstvene beneficije

Kliknite ovdje za 2. dio

Uvod

Stanični i mitohondrijski nukleozid trifosfat (NTP) i deoksinukleozid trifosfat (dNTP) je značajna meta različitih reaktivnih vrsta kiseonika (ROS).1–3 Budući da je specifičnost DNK polimeraza manje nego savršena, 4,5 oksidovani dNTP se mogu ugrađen u novosintetiziranu DNK da izazove genetske aberacije ako se ne fiksiraju.6 Na primjer, glavna oksidirana baza u nukleotidnom bazenu, 8-oksoguanin (8-oxoG), može se upariti baza sa citozinom i adeninom. Kada se ubaci u suprotni adenin tokom replikacije DNK, može potencijalno uzrokovati T: A=G: C transverziju,7 što je jedna od najčešćih mutacija pronađenih u ljudskim karcinomima.8,9 Iako većina oksidiranih slobodnih dNTP-a su uklonjeni enzimima za dezinfekciju nukleotidnog bazena, studije u prošlosti su otkrile da je skup nukleotida još uvijek važan izvor oksidiranih baza u molekulama DNK i značajan doprinos oksidativnim oštećenjima DNK.3,10 najvažniji enzim za saniranje nukleotida 15 Ipak, čak i pod nadzorom enzima za dezinfekciju bazena nukleotida, značajan dio oksidiranih dNTP-a se ugrađuje u DNK, a baze u molekulima DNK također mogu biti oksidirane direktno pomoću ROS-a.6 Ćelije se tada oslanjaju na razrađenije strategije koje uključuju različite DNK glikozilaze, kao što su OGG1 i MUTYH, i procesi popravke DNK, uključujući popravku ekscizije baze (BER) i popravku neslaganja (MMR), za fiksiranje problematičnih baza u molekulima DNK.10,16,17 BER a nd MMR normalno popravljaju brojne oksidirane baze u DNK dnevno i tako igraju važnu ulogu u zaštiti integriteta i stabilnosti genoma.

U ćelijama koje su pod povišenim oksidativnim stresom, povećana inkorporacija oksidiranih nukleotida u DNK može nadjačati kapacitet ćelijske popravke i pokrenuti odgovor na oštećenje DNK (DDR).18 Trajna DDR signalizacija će dovesti do zaustavljanja ćelijskog ciklusa, preranog ćelijskog starenja iliapoptoza, čime se postavlja barijera za tumorigenezu.19 Ipak, iako ćelije raka pokazuju visoko povećanu oksidativnu napetost i stvaraju potencijalno smrtonosni teret oksidiranih nukleotida20, one mogu preživjeti starenje povezano s DDR-om iliapoptoza.21 Veliki broj studija je pokazao da MTH1, efektivnim uklanjanjem opasnog izobilja 8-oxodGTP i 2-OH-dATP u tumorskim ćelijama, igra ključnu ulogu u razvoju raka.22 MTH1 je bio otkriveno je da je prekomjerno eksprimiran u različitim tipovima karcinoma,23–25 i nivoima 8-oxoG, a stepen oksidativnih lezija DNK bio je manji u tumorima nego u okolnim normalnim tkivima.26–28 Funkcionalno, prekomjerna ekspresija MTH1 značajno je smanjena broj DNK mutacija uočenih u embrionalnim fibroblastima miša s nedostatkom MMR10 i omogućile ćelijama da prevladaju onkogeno Ras-indukovano prerano ćelijsko starenje i apoptozu;29 dok je supresija MTH1 spriječila razvoj raka kod miševa s nedostatkom OGG{18}30 i promovirala ROS-indukovana DDR i ćelijska senescencija u Ras-transformiranim ćelijama.3,29,31 Dakle, iako MTH1 igra zaštitnu ulogu sprečavanjem ROS-indukovanih mutacija u zdravim ćelijama, ove studije su otkrile da je MTH1 posebno potreban za nastanak i preživljavanje ćelija raka. Nedavne studije su pružile više dokaza koji podržavaju ulogu MTH1 u razvoju raka.31–34 Potiskivanje MTH1 od strane RNAi ili inhibitora malih molekula u različitim ćelijskim linijama raka rezultiralo je značajno povećanom inkorporacijom 8-oxo d G u genomsku DNK , što je dovelo do opsežnih oštećenja DNK, apoptotske ćelijske smrti i smanjenog preživljavanja ćelija raka.32,33 U studijama ksenotransplantata na mišu, inhibicija MTH1 efikasno je potisnula rast eksplantata raka. Važno je da supresija MTH1 nije uticala na rast i preživljavanje normalnih ćelija, verovatno zato što normalne ćelije imaju niži ROS i stoga manje zavise od MTH1 za preživljavanje.32,33 Ovi nalazi ukazuju na to da je inhibicija MTH1 obećavajuća nova strategija za borbu protiv raka.

