Dio 1 Preventivni efekti Fenilethanol Glycosides Iz Cistanche Tubulosa Na Goveda Serum Albumin-induced Jetrena fibroza u štakora

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Apstraktno

Pozadinu:Cistanche tubulosa je tradicionalni kineski biljni lijek koji se naširoko koristi za regulisanje imuniteta.Fenil etanol glycosides iz cistanche(CPhGs) iz ove biljke su prvenstveno učtivi materijali. Cilj ove studije bio je procjena preventivnih i terapevtskog djelovanja CPhG-ova na fibrozu jetre izazvanu BSA kod štakora i s tim povezanim molekularnim mehanizmima koji uključuju ćelije jetrenih stelata. Biejiarangan (BJRG), još jedan tradicionalni kineski biljni lijek, korišten je kao pozitivna kontrola. Metode: U in vivo eksperimentima, 75 SD štakora je bilo nasumično podijeljeno u 6 grupa: normalne (destilovane vode tretirane), model (BSA-tretirani), pozitivan lijek (BSA-tretiran + BJRG 600 mg/kg/dan), i BSA-tretirane + CPhGs (125, 250, i 500 mg/kg/dan). Jetra i slezena, Nivoi aspartat aminotransferaze (AST), alanin aminotransferaze (ALT), heksadecenoinske kiseline (HA), laminina (LN), prokolagena tipa III (PCIII), kolagena tipa IV (IV-C), hidroksiprolina (Hyp) i transformacije faktora rasta β1 (TGF-β1) izmjereni su u jetri štakora. Histopatološke ocjene za fibrozu jetre su ocijenjene za svaku grupu koristeći H&E i Massonova trihromna mrlja. Izraz TGF-β1, kolagen I (Col-I), i kolagen III (Col-III) određen je metodom imunohistohemijskog bojenja. Ovi efekti su dalje evaluirani in vitro određivanjem nivoa izraza NF-κB p65 i Col-I kvantitativnim PCR analizama u realnom vremenu. Col-I proteinska ekspresija je također ispitana zapadnim blottingom. Rezultati: Sve doze grupe (125, 250, i 500 mg/kg/dan) CPhGs značajno smanjile indeks jetre i slezene, smanjen ALT, AST, HA, LN, PCIII, IV-C serumski nivoi, sadržaj TGF-β1 (P< 0.01,="" p="">< 0.01,="" and="" p="">< 0.01),="" and="" hyp="" content.="" cphgs="" also="" markedly="" alleviated="" the="" swelling="" of="" liver="" cells="" and="" effectively="" prevented="" hepatocyte="" necrosis="" and="" inflammatory="" cell="" infiltration.="" immunohistochemical="" results="" showed="" that="" cphgs="" significantly="" reduced="" the="" expression="" of="" tgf-β1="" (p="">< 0.01,="" p="">< 0.01,="" and="" p="">< 0.01),="" col-="" i,="" and="" col-iii.="" the="" in="" vitro="" effects="" of="" cphgs="" (100,="" 75,="" 50,="" and="" 25="" ug/ml)="" on="" hsc-t6="" showed="" that="" cphgs="" significantly="" reduced="" mrna="" expression="" of="" nf-κb="" p65="" and="" col-i,="" and="" cphgs="" also="" downregulated="" col-i="" protein="" expression.="" conclusions:="" cphgs="" have="" a="" significant="" anti-hepatic="" fibrosis="" effect,="" and="" may="" be="" used="" as="" hepatoprotective="" agents="" for="" the="" treatment="" of="" hepatic="">

Keywords: Jetrena fibroza, Cistanche tubulosa, Phenylethanol glycoside, Chemokine BSA, Prevention and therapy.

