Dio 2: Anti-inflamatorni, antioksidativni, hidratantni i antimelanogenezni efekti kvercetina 3-O- -D-glukuronida u ljudskim keratinocitima i ćelijama melanoma putem aktivacije NF-κB i AP-1 puteva

Za više detalja kontaktirajtetina.xiang@wecistanche.com

Kliknite na link da naučite dio 1:https://www.xjcistanche.com/news/part-1-anti-inflamatorni-antioksidans-moistu-55118257.html

3. Diskusija

U prethodno objavljenim studijama, Q-3-G je korišten za inhibiciju edema uha, peritonealne permeabilnosti i plućnog edema [50], djelujući kao moćnoantioksidansu krvnoj plazmi s lipoproteinom niske gustine [42], smanjujući oksidativnu modifikaciju izazvanu peroksinitritom [51], vršećiprotuupalnoefekat inhibiranjem JNK i ERK signalnih puteva pod LPS izazovom [52] i posedovanjem antikancerogenih svojstava protiv ćelija raka dojke [56]. Međutim, za razliku od njegovog široko proučavanog matičnog jedinjenja,kvercetin, farmakološke prednosti i mehanizmi Q-3-G ostaje da se istraži. Koliko nam je poznato, uloga Q-3-G u zaštitnim efektima kože nije u potpunosti razjašnjena. U ovoj studiji, koristeći različite in vitro procjene, fokusirali smo se na karakterizaciju zaštitnih efekata Q-3-G na kožu protiv UVBor H2O2, izazvanog oksidativnog stresa i upale, hidrataciju kože u HaCaT (ćelijska linija ljudskih keratinocita) iantimelanogenezaaktivnost u B16F10 (ćelijska linija mišjeg melanoma).

Vijabilnost ćelija HaCaT, B16F10 i HEK293T određena je nakon tretmana sa Q-3-G u rasponu necitotoksičnih koncentracija. Rezultati su pokazali da nije bilo značajne inhibicije vijabilnosti ćelija u HaCaT, B16F10 i HEK293T ćelijama preko koncentracija Q-3-Gup do 20 μM (slike 2a, 3a i 4f). Vijabilnost ćelija u HaCaT, B16F10 i HEK293T ćelijama pri koncentracijama O-3-G do 20 μM je bila niža od koncentracije kvercetina kada se koristi za istraživanje citotoksičnih efekata u SCC{{18} } i HSC-6 ćelije (50 μM)【57】ili održivost sperme (50-100μM)【58】. Međutim, pokazalo se da je Q-3-G mnogo manje toksičan u poređenju sa svojim aglikonom [59]. Nedostatak slobodne OH grupe na tri pozicije može doprinijeti manje toksičnom efektu Q-3-G [29].

UVB zraci sa talasnom dužinom od 280-315 nm prodiru u gornji sloj kože i efikasniji su od UVA i UVC[60]. UVB zraci uzrok su većine karcinoma kože i smrti ćelija. Nadalje, pokazalo se da je oštećenje ćelija u HaCaT ćelijama izazvano UVB zračenjem [61]. Shodno tome, istražili smo vitalnost ćelija HaCaT ćelija nakon UVB zračenja u poređenju sa Q-3-G tretmanom. Kao što je prikazano u prethodnim izvještajima, jedan od glavnih faktora koji dovode do oštećenja ćelija, tkiva i organa je izlaganje UVB zrakama [62,63]. Q-3-G je obnovio smanjenu vitalnost ćelija izazvanu UVB zračenjem (Slika 2b-d). Pokazalo se da su rezultati slični prethodnoj studiji o efektu i mehanizmu na citotoksičnost izazvanu UVB-zracima u HaCaT kvercetina [64].

