2. dio Hemijska i genetska diskriminacija Cistanches Herba na osnovu UPLC-QTOF/MS i DNK barkodiranja
Mar 03, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
OPLS-DA i identifikacija markera Da bi se identifikovali potencijalni hemijski markeri za diskriminaciju dve vrste, generisan je S-graf OPLS-DA (slika 3). U S-grafici, svaka tačka predstavlja jedan tR–m/z jonski par. X i Y ose predstavljaju doprinos i pouzdanost jona, respektivno; što je rastojanje jonskog tR–m/z para udaljeno od nule, veći je doprinos/pouzdanje ove ikone razlici između dve grupe. Dakle, tR–m/z ion koji pokazuje na dva kraja 'S' predstavlja karakteristične markere s najvećim povjerenjem u svakoj grupi. Rezultati OPLS-DA su pokazali da se UPLC-QTOF/MS može koristiti za razlikovanjeCistanche deserticolaodCistanche tubulosa(Sl. 3). Utvrđeno je ukupno šest vjerodostojnih i značajnih markera kako bi se olakšala diskriminacija ovih grupa (Tabela 3). Identiteti tri potencijalna markera su provizorno dodijeljeni. Komponente koje su u korelaciji sa ova tri jona provizorno su identificirane kao izomeri kampneozida II, cistanozida C i cistanozida A. Jedinjenja markera a, b i c mogu se koristiti za razlikovanje dvije biljne vrste, budući da su intenziteti jona a i b uCistanche deserticolabio veći nego uCistanche tubulosa(sl. 4A, 4B), a marker c se može detektovati uCistanche tubulosa, ali ne uCistanche deserticola(slika 4C).
DNK barkodiranje: informacije o sekvenci i efikasnost identifikacije
Informacije o sekvenci su prikazane u Tabeli 4. Prosječna genetska udaljenost psbA-trnH (0.1732) bila je veća od druge dvije regije (0.0740 , 0,1197) značajno. Prosječan GC sadržaj psbA-trnH (20,64 posto) bio je manji od druge dvije regije (55.00 posto, 55.00 posto). Iako stopa uspjeha ITS-a i ITS2 nije postignuta u ovoj studiji, psbA-trnH regija se pokazala dobro u PCR amplifikaciji i sekvenciranju (100 posto, 87,23 posto). Efikasnost identifikacije postignuta je BLAST1 analizom i metodom najbliže udaljenosti, a uglavnom je odražavala stopu uspješnosti bar kodova. Region psbA-trnH bio je očigledno veći od druga dva barkoda u efikasnosti identifikacije zasnovane na dve metode. Nedostatak sekvenci je najvjerovatnije razlog što je ITS region pokazao 100 posto efikasnost identifikacije na osnovu BLAST1 metode, a 0 na osnovu metode najbliže udaljenosti.
Analiza genetske divergencije korištenjem šest parametara
Korišteno je šest parametara za analizu intraspecifične varijacije i interspecifične divergencije korištenjem tri barkoda (Tablica 5). Značajna razlika između inter- i intraspecifičnih varijacija ukazuje na korisnost DNK bar kodova. Ovdje je minimalna međuvrstna udaljenost od tri barkoda bila veća od maksimalne intraspecifične udaljenosti. Štaviše, psbA-trnH regija je imala veću maksimalnu intraspecifičnu udaljenost i prosječnu interspecifičnu udaljenost od druga dva barkoda što ukazuje da je psbA-trnH regija dobro postupila u diskriminaciji dva porijekla Cistanches Herba.
Analiza jaza u barkodiranju za identifikaciju
Cistanche deserticolaiCistanche tubulosaRazmak u barkodiranju predstavlja izuzetnu varijaciju među i unutar vrsta i pokazuje odvojene, nepreklapajuće distribucije između uzoraka unutar i među vrstama. U ovoj studiji (slika 5), raspon udaljenosti je postavljen na 0–0.45, jer je najveća K2P udaljenost psbA-trnH izmeđuCistanche deserticolaiCistanche tubulosabio blizu 0.45. Tri barkoda su pokazala jasne praznine u distribucijama intra- i međuspecifičnih varijacija. Nadalje, jaz psbA-trnH bio je znatno veći od druga dva barkoda. Prema tome, psbA-trnH regija bi mogla biti idealan bar kod za razlikovanje dva porijeklaCistanchesHerba.
Stablo spajanja susjeda (NJ).
NJ stablo ilustruje odnos među vrstama i olakšava određivanje njihovog grupisanja. U ovoj studiji NJ stablo od tri barkoda je izgrađeno na osnovu K2P modela (slika 6). Rezultati su pokazali da su dva porijekla Cistanches Herba grupirana u dvije klade odvojeno. Dakle, stablo NJ jasno razlikujeCistanche deserticolaiCistanche tubulosa.