Prirodni proizvodi su bili bogat izvor medicinskih jedinjenja.35 Mnogi moderni terapeutici, uključujući lekove protiv raka, izvedeni su iz biljnih ili biljnih preparata.36–39 Ipak, za veliki broj tradicionalnih biljaka se tvrdi da poseduju različita terapeutska svojstva da bi ostala koje treba okarakterisati, uglavnom zbog poteškoća u kontroli njihovih sastava kako bi se nedvosmisleno definisala njihova efikasnost i mehanizmi delovanja.40 Potrebni su novi pristupi koji omogućavaju detekciju aktivnih jedinjenja i analizu molekularnih mehanizama. S tim u vezi, in vitro skrining visoke propusnosti vođen cilja može biti od ključnog značaja za pronalaženje mehanički definisanih medicinskih jedinjenja iz prirodnih resursa. U ovoj studiji koristili smo enzimsku reakciju kataliziranu MTH1- kao in vitro test visoke propusnosti za traženje prirodnih spojeva koji mogu inhibirati MTH1. Iznenađujuće, projekcija je to otkrilaEchinacoside, prirodni proizvod koji je najpoznatiji po svom snažnom antioksidativnom djelovanju, sposoban je inhibirati MTH1.

Echinacosideu cistanche cananti-apoptoza

materijali i metode

Materijali

Prirodna biljna jedinjenja kupljena su od Yuanye Biological Technology Co., Šangaj, Narodna Republika Kina. Naziv, kataloški broj, registarski broj Chemical Abstracts Service (CAS) i čistoća svakog jedinjenja navedeni su u Tabeli S1. Osnovni rastvori jedinjenja pripremljeni su u 100% dimetil sulfoksidu (DMSO) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, SAD), a radni rastvori su pripremljeni u puferu za ispitivanje ili kompletnom medijumu za ćelijsku kulturu. Isti rastvor bez testnog jedinjenja, ali koji sadrži istu količinu DMSO je korišćen kao kontrola nosača. (S)-krizotinib je kupljen od Selleck Chemicals, Houston, TX, SAD.

in vitro skrining

Enzimski test in vitro koji se koristi za skrining prirodnih biljnih jedinjenja slijedio je procedure koje su opisali Gad et al.32 Ukratko, serijska razrjeđenja pojedinačnih jedinjenja pripremljena su u puferu za analizu koji se sastoji od 100 mM Tris- acetat (pH 8.{11}}), 40 mM NaCl, 10 mM Mg acetata, 0,005 posto Tween 20 i 1 mM DTT. Zatim su dodani 0,5 nM rekombinantnog humanog MTH1 (Abcam, Cambridge, UK), 100 μM dGTP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) i 0,2 U/mL neorganske pirofosfataze (Thermo Fisher Scientific), a ploče su postavljene na šejkerom 1 sat na sobnoj temperaturi. Konačna zapremina reakcije bila je 100 μL u pločici sa 96-jažicom. Na kraju reakcije dodana je malahit zelena (J&K Scientific, Peking, Narodna Republika Kina)41, a ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi još 15 minuta. Apsorpcija na 630 nm izmjerena je čitačem mikroploča BioRad 680 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, Kalifornija, SAD). Vrijednosti inhibitorne koncentracije (IC50) određene su analizom nelinearne regresije korištenjem softvera GraphPad Prism.