Pozadinu

Fibroza jetre je odgovor za zacjeljenje rana na tešku povredu jetre koja se javlja u patogenezi kroničnog hepatitisa izazvanog raznim faktorima. Ovi faktori su virusna infekcija, zloupotreba alkohola, holestaza, i metaboličke i autoimune bolesti [1–3]. Progresivna akumulacija vanćelijskog matriksa (ECM) i sniženje preuređivanja poremeti normalnu arhitekturu jetre, što rezultira fibrozom jetre [4]. Fibroza jetre je kritična u kroničnoj bolesti jetre i često se razvija u nepovratnu cirozu i karcinogenezu. Trenutno ne postoje metode ili efikasni lijekovi za liječenje fibroze jetre. Stoga je hitno pronaći lijek protiv jetrene fibroze koji će umanjeti napredovanje ozljede jetre na fibrozu i rak.Cistanche tubulosaW (iz porodice Orobanchaceae) je parazitska biljka koja se široko uzgaja u južnom dijelu Xinjianga u Kini [5]. Ljudi ga obično koriste za ojačanje bubrega, nahranje krv, opuštaju crijevo, i odgađaju senescenciju. Službeno je naveden u kineskoj farmakopoeiji [6]. C. tubulosa sadrži razne aktivne komponente. To uključujeFenil etanol glycosides iz cistanche(CPhG), iridoidi, i polisaharidi. Kao jedna od mnogih aktivnih komponenti uC. tubulosa, CPhGs su pokazali uvjerljiv antioksidans, anti-umor, neuroprotektivne, i anti-upalne efekte i u in vivo i in vitro studijama [7]. Posljednjih godina, prijavljeno je da CPhGs(Fenil etanol glycosides iz cistanche) imaju hepatoprotektivne efekte. Potencijalni mehanizmi na kojima su ovi učinci su skalvengiranje slobodnih radikala, zaštita jetrenih membrana, imunoregulacija, inhibicija apoptoze, inhibicija izraza HBsAg i HBeAg, te inhibicija replikacije HBV DNK i drugih [8–11]. Međutim, malo studija u literaturi se obraća antihepatičkoj fibrozi efektu grafike. Stoga je ova studija za cilj bila istražiti anti-jetreni fibrozan učinak GPhC-ova korištenjem modela goveda serum albumina (BSA) inducirao fibrozu jetre u štakora. Povezani molekularni mehanizmi su istraženi u HSC-T6 ćelijama.

Metode

Hemikalije i reagenti

Hidroksiprolin (Alkalna hidroliza) (Lot: 20140616) je kupljen od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Kina). Rat TGF-β1 sendvič ELISA kits (Lot: 238240615) su kupljeni od Lianke Biotech Co., Ltd. (Kina). Rabbit Anti-Collagen I antitijelo (Lot: 140619), Rabbit Anti-Collagen III antitijelo (Lot: 980788 W), i Rabbit Anti-TGF-β1 antitijelo (Lot: 140619) je dao Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., LTD (Kina). Zatvoren sa normalnim ovčjim serumom (radni fluid) (Lot: WP141214), PV-6000 (Lot: WK141225), i DAB kit (Lot: K136621D) su kupljeni od Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd. (Kina). Otkrivanje primarnih antitijela je izvršeno pomoću 2. Antitijelo rješenje (Alk-Phos. Conjugated, Anti-zec) i 2. Antitijelo rješenje (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) (lot: 272387) kupljen od Invitrogen Company (SAD). Bovine serum albumin (BSA) (Lot: SLBG8239V) je kupljen od Sigme (SAD). Prije upotrebe, BSA je pripremljena na 18 g/L u normalnoj otopini, bakterija uklonjena filtracijom, a BSA pohranjena na 4 °C. Freundov nepotpuni adjuvant koji sadrži 1 g lipida iz ovčje kose (Lot: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Kina,) je pomiješan s 2 g tekući parafin (Lot: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (Kina,), steriliziran u parnom autoklavu, i pohranjeni na 4 °C. Pozitivan lijek BJRG je dobiven kao Biejiarangan tablete od Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (Kina). Zalihe lijekova BJRG pripremljene su rastvarajući BJRG tablete u destilovanoj vodi u koncentraciji od 600 mg/kg.

Biljni materijali

C. tubulosa(Porodica Orobanchaceae) je kupljena od minfeng regije Xinjiang iz Kine. Materijal je potvrdio istraživač Jun Zhao, Key Laboratory for Uighur Medicine, Institute of Materia Medica of Xinjiang. Vaučerski primjerci su deponirani u Institut Materia Medica iz Xinjianga.