Diskusija i zaključci
Cistanches Herba je važan medicinski materijal koji se obično koristi za ishranu azijske zajednice [38]. Međutim, dva porijekla odCistanchesHerba, Cistanche deserticolaiCistanche tubulosa, imaju različite hemijske sastave i farmakološke aktivnosti. Istovremeno, dva porijekla se razlikuju u kliničkoj primjeni i tržištu robe. Klasifikacija Cistanchea je zbunjena i masovne zamjene i preljubnice preplavljuju tržište zbog nedostatka resursa i posebnog okruženja za uzgoj za Cistanches Herba. Prihvaćeno je da rod Cistanche uključuje četiri vrste i jednu varijantu:Cistanche deserticola, Cistanche tubulosa, Cistanche sinensis, Cistanche salsa, iCistanchesalsavar. albiflora [39]. Istraživači u Japanu smatraju porijekloCistanchesHerba asCistanche salsa[40–43], dok je identificiran kaoCistanche deserticolaod Tu [44–46]. Zbog toga se zbunjuje u klasifikaciji Cistanchea i teško je razlikovati dva porijekla Cistanches Herba. Tradicionalne metode za kontrolu kvaliteta Cistanches Herba su morfološka identifikacija [47,48], mikroskopska identifikacija [49] i TLC (tankoslojna hromatografija) [50,51], FTIR (Furierova infracrvena spektroskopija) [14], HPLC (visoka Performansna tečna hromatografija) [52,53]. Morfološkom i mikroskopskom metodom se lako mogu razlikovati vrste iz različitih rodova ili porodica koje poseduju velike razlike u morfološkim i mikroskopskim karakteristikama, dok je teško razlikovati srodne vrste. TLC i FTIR mogu jasno razlikovati vrste koje poseduju različite vrste hemijskog sastava, dok je teško odrediti hemijsku komponentu i sadržaj. HPLC se uglavnom koristi za razlikovanje vrsta sa različitim sadržajem hemijskih elemenata, međutim, vreme analize je duže i osetljivost je relativno niža u odnosu na UPLC. Shodno tome, UPLC-QTOF/MS tehnologija je bila brža i preciznija u određivanju hemijskog sastava od drugih hemijskih metoda. Metode molekularne identifikacije dobro se pokazuju u diskriminaciji na osnovu genetske varijacije, kao što je SDS-PAGE (Natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidna gel elektroforeza) [54], AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) [55,56]. Međutim, ove molekularne metode nisu jednostavne za rukovanje i nisu univerzalne. Shodno tome, DNK barkodiranje bi moglo razlikovati vrste univerzalnije, brže i preciznije nego druge molekularne metode. Za vrste iz istog roda i bliskog genetskog odnosa, te metode same po sebi možda neće biti dobre u identifikaciji.
Ovdje smo kombinovali UPLC-QTOF/MS i DNK barkodiranje u identifikacijiCistanche deserticolaiCistanche tubulosai procijenio hemijske i molekularne markere koji bi omogućili njihovu diskriminaciju. Detektovana su 23 kvalifikovana pikova mase, a 16 je identifikovano korišćenjem UPLC–QTOF/MS, a za tri potencijalna jedinjenja markera je prvo utvrđeno da olakšavaju diskriminaciju dva porekla pomoću PCA i OPLS-DA analize. Nadalje, četiri indikatora su procijenjena tehnologijom DNK barkodiranja u smislu njihove sposobnosti da razlikuju dva porijekla: efikasnost identifikacije, genetska efikasnost, jaz u barkodiranju i analiza stabla NJ. psbA-trnH regija je podržana kao odgovarajući DNK bar kod za razlikovanjeCistanche deserticolaiCistanche tubulosa. U zaključku, prvo smo uspostavili novu kombinovanu metodu molekularne i hemijske analize za razlikovanje i kontrolu kvaliteta u dva porekla Cistanches Herba. DNK barkodiranje može razlikovati dva porijekla u genetskim varijacijama i univerzalno i precizno potvrditi autentičnost vrsta; UPLC-QTOF/MS tehnologija može analizirati hemijski sastav kako bi se brzo i precizno procenio kvalitet medicinskih materijala. Kombinovana metoda DNK barkodiranja i UPLC-QTOF/MS tehnologija garantuju tačniju i naučniju identifikaciju u više izvora medicinskih materijala i može poslužiti kao metoda za identifikaciju drugih zbunjujućih vrsta ili rodova u klasifikaciji.
Prilozi autora
Osmislio i dizajnirao eksperimente: LFH SHZ LBW. Izvedeni eksperimenti: SHZ LBW. Analizirani podaci: SHZ LBW. Reagensi/materijali/alati za analizu: LFH. Napisao rad: SHZ XJ LBW. Provjerite rukopis: ZHW.