ćelijska kultura

Ljudski MG-63 osteosarkom, SK-HEP-1hepatokarcinom, MCF7 rak dojke, SW480 kolorektalni karcinom, HEK293 embrionalni bubreg i mišje NIH/3T3 ćelijske linije fibroblasta bile su iz American Type Culture Collection, i ljudske normalne Linija ćelija jetre L-O2 kupljena je od KenGen Biotech, Nanjing, Narodna Republika Kina. Ove ćelije su održavane na 37 stepeni u vlažnoj atmosferi sa 5 procenata CO2, prateći uputstva koja su dali provajderi. Za upotrebu ovih ćelijskih linija nije bila potrebna etička izjava institucionalnog odbora za pregled.

Mjerenje intracelularnog {{0}}okso Intracelularnog 8-oxoG nivoa je izmjereno bojenjem sa Cy3-konjugiranim avidinom.42 Ukupno 1×104 ćelije su bile zasijano na okruglom pokrovnom stakalcu u 12-pločama sa bunarima. Sledećeg dana, ćelije su tretirane sa 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM ili 80 μM ehinakozidom tokom 5 sati, 12 sati ili 24 sata, a zatim su fiksirane ledom -hladni metanol 20 minuta, nakon čega slijedi inkubacija u Tris-puferiranoj fiziološkoj otopini (TBS) sa 0,1 posto Triton X-100 (Sigma-Aldrich) u trajanju od 15 minuta. Uzorci su blokirani u TBS sa 0,1% Triton X-100 i 15% fetalnog goveđeg seruma u trajanju od 1 sata na sobnoj temperaturi, a zatim obojeni Cy{28}}konjugiranim avidinom (0,5 ug/mL) (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, SAD) u rastvoru za blokiranje 1 sat na 37 stepeni. Nakon pranja u fiziološkom rastvoru sa fosfatnim puferom (PBS) 3 puta po 5 minuta, pokrivna stakala su zapečaćena na staklenim stakalcima štitnik protiv insekata Montažni medij sa 4′,6-diamidino{38}}fenilindolom (Vector Laboratories, Burlingame, CA , SAD). Slike su snimljene i analizirane Zeiss LCM 510 konfokalnim mikroskopom.

Mjerenje intracelularnog Ros Intracelularni nivoi ROS mjeren je protočnom citometrijom korištenjem kompleta za ispitivanje ROS na ćeliji (Beyotime Biotechnology, Haimen, Narodna Republika Kina). Ćelije uzgojene u pločama sa šest jažica tretirane su sa 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM ili 80 μM ehinakozidom tokom 5 sati, 12 sati ili 24 sata, isprane su dva puta PBS-om i inkubirane sa 10 μM dihlorofluorescein diacetata 30 minuta na 37 stepeni. Ćelije su zatim tripsinizirane i analizirane FACSCaliber protočnim citometrom (BD Biosciences, San Jose, Kalifornija, SAD). Intracelularni nivoi ROS-a izraženi su kao prosječni intenzitet fluorescencije dihlorodihidrofluoresceina ćelija. Prikazani brojevi su proseci tri nezavisna eksperimenta.

Imunofluorescentno bojenje

Ćelije uzgojene na pokrovnim stakalcima tretirane su sa {{0}} μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM ili 80 μM ehinakozidom tokom 5 sati, 12 sati ili 24 sata, a zatim jednom isprane PBS-om, fiksirane sa 4 posto paraformaldehida u PBS-u 20 minuta i blokirano u TBS-u sa 0,1 posto Triton X-100 i 15 posto fetalnog goveđeg seruma 1 sat na sobnoj temperaturi. Fiksirane ćelije su obojene 2 sata na sobnoj temperaturi primarnim antitijelom protiv 8-oxoG (mišji monoklonalni anti-8-oxoG, Abcam), 53BP1 (zečji anti-53BP1; Bethyl Laboratories, Montgomery , TX, SAD), ili aktivna kaspaza-3 (zečja anti-kaspoza-3, Bioss, Peking, Narodna Republika Kina), nakon čega slijedi bojenje sa Alexa 488-konjugiranim magarećim antimišem ( Abcam) ili Cy3-konjugirano kozje anti-zečje (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, SAD) sekundarno antitijelo 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon pranja u PBS-u 3 puta po 5 minuta, pokrovna stakla su zapečaćena na staklenim predmetima u VECTASHIELD medijumu za montažu sa DAPI (Vector Laboratories). Slike su snimljene konfokalnim mikroskopom Zeiss LCM 510.