Priprema CPhG-ova(Fenil etanol glycosides iz cistanche)

Sušene i narezane rizome odC. tubulosa(6,0 kg) su uzastopno ekstrahovane pod refluksom tri puta sa 70 % etanola, a otapao je uklonjen da bi se dao ekstrakt etanola. Ekstrakti etanola su pročišćeni korištenjem AB-8 smole za dobivanje fenil etanol glycosides (CPhGs). Stock otopine CPhG-ova koje se koriste za različite grupe doza u ispitivanjima na životinjama (500 mg/kg, 250 mg/kg, odnosno 125 mg/kg) otopile su se u 0,5 % (5 g/l) karboksimetil celuloze (natrijeva sol).

Kvantifikacija CPhG-ova(Fenil etanol glycosides iz cistanche)

Sadržaj dvije komponente (echinacoside i acteoside) u CPhG-ovima je odredio HPLC koristeći prethodno prijavljenu metodu (Zhang et al. 2004) [12]. HPLC je izveden pomoću Shimadzu LC-10A HPLC opremljen UV detektorom. Stub HPLC je bio Phenomenex Gemini ODS kolona (250 × 4,6 mm, 5 μm). Izokratska mobilna faza se sastoji od metanola-acetonitrila-1 % ocetske kiseline (15:10:75, v/v). Elucija je bila 40 min, a protok se zadržao na 0,6 mL/min. Temperatura stuba je bila konstantna pri 30 °C. UV detekcija je bila na 334 nm.

Životinje i HSC-T6 ćelijska linija

[Grade SPF] zdrav odrasli muškarac Sprague–Dawley (SD) štakori (180–220 g) su kupljeni od Xinjiang Medical University Animal Center, Licence No.: SCXK (New) 2011–0004. Štakori su hranjeni specifično bez patogena (SPF) chow. Sve procedure vezane za eksperimente na životinjama odobrene su od strane Komiteta za etiku životinja Prve povezane bolnice Medicinskog univerziteta Xinjiang. Štakori su bili u kavezima pod kontrolisanim uslovima okoline (25 °C i 12 h svjetlosnog/tamnog ciklusa) i imali su slobodan pristup standardnoj hrani pacova peleta i vodi iz slavine. Štakori su aklimirani prije liječenja. Ovjekovječeni pacovska linija stelatnih ćelija, HSC-T6, dobivena je od Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD. (Wuhan, China). HSC-T6 ćelije su bile kulturane u Dulbeccovu Modificiranom Orlovom medijumu (visoka glukoza) (DMEM, Peking, Kina) dopunjena sa 10 % fetalnog seruma goveda (Gibco, Južna Amerika), 100 IU/ml penicilina, i 100 μg/ml streptomicina (Peking, Kina) u vlažnom inkubatoru na 37 °C sa 5 % CO2.

Povreda jetre izazvana BSA-om i tretmani

Sedamdeset pet SD štakora je bilo nasumično podijeljeno u šest grupa: Normalno (destilirano tretirano vodom), model (BSAtreated), pozitivan lijek (BSA-tretiran + BJRG 600 mg/kg/ dan), i BSA-tretirani + CPhGs(Fenil etanol glycosides iz cistanche)(125, 250, 500 mg/kg/ dan) grupe. BSA-tretirane + CPhGs (125, 250, 500 mg/ kg/dan) grupe su imale 13 štakora u svakoj grupi, a druga grupa je imala 12 pacova u svakoj grupi. Model povrede jetre izazvan BSA se dijeli na primarnu sensitizaciju praćenu imunološkim napadom) [13]. Osim normalne grupe, druge grupe su davane više supkutanih injekcija sa 0,5 ml (9 mg/ml) BSA Freundovog nepotpunog adjuvansa na dan 1, dan 15, dan 22, dan 29, i dan 36 za primarnu sensitizaciju. Sedam dana nakon pete injekcije, krv je dobivena kroz pleksus pacovske retinske žile i testirana na serumska albumina antitela. BSA antitijelo u serumu štakora je otkriveno dvostrukom metodom difuzije agara. Injekcija napada izvršena je davanjem 0,4 ml BSA u normalnoj otopini bila je kroz kaudalnu liniju u BSA antitijela pozitivnih štakora dva puta tjedno deset puta. Koncentracije i vrijeme injekcija bile su 5,00, 5,50, 6,00, 6.50, 7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 i 10.00 g/L na dan 46, dan 50, dan 53, dan 57, dan 60, dan 64, dan 67, dan71, dan 74, odnosno dan 78. U normalnoj grupi, normalni salin se koristio za imunološku primarnu (sensitizaciju) i sekundarne (napadne) injekcije umjesto BSA, a drugi uslovi su bili isti kao i oni u model grupi. Normalna grupa je oralno davana destilovana voda sa dozom od 10 ml/kg/dan. Grupa modela je oralno dana 10 ml/kg/dan 0,5 % CMC-Na otopine. Pozitivna grupa lijekova je oralno dana 600 mg/kg/dan BJRG. BSA-tretirani + CPhGs (125,