Kliknite na nju da dobijete više informacija o proizvodima

Nekoliko studija je opisalo da UVB može potaknuti ozbiljne upalne reakcije, što dovodi do problema na koži [1,2,4,27]. UVB aktivira važne proinflamatorne enzime kao što je COX-2 i citokine kao što je TNF-. COX-2 je enzim povezan s upalom koji pokreću proinflamatorni citokini i medijatori [65], koji stimulira inflamatorni odgovor. Budući da COX-2 proizvodi inflamatorni medijator PGE-2, on inducira upalni odgovor [66,67], a TNF- je glavni proinflamatorni citokin [68] u upalnim odgovorima. Ovi upalni odgovori uzrokuju oštećenje kože, što rezultira starenjem kože [69]. Nivoi ekspresije mRNA inflamatornog enzima COX-2 i proinflamatornih citokina TNF- su inhibirani Q-3-G (Slika 2e,). Prema ranije objavljenim rezultatima, kvercetin je također smanjio ekspresiju gena i proizvodnju TNF-a [70]. Što se tiče antioksidativnih svojstava, DPPH i ABTS testovi uklanjanja radikala su brze, pouzdane i ponovljive metode za procjenu in vitroantioksidativno djelovanječistih spojeva i biljnih ekstrakata [54] i naširoko se koriste u uobičajenim metodama za istraživanje aktivnosti čišćenja prirodnih spojeva ili ekstrakata [1,46,71,72]. Utvrđeno je da Q-3-G smanjuje reaktivnost radikala iu testovima iu protočnoj citometriji na načine zavisne od koncentracije. Ovi rezultati su u skladu sa prethodno objavljenom studijom, u kojoj je Q-3-G značajno inhibirao formiranje ROS u PC-12 ćelijama feohromocitoma [34]. Osim hemijskog djelovanja s antioksidativnim djelovanjem, pokazali smo da Q-3-G povećava nivo Nrf2, jednog od važnih regulatora oksidativnog stresa u stanicama. Prijavljeno je da nekoliko jedinjenja ili prirodnih ekstrakata posjeduju antioksidativna svojstva putem Nrf2-zavisne ARE signalizacije [46,73,74]. Uzeti zajedno, ovi nalazi ukazuju da Q-3-G posjeduje antioksidativnu aktivnost (Slika 2g-j). Melanom iz sinteze melanina javlja se u intracelularnim organelama [75-77]. Prekomjerna proizvodnja melanina može utjecati na izgled kože i kožne bolesti povezane s hiperpigmentacijom. Otkrili smo da tretman sa O-3-G u c-MSH-indukovanim B16F10 ćelijama inhibira lučenje melanina. Kao iu prethodnim radovima, intracelularnu melanogenezu kontrolišu metaboliti kvercetina i neki kvercetin-3-O- -D-glukopiranozidi [24,78,79].

Održavanje zdrave kože zahtijeva odgovarajuću hidrataciju kože, a NMF i HA imaju važnu ulogu u ovom procesu [12]. FLG je sastavni dio kožne barijere, tako da povećani nivo ekspresije FLG može biti povezan sa hidratacijom [80]. U našoj studiji je utvrđeno da Q-3-G utiče na aktivnost zadržavanja vlage u koži povećanjem FLG i TGM-1 (Slika 3c,d). Nivoe ekspresije FLG i TGM-1 blokirali su JNK, IKK i IkBainhibitori (SP600125 i Bay{7}}, respektivno). Fokusirali smo se na enzime vezane za MAPK jer su naše studije imale za cilj da odrede molekularne mehanizme pomoću kojih Q-3-Gester ima svoje zaštitne efekte na koži. JNK igra važnu ulogu u apoptozi keratinocita izazvanoj oksidativnim stresom [81]. Fosforilacija c-Jun, TAK1, MKK4 i INK je povećana za Q-3-G. Osim toga, retinol nije značajno povećao fosforilaciju c-Jun, TAK1, MKK4 ili JNK, što sugerira da postoje neke razlike u inhibitornim karakteristikama između Q-3-G i retinola u AP-1 signalizaciji put. Kao iu prethodno objavljenim rezultatima, JNK-c-Jun/AP-1 put je u korelaciji sa anti-apoptotičkim efektomkvercetin[82]. U poređenju sa prethodnom studijom [83], regulacijom NF-kB i AP{3}} signalnih puteva, utvrđeno je da su ovi putevi uključeni u osnovni mehanizam kvercetina. U skladu sa mehanizmom njegovog matičnog jedinjenja, naši rezultati pokazuju da je put NF-kB takođe bio uključen u zaštitni efekat kože Q-3-Gaby aktivacije p50, p65, IKK, IkB, Akt i Src. nakon tretmana sa Q-3-G u HaCaT ćelijama. Pored toga, Q-3-G je regulirao AP-1-posredovao Luc i NF-B-Luc aktivnost (slika 4). Ovi nalazi sugeriraju da je MAPK posredovana AP-1 i NF-kB signalizacija doprinijela Q-3-G-posredovanoj zaštiti kože.