test formiranja kolonija

Dan prije tretmana, ćelije su posađene u ploču sa šest jažica u koncentraciji od 1×104 ćelije po jažici. Zatim su tretirani sa 0 μM, 60 μM ili 80 μM ehinakozidom tokom 7 dana. Nakon ispiranja sa PBS, ćelije su fiksirane ledeno hladnim metanolom i obojene kristalno ljubičastim rastvorom (Sigma-Aldrich) (0,5 procenata u 25 procenata metanola). Slike su fotografisane nakon sušenja ploča preko noći. Kristalno ljubičasti kristali su otopljeni dodavanjem 70 posto etanola, a apsorbancija na 595 nm je izmjerena BioRad 680 čitačem mikroploča. Podaci su analizirani pomoću softvera GraphPad Prism.

MTT test

Jedan dan pre tretmana, ćelije su zasejane u 96-ploče u koncentraciji od 1×104 ćelije po jažici, nakon čega je usledio tretman sa serijskim razblaženjima ehinakozida tokom 24 sata ili 48 sati, ili sa 60 μM ehinakozida tokom 5 sati, 12 sati , ili 24 sata. Medijum je uklonjen, a ćelije su isprane PBS, a zatim 20 μL 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,{{15} }Otvor difenil tetrazolijum bromida (MTT) (5 mg/mL u PBS, pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific) je dodan u svaku jažicu. Ploče su inkubirane na 37 stepeni još 4 sata. Na kraju je MTT rastvor uklonjen i u svaku jažicu je dodato 150 μL DMSO. Ploče su inkubirane na šejkeru za ploče 10 minuta, a apsorbancija na 570 nm je izmjerena BioRad 680 čitačem mikroploča. Svaki eksperiment je izveden dva puta u tri primjerka. Podaci su analizirani pomoću softvera GraphPad Prism. Vrijednosti IC50 određene su nelinearnom regresijskom analizom.

analiza ćelijskog ciklusa

Ćelije u pločama sa šest jažica tretirane su sa 0 μM, 6{{10}} μM, ili 80 μM ehinakozidom tokom 24 sata, sakupljene sa tripsinom (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornija, SAD) , ispran dva puta sa PBS, a zatim fiksiran ledeno hladnim etanolom (70 posto) 2 sata na -20 stepeni. Fiksirane ćelije su dva puta isprane u hladnom PBS-u i resuspendovane u 300 μL svježe pripremljenog PBS-a sa 0,1 posto Triton X-100, 0,2 mg/mL RNase A bez Dnaze (Sigma-Aldrich), 10 ug/mL propidijum jodida ( PI) (Hoffman-La Roche Ltd., Basel, Švicarska). Nakon inkubacije na 37 stepeni u mraku tokom 20 minuta, ćelije su filtrirane kroz Falcon najlonsku mrežu (BD Biosciences), stavljene na FAC-SCalibur protočni citometar i analizirane pomoću softvera ModFit (BD Biosciences).

Analiza fragmentacije DNK

Ćelije uzgojene u pločama sa šest jažica tretirane su sa 0 μM, 60 μM ili 80 μM ehinakozidom tokom 24 sata i fiksirane u ledeno hladnom 4 posto paraformaldehida (Sigma-Aldrich) 20 minuta. Nakon ispiranja sa PBS, ćelije su zapečaćene u VECTASHIELD medijumu za montažu sa DAPI (Vector Laboratories). Nuklearna morfologija je fotografisana fluorescentnim mikroskopom Olympus. Da bi se otkrila fragmentacija DNK na agaroznim gelovima, DNK je ekstrahovan korišćenjem QIAamp DNA mikro kompleta (Qiagen NV, Venlo, Holandija), a elektroforeza je izvedena na 2 procentnim agaroznim gelovima koji sadrže 0,1 ug/mL etidijum bromida.