250, i 500 mg/kg/dan) grupe su oralno dane 125, 250, i 500 mg/kg/dan CPhGs(Fenil etanol glycosides iz cistanche), odnosno. Dnevni pacovi doziranje nastavili su se dvije sedmice nakon posljednje injekcije. Nakon eksperimentalnog perioda, štakori su postili 12 h prije 10 % hloralnog hidrata, a zatim odmah eutanizirani. Uzorci seruma su prikupljeni od svakog štakora i odmah korišteni. Jetre su ubrane u dvije svrhe: (1) očuvanje u tekućem dušiku za Hyp kitove i (2) fiksaciju u 10 % formaldehidu za histološke i imunohistohemijske preglede. Cijelo trajanje studija na životinjama je bilo 93 dana.

Jetreni i slezenini indici

Jetra i slezena su secirane laparotomija i oprane sa 4 °C normalnih salin. Nakon apsorbacije viška vode filter papirom, jetra i slezena su vagane kako bi se izračunali odgovarajući indici: Relativna težina organa = masa organa (g)/pojedinačna tjelesna masa (g) × 100 % [14].

Eksperimenti ćelija

HSC-T6 ćelije su bile tanjirane u 96-dobroj pločici. U početku su ćelije bile kulturane sa DMEM-om koji je sadržavao 10 % FBS za 48 h. Medij je tada zamijenjen sa DMEM-om bez FBS-a kako bi izgladnjeli ćelije 12 h. Ćelije su tada bile kulturane sa DMEM-om koji je sadržavao 5,0 ng/mL TGF-β1 (bez FBS) za 24 h. Konačno, različite koncentracije CPhG-ova(Fenil etanol glycosides iz cistanche)(100ug/ml, 50ug/ml, i 25ug/ ml), akteoside (6 ug/ml, 3 ug/ml i 1,5 ug/ml), i ehinakoside (500ug/ml, 250ug/ml, i 125ug/ml) su izvedeni u tanjiru u kvadruplikatnim wellima i inkubirali za 48 h.

PCR analiza u realnom vremenu

Nivo mRNA izraza NF-κB, p65, i kolagenA sam bio određen pcR-om u realnom vremenu. Da bi se utvrdili mRNA izrazi u HSC-T6 ćelijama, ćelije (4 × 105 ćelija) bile su zasjenjene u šest-dobrom pločama sa 3 mL DMEM sa 10 % FBS i inkubirali preko noći na 37 °C i 5 % CO2, nakon čega su mediji za kulturu ćelija promijenjeni u DMEM bez seruma. Dalje, CPhGs(Fenil etanol glycosides iz cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml, i 25 ug/ml), akteoside (6 ug/ml, 3 ug/ml, i 1,5 ug/ ml), te ehinakoside (500 ug/ml, 250 ug/ml, i 125 ug/ml) su dodani u wells. Nakon 48 h inkubacije CPhG-om ili monomernim sastavima, totalna RNK je ekstrahirana pomoću TRIzol reagenta (Invitrogen, SAD) i energično uzrujana hloroformom za 15 s. Nakon sjedenja na sobnoj temperaturi 3 min, lisat je centrifugiran na 12.000 × g 15 min na 4 °C. RNK u vodenoj fazi je precipitiran izopropanolom, a gornje vodena faza je prebačena u novu mikrocentrifugnu cijev. RNK je bila precipitirana dodavanjem 0,75 % etanola, nakon čega je mikrocentrifugna cijev i centrifugirana na 12.000 × g na 4 °C ne više od 5 min. Supernatant je uklonjen, a RNK je sušena na sojnoj temperaturi 5–10 min. Specifični set primera (Sangon, Šangaj, Kina) koji su korišteni za pojačavanje štakora β-actin [GenBank: NM_031144.3], Collagen I [GenBank: NM_ 053304.1], i NF-κB p65 [GenBank: NM_199267.2] geni su dizajnirani pomoću serije Primer 3. Prednji (fw) i obrnuti (rv) primeri bili su slijedeći: Kolagen I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG, rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), β-aktin (fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G, rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Rezultati su normalizirani na mRNA gena β-aktin kao interna kontrola i predstavljeni su kao relativni nivoi MRNA. Reakcije su izvedene sa 8 μL iQ SYBR Green Supermix, 1 μL 10 pM primer par, 8,5 μL destilovane vode, i 2,5 μL cDNA. Svaka lančana reakcija polimeraze izvedena je pod sljedećim uvjetima: 95 °C za 3 min, zatim 40 ciklusa od 10 s na 95 °C, 30 s na 55 °C, a 10 s na 55 °C – 95 °C za produžetak, a zatim jednostruko mjerenje fluorescencije. Konačni rezultati su opisani sa relativnim vrijednostima (2-ΔΔCt). Izračunavanje i analizu je izvršio iQ5 PCR detekcioni sistem u realnom vremenu.