4. Materijali i metode

4.1. Materijali

Q-3-G je dobijen od Sigma Aldrich Co. (St. Louis, MO, SAD). HaCaT, HEK293T i B16F10 ćelije su kupljene od American Type Culture Collection (Rockville, MD, SAD). ABTS diamonijum so, DPPH, askorbinska kiselina (AA), ABTS i retinol kupljeni su od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, SAD). Fetalni goveđi serum (FBS), Dulbeccoov modificirani orlov medij (DMEM) i fiziološki rastvor puferiran fosfatom (PBS) kupljeni su od Gibco-a (Grand Island, NY, SAD).3-(4-5-Dimetiltiazol{{) 7}}il)-25-difeniltetra-natrijum bromid (MTT) je kupljen od Amresca (Brisbane, Australija). TRILzol i PCR premiks su kupljeni od Bio-D Inc. (Seul, Koreja). Kompleti za sintezu cDNK kupljeni su od Thermo Fisher Scientific-a (Waltham, MA, SAD). Prednje i reverzne prajmere za PCR (lančana reakcija polimeraze) sintetizovao je Macrogen, Inc. (Seul, Koreja). Sva antitijela koja se odnose na fosforilirane ili ukupne forme ciljnog proteina kupljena su od Cell Signaling Technology (Beverly, MA, SAD).

4.2. Ćelijske kulture

HaCaT i B16F10 ćelije su uzgajane u DMEM sa 10 posto FBS i 1 posto antibiotika (streptomicin i penicilin). HEK293T ćelije su uzgajane u DMEM sa 5 procenata FBS i 1 procenat antibiotika. Ove ćelijske linije su inkubirane u 5% CO, na 37 stepeni.

4.3. Testovi vitalnosti ćelija

B16F10 ćelije su zasijane pri 2×10 stepeni ćelija po jažici u 96-ploče za jažice tokom 24 h, dodane su im različite koncentracije Q-3-G（0-20 μM） i zatim su inkubirani 48 h. HaCaT ćelije su postavljene u ploče 96-jažica, a ćelije su zasijane pri 6×10 stepeni ćelija/mL. Nakon inkubacije preko noći, ćelije su inkubirane sa različitim koncentracijama Q-3-G （0-20 μM) tokom 24 h. Ćelije HEK293T su zasijane pri 6×10 stepeni ćelija/mL u 96-ploče sa jažicom tokom 24 h, a zatim tretirane sa Q-3-G （0-20 μM）. Inkubirane ćelije su tretirane sa 10 μL/bunarić MTT rastvora, a nakon 3 h tretirane su sa 100 μL MTT rastvora za zaustavljanje. Koristeći konvencionalni MTT test za izmjerenu vitalnost ćelija [84], mjerena je apsorpcija na 570 nm pomoću čitača (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA).

4.4. Analiza mRNA pomoću semi-kvantitativne RT-PCR i kvantitativne PCR u realnom vremenu

HaCaT ćelije su tretirane sa Q-3-G(5-30 μM) ili retinolom (10ug/mL) tokom 12 h. RNK je precipitirana upotrebom TRI reagensa kao što je ranije objavljeno [85]. Za sintezu komplementarne DNK korišten je komplet za sintezu cDNK. RT-PCR je proveden korištenjem specifičnih reverznih i naprijed prajmera. Prajmeri za RT-PCR i PCR u realnom vremenu navedeni su u tabeli 1.

4.5. DPPH test

DPPH test je korišten za procjenu kapaciteta uklanjanja radikala Q-3-G. Metanol je korišten za otapanje DPPH do konačne koncentracije od 250 μM. Tada je bilo 475 mL DPPH

reagovao sa 5 mL Q-3-G (0-40 μM) ili AA (500 mM) na 37 stepeni tokom 30 min. Pozitivna kontrola je bila AA. Određivanje DPPH efekta čišćenja i izračunavanje je izvršeno kao što je prethodno opisano [86].

4.6.ABTS test

ABTS test je izveden kao što je ranije objavljeno [72]. Ukratko, jednake količine 7,4 mM rastvora ABTS i 2,4 mM rastvora kalijum persulfata su pomešane i držane na sobnoj temperaturi preko noći da bi se generisali kationi radikala ABTS. ABTS rastvori su dodani u svaku jažicu ploča 96-jažica, uz dodatak Q-3-G(0-40 μM) ili AA (500 mM) po jažici. Smeše su inkubirane na 37 stepeni 30 minuta, a zatim je izmerena njihova apsorpcija na 730 nm.