Cistanche deserticola ima mnogo efekata, kliknite ovde da saznate više
Reference
1. Tu PF, Lou ZC, Li SC, Wang CS, Jiang WY, et al. (1996) Poređenje o hrani bubrega i jang jačanju efikasnosti tri različite vrsteherbacistanches. Časopis kineskih medicinskih materijala 19: 420–421.
2. Zhang Y, Wu H, Wang SN, Zheng HC (1994) Poređenje funkcija hranjenja bubrega i jačanja janga tri različite vrsteherbacistanches. China Journal of Chinese Materia Medica 19: 169–171.
3. Lei L, Song ZH, Tu PF (2003) Napredak u istraživanju hemijskih sastojaka u biljkamaCistancheHuffing. et Link. Kineske tradicionalne i biljne droge 34: 473–476.
4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S, et al. (2006) Feniletanoidni aminoglikozidi i acilirani oligošećeri sa vazorelaksantnom aktivnošću izCistanchetubulosa. Bioorg Med Chem 14: 7468–7475.
5. Shimoda H, Tanaka J, Takahara Y, Takemoto K, Shan SJ, et al. (2009) The hypocholesterolemic effect ofCistanchetubulosaekstrakt, kineska tradicionalna sirova medicina, kod miševa. Am J Chin Med 37: 1125–1138.
6. Yamada P, Iijima R, Han J, Shigemori H, Yokota S, et al. (2010) Inhibicijski efekat akteozida izolovanog izCistanchetubulosana oslobađanje hemijskog medijatora i proizvodnju inflamatornih citokina od strane RBL-2H3 i KU812 ćelija. Planta Med, 1512–1518.
7. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H, et al. (2010) Acilirani feniletanoidni aminoglikozidi s hepatoprotektivnim djelovanjem iz pustinjske biljkeCistanchetubulosa. Bioorg Med Chem 18: 1882–1890.
8. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, et al. (2010) Iridoidni i aciklični monoterpenski glikozidi, kankanozidi L, M, N, O i P izCistanchetubulosa. Chem Pharm Bull (Tokio) 58: 1403–1407.
9. He YP, Yin ZZ, Tu PF, Lou ZC (1997) Identifikacija i pregled komercijalne sirove droge herba cistanche. Časopis kineskih medicinskih materijala 20: 117–122.
10. Zhu SY (2001) Farmakognostička identifikacijaCistanchetubulosazbunjena vrstaCistanchedeserticola. Časopis kineskih medicinskih materijala 24: 24–25.
11. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG, et al. (2013) Mikroskopska identifikacija triherbacistanchesXin Jiang. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883.
12. Zhang M, Fu XL, Wang SY (2004) Mikroskopska identifikacija reklamaHerbaCistanchestehnikom digitalnog snimanja. Časopis kineskih medicinskih materijala 27: 400–402.
13. Li JS, Yao ZQ, Yu MX (2000) Studija o identifikacijiherbacistanchesi preljubnici. Shizhen Medicine and Materia Research 11: 317–318.
14. Xu R, Sun SQ, Liu YG, Chen J, Liu TN, et al. (2010) FTIR i 2D-IR spektroskopske studije na različitim izvorimaherbacistanches. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 30: 897–900.
15. Chen J, Sun SQ, Xu R, Liu YG, Yu J, et al. (2009) IdentifikacijaCistanchedeserticolaiz Boschniakla rossica i Cynomorium solarijuma korišćenjem FTIR i dvodimenzionalne korelacione IR spektroskopije. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 29: 1502–1507.
16. Yang HC, Xia PX, Huang JX, Yuan HZ (2008) Studija o HPLC otisku prstaCistanchedeserticola. Pharm Care & Res 8: 255–257.
17. Xie JN, Zhao MB, Wu FW, Tu PF (2005) Kromatografski otisak prstaCistanchedeserticolapomoću HPLC. Kineske tradicionalne i biljne droge 36: 268–271.
18. Han JP, Song JY, Liu C, Chen J, Qian J, et al. (2010) IdentifikacijaCistanchevrste (Orobanchaceae) zasnovane na sekvencama intergenskog regiona plastida psbA-trnH. Acta Pharmaceutica Sinica 45: 126–130.
19. Shi HM, Wang J, Wang MY, Tu PF, Li XB (2009) IdentifikacijaCistancheVrste putem hemijskog i međujednostavnog niza ponovljenih otisaka prstiju. Biol. Pharm. Bul., 32: 142–146.
20. Han LF, Yiadom MB, Liu EW, Zhang Y, Li W, et al. (2012) Strukturna karakterizacija i identifikacija feniletanoidnih glikozida izCistanchesdeserticolaYC MaUHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Fitokemijska analiza 23: 668–676.