Analiza apoptoze protočnom citometrijom Apoptotične ćelije su ispitane pomoću Annexin V-FITC kompleta za otkrivanje apoptoze (Bestbio, Šangaj, Narodna Republika Kina), slijedeći uputstva proizvođača. Ćelije uzgojene u 96-pločama su tretirane sa 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM ili 160 μM ehinakozidom tokom 2 sata, 5 sati, 12 sati ili 24 sata, ispran dva puta sa PBS, a zatim resuspendovan u puferu za vezivanje. Zatim je uzastopno dodano 5 μL aneksina V-FITC i 5 μL PI (Roche), a ćelije su inkubirane 15 minuta u mraku na sobnoj temperaturi. Ćelije su stavljene na FACSCalibur protočni citometar (BD Biosciences), a podaci su analizirani pomoću softvera Cell Quest (BD Biosciences).

Western blot analiza

Ćelije uzgojene u pločama sa šest jažica tretirane su sa 0 μM, 6{{10}} μM ili 80 μM ehinakozidom tokom 5 sati, 12 sati ili 24 sata, ispran dva puta sa PBS-om i sastrugan sa ploče koristeći 100 μL radioimunoprecipitacionog pufera (150 mM NaCl, 1,0 posto IGEPAL CA-630, 0,5 posto natrijum deoksiholata, 0,1 posto natrijum dodecil sulfata i 50 mM Tris, pH 8,0) (Sigma-Aldrich) koji sadrži 1 mM fenilmetan sulfonil fluorida. Uzorci su centrifugirani na 12,000× g 20 minuta na 4 stepena. Koncentracije proteina u supernatantima određene su Bradfordovim reagensom (Dingguo, Changchun, Narodna Republika Kina). Uzorci su denaturirani na 95 stepeni tokom 10 minuta i razdvojeni na 12-postotnom natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnom gelu za elektroforezu. Nakon elektroforeze, proteini su prebačeni na membrane od poliviniliden fluorida (Millipore), nakon čega je uslijedilo blokiranje u Tris puferiranoj fiziološkoj otopini s Tween 20 (10 mM Tris, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,1 posto Tween 20)/v) koji sadrži 5 posto (wv) nemasnog mleka 1 sat na sobnoj temperaturi. Blots su ispitani primarnim antitijelima protiv p21 (Abcam), poli (ADP-riboza) polimeraze (Bioss) ili aktivirane kaspaze-3 (Bioss), nakon čega su slijedila sekundarna antitijela konjugirana s peroksidazom hrena (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Signali su razvijeni korišćenjem poboljšanog hemiluminiscentnog Western blotting kompleta za detekciju (Transgen Biotech, Changchun, Narodna Republika Kina). Eksperimenti su ponovljeni tri puta.

Echinacosideu cistanche cananti-apoptozaiantioksidacija

Merenje mitohondrija

membranski potencijal

Potencijal mitohondrijalne membrane je mjeren upotrebom JC{{0}} boje (Biotechnology), slijedeći uputstva proizvođača. Ćelije uzgojene u pločama sa šest jažica tretirane su sa 0 μM, 60 μM ili 80 μM ehinakozidom tokom 5 sati, 12 sati ili 24 sata, isprane su dva puta u PBS-u i zatim inkubirane sa JC-1 tokom 20 minuta. Slike su snimljene pomoću Olympus fluorescentnog mikroskopa.

Statistička analiza

Statistička analiza je izvršena korišćenjem GraphPad Prism softvera. Značajnost je izračunata korištenjem jednosmjerne analize varijanse, a P0.05 se smatra statistički značajnim. Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija.

Echinacosideu cistanche cananti-apoptozai poboljšati imunitet