4.7. Cellular ROS test pomoću protočne citometrije

Da bi se provjerilo stvaranje unutarćelijskog ROS-a, korištena je boja osjetljiva na oksidaciju, 2',7'-dihlorodihidrofluorescein diacetat (DCFDA). HaCaT ćelije su izložene UV zračenju, a zatim su ćelije sakupljene i resuspendovane sa 300 ul PBS sa 20 μM DCFDA tokom 30 minuta na 37 stepeni u mraku. Ćelije su zatim isprane PBS-om i fluorescencija je izmjerena na 485/535 nm pomoću Beckman CytoFLEX protočnog citometra (Beckman Coulter, Brea, Kalifornija, SAD).

4.8.Western blot analiza

HaCaT ćelije su zasejane pri gustini od 6×10 stepeni ćelija/mL. Nakon inkubacije preko noći, dodane su različite koncentracije Q-3-G（0-10 μM) ili retinola (10 ug/mL) i dalje inkubirane 24 h. Priprema proteina i lizati celih ćelija izvedeni su kao što je prethodno opisano [87]. Specifična antitela su korišćena za detekciju ukupnog oblika i fosforilisanog oblika Jun, JNK, MKK4, TAK1, p50, p65, IKK, IkB, Src i Akt, koji su vizualizovani hemiluminiscentnim reagensima [88].

4.9. Analiza sadržaja i sekrecije melanina

Ćelije B16F10 su posađene u gustini od 2×10 stepeni ćelija/mL u 12- ploče i inkubirane preko noći. Podloga za kulturu je zamijenjena svježom podlogom obogaćenom Q-3-G(10-20 μM) ili arbutinom (1 mM). Proizvodnja melanina je stimulisana a-MSH (100 nM) tokom 48 h. Za test lučenja melanina izmjerena je optička gustina na 475 nm. Nakon toga, ćelije su sakupljene da bi se odredio intracelularni sadržaj melanina, korištenjem pufera za lizu za lizu stanica i peletiranja centrifugiranjem (12,000 o/min, 5 min). Koncentrovane ćelijske pelete su rastvorene u 100 mL pufera za otapanje (1 M NaOH, 10 procenata DMSO) i otopljene na 55 stepeni. Apsorbanca je izmjerena na 405 nm pomoću čitača optičke gustoće [89].

4.10.UVB zračenje

HaCaT ćelije su posađene u gustini od 1×105 ćelija/mL u ploče sa 6-jažicama koristeći MEM bez seruma i podvrgnute su gladovanju 24 sata. HaCaT ćelije su prethodno tretirane sa G-3-Q tokom 30 minuta, a zatim UVB zračenjem. Zatim su HaCaT ćelije isprane sa PBS i izložene UVB zračenju (UVBLamp BLX-312, Vilber Lourmat, Francuska). Energija UVB zračenja bila je 30 mJ/cm2²【90】.

4.11.H2O2 Tretman

HaCaT ćelije su posađene u ploče sa 6-jažicama i podvrgnute 24 h gladovanja upotrebom MEM-a bez seruma. Ćelije su prethodno tretirane različitim koncentracijama Q-3-G（5-10 μM i nakon 30 minuta inkubirane sa H2O2 (500 μM) 12 h.

4.12. Luciferase Reporter Gene Assay

HEK293T ćelije su zasijane u gustini od 3×10 stepeni ćelija/mL u 24-jažice. Ćelije HEK293T su prebačene sa 2 ug plazmida koji sadrže AP-1-Luc ili NF-kB-Luc i b-galaktozidazu, koristeći polietilenimin[91]. Nakon 24 h inkubacije, ćelije su tretirane sa Q-3-G(5-10 μM) ili retinolom (10 ug/mL) naredna 24 h. Test luciferaze je izveden luminometrom pri čemu je apsorbancija svakog uzorka izmjerena na 475 nm pomoću čitača mikroploče Spectramax 250 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA), kao što je ranije objavljeno [92].

4.13. Cell Morphology Shooting

HaCaT ćelije su posađene u 6-ploče sa gustinom ćelija od 1×10 stepeni ćelija/mL. HaCaT ćelije su tretirane sa G-3-Q tokom 30 minuta, a zatim UVB zračenjem. Nakon 24 h, napravljene su fotografije objektiva 4×, 10× i 20× (Olimp, Tokio, Japan).