21. Jiang X, Huang LF, Wu LB, Wang ZH, Chen SL (2012) UPLC-QTOF/MS analiza alkaloida u tradicionalno obrađenoj Coptis chinensis Franch. Evid Based Complement Alternat Med 2012: 942384.
22. Wu LB, Jiang X, Huang LF, Chen SL (2013.) Istraživanje tehnologije obrade lista lokvata (Eriobotrya japonica) tečnom hromatografijom ultra-performanse – kvadrupolna vremenska masena spektrometrija u kombinaciji sa hemometrijom. PLOS ONE 8: e64178.
23. Hebert PD, Ratnasingham S, Waard JR (2003) Barkodiranje životinjskog svijeta: divergencije podjedinice 1 citokrom c oksidaze među blisko srodnim vrstama. Proc. R. Soc. London. B., 270 Suppl 1: S96–99.
24. Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, Waard JR (2003) Biološke identifikacije kroz DNK barkodove. Proc Biol Sci., 270: 313:321.
25. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005) Upotreba DNK bar kodova za identifikaciju cvjetnica. Proc Natl Acad Sci., 102: 8369–8374.
26. Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, et al. (2010) Validacija ITS2 regije kao novog DNK barkoda za identifikaciju ljekovitih biljnih vrsta. PLoS One 5: e8613.
27. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, et al. (2011) MEGA5: Analiza molekularne evolucione genetike koristeći metode maksimalne vjerovatnoće, evolucijske udaljenosti i maksimalne štedljivosti. Mol Biol Evol 28: 2731–2739.
28. Meyer CP, Paulay G (2005) DNK barkodiranje: stope greške zasnovane na sveobuhvatnom uzorkovanju. PLoS Biol 3: e422.
29. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Studije o sastavnim dijelovimaCistancheHerba.IV. Izolacija i strukture dva nova fenilpropanoidna glikozida, cistanozidi C i D. Chem Pharm Bull 32: 3880–3885.
30. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studije o sastojcimaCistancheHerba. VI. Izolacija i strukture novog iridoidnog glikozida, 6-Deoxyeatalpol. Chem Pharm Bull 33: 3645–3650.
31. Jiang Y, Li SP, Wang YT, Chen XJ, Tu PF (2009) DiferencijacijaHerbaCistanchesotiskom prsta sa tečnom hromatografijom visokih performansi – detekcijom niza dioda – masenom spektrometrijom. Časopis za kromatografiju A 1216: 2156–2162.
32. Han LF, Boakye YM, Liu E, Zhang Y, Li W, et al. (2012) Strukturna karakterizacija i identifikacija feniletanoidnih glikozida izCistanches deserticola YC Mapomoću UHPLC/ESI–QTOF–MS/MS. Phytochem Anal 23: 668–676.
33. Li L, Tsao R, Yang R, Liu CM, Young JC, et al. (2008) Izolacija i prečišćavanje feniletanoidnih glikozida izCistanchedeserticolabrzom protivstrujnom hromatografijom. Food Chemistry 108: 702–710.
34. Lu DY, Zhang JY, Yang ZY, Liu HM, Li S, et al. (2013) Kvantitativna analizaCistanchesHerbakoristeći tečnu hromatografiju visokih performansi u kombinaciji sa detekcijom niza dioda i masenom spektrometrijom visoke rezolucije u kombinaciji sa kemometrijskim metodama. J Sep Sci 26: 1945–1952.
35. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studije o konstituentimaCistancheHerba. V. Izolacija i strukture dva nova fenilpropanoidna glikozida, Cistanoside E i F. Chem Pharm Bull 33: 1452-1457.
36. Jiang Y, Tu PF (2009) Analiza hemijskih sastojaka uCistanchevrste. J Chromatogr A 1216:1970–1979.
37. Massart DL, Vandeginste BGM, Deming SN, Michotte Y, Kaufman L (1988) Rukovanje podacima u nauci i tehnologiji. Hemometrija: udžbenik.
38. Huang LF, Zheng SH, Wu LB, Jiang X, Chen SL (2014) EkotipoviCistanche deserticolazasnovano na hemijskoj komponenti i molekularnim osobinama. SCIENTIA SINICA Vitae 44: 318–328.
39. Tu PF, Jiang Y, Guo YH (2011) istraživanje i industrijski razvoj herbacistanches. Journal of Chinese Pharmaceutical 46: 882–887.
40. Kobayashi H, Oguchi H, Takizawa, Miyase T, Ueno A, et al. (1987) Novi feniletanoidni glikozidi izCistanchetubulosa(SCHRENK) Kuka. f. I. Chem Pharm Bull 35: 3309–3314.