4.14. Statistička analiza

Svi podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna devijacija najmanje tri nezavisna eksperimenta. Za poređenje statističkih razlika između grupa korišteni su Mann-Whitney test i Studentov t-test. P-vrijednost<0.05 was="" regarded="" as="" statistically="" significant.="" all="" statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" spss(ver.25,="" spss="" inc.,="" chicago,="" il,="">

5. Zaključci

Naše istraživanje je pokazalo da Q-3-Ge pokazuje antiinflamatorne i antioksidativne aktivnosti štite od faktora oksidativnog stresa i upale pod UVB zračenjem i izlaganjem HO. Također smo pokazali da Q-3-G ima sposobnost stimulacije ovlaživača u HaCaT ćelijama. Pored antimelanogeneznog efekta Q-3-G, pokazalo se da inhibira lučenje melanina u -MSH-indukovanom B16F10. Konačno, efekat Q-3-G je posredovan kroz aktivaciju AP-1 i NF-kB signalnih puteva. Zaštitne aktivnosti Q-3-G u HaCaT ćelijama ljudskih keratinocita i B16F10 ćelijama mišjeg melanoma su sažete na slici 5. Ovo istraživanje je pokazalo da Q-3-G može biti efikasan zbog svog protuupalnog, antioksidativna, hidratantna i antimelanogeneza svojstva u ljudskim keratinocitima i ćelijama melanoma putem aktivacije NF-kB i AP{20}} puteva. Zaključno, rezultati jasno pokazuju da ovaj konjugirani metabolit ima potencijal da zaštiti stanice kože. Potrebna su dalja istraživanja kako bi se potvrdio učinak Q-3-G u različitim in vivo modelima, posebno u odnosu na modele za zaštitu kože.

Reference

1. Kim, E.; Hwang, K.; Lee, J.; Han, SY; Kim, E.-M.; Park, J.; Cho, JY Zaštitni učinak epigalokatehin galata na kožu. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 173. [CrossRef]

2. Draelos, ZD Novi tretmani za obnavljanje poremećene propusnosti epidermalne barijere: kreme za obnavljanje kožne barijere. Clin. Dermatol. 2012, 30, 345–348. [CrossRef] [PubMed]

3. Slominski, AT; mr Zmijewski; Zbytek, B.; Tobin, DJ; Theoharides, TC; Rivier, J. Ključna uloga CRF-a u sistemu odgovora kože na stres. Endocr. Rev. 2013, 34, 827–884. [CrossRef] [PubMed]

4. D'Orazio, J.; Jarrett, S.; Amaro-Ortiz, A.; Scott, T. UV zračenje i koža. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 12222–12248. [CrossRef]

5. Rittie, L.; Fisher, GJ kaskade signala izazvane UV svjetlom i starenje kože. Aging Res. Rev. 2002, 1, 705–720. [CrossRef]

6. Videira, IF; Moura, DF; Magina, S. Mehanizmi regulacije melanogeneze. An. Grudnjaci. Dermatol. 2013, 88, 76–83. [CrossRef] [PubMed]

7. Che, DN; Xie, GH; Cho, BO; Shin, JY; Kang, HJ; Jang, SI Zaštitni efekti ekstrakta stabljike grožđa protiv oštećenja izazvanih UVB zrakama na koži miševa C57BL. J. Photochem. Photobiol. B 2017, 173, 551–559. [CrossRef]

8. Jeong, D.; Lee, J.; Jeong, SG; Hong, YH; Yoo, S.; Han, SY; Kim, JH; Kim, S.; Kim, JS; Chung, YS; et al. Ekstrakt etanola Artemisia Asiatica ispoljava aktivnost protiv fotostarenja. J. Ethnopharmacol. 2018, 220, 57–66. [CrossRef]

9. McDaniel, D.; Farris, P.; Valacchi, G. Atmosfersko starenje kože - doprinosi i inhibitori. J. Cosmet. Dermatol. 2018, 17, 124–137. [CrossRef]

10. Rao, CV; Pal, S.; Mohammed, A.; Farooqui, M.; Doescher, MP; Asch, AS; Yamada, HY Biološki efekti i epidemiološke posljedice izloženosti arsenu i reagensi koji mogu poboljšati oštećenja od arsena in vivo. Oncotarget 2017, 8, 57605–57621.

11. Sinha, K.; Das, J.; Pal, PB; Sil, PC Oksidativni stres: Putevi apoptoze zavisni od mitohondrija i mitohondrija nezavisni. Arch. Toxicol. 2013, 87, 1157–1180. [CrossRef]