Analiza zapadnog blot-a

Collagen I (Abcam, Cambridge, UK, Art No: ab34710) nivoi ekspresije proteina su utvrđeni zapadnim blottingom [sa β-aktin (Lot: 60008-1-lg; Proteintech, Kina) kao kontrola èuvanje. Celoćelijski ekstrakti su pripremljeni pomoću Radioimmunoprecipitacionog ispitivanja (RIPA) (Thermo Scientific, USA) sa 1 % Koktelom inhibitora proteaze Halt (Thermo Scientific, USA) i 1 % Koktelima inhibitora halt fosfataze (Thermo Scientific, USA). Koncentracija proteina je izmjerena i kvantificirana Bradford metodom [18]. Protein (10–50 ug) je odvojen na 10 % SDS-PAGE gelu i prebačen na PVDF membrane (Millipore, USA). Membrane su bile blokirane 1 h na temperaturi sobe sa 5 % BSA, a primarna antitijela (anti-kolagen I antitijela, 1:200 razlučivanje ili miša mAb od β-aktina, 1:5000 razlučivanje) su inkubirali na 4 °C preko noći. Odgovarajući Alk-Phos. konjugirana sekundarna antitijela su inkubirana na temperaturi sobe. Konačno, membrane su tri puta oprane sa 1 × Tris–HCl sa 0,1 % Tween 20, a signale je skenirao i vizualizirao GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad). Densitometrijska analiza je izvršena na proteinima interesa i normalizirana na β-actin od strane GEL DOC Image Studio softvera (Bio-Rad). β-aktin je korišten kao unutrašnja kontrola.

Statistička analiza

Shapiro-Wilk test normalnosti i Leveneov test varijance homogenosti su primijenjeni za verifikaciju normalnosti i You et al. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Page 4 of 13homogeneity of variance. Analiza odstupanja (ANOVA) praćena Tukey-jevim post hoc testom korištena je za identifikaciju statističkih razlika nehomogenih, normalno distribuiranih podataka. Kruskal-Wallisov nea paramaterički test je korišten za analizu podataka koji nisu obično raspoređeni ili homogeni. Rezultati su izraženi kao ± SD. Significance je postavljen na P< 0.05.="" all="" data="" were="" analyzed="" by="" spss="" 16.0="" software="" (xinjiang="" medical="">

Rezultate

Kvantitativno određivanje CPhG-ova

CPhGs u C. tubulosa sadrže dva fenilil alkohola glycosides, echinacoside, i akteoside, a njihov sadržaj u CPhGs su utvrđeni HPLC analiza (sliv. 1) biti 42,71 ± 0,42 % odnosno 14,27 ± 0,18 %.

Jetreni i slezenini indici

Kao što je prikazana tabela 1, jetra i slezena su značajno povišeni [P< 0.01,="" p="">< 0.05].="" the="" liver="" and="" spleen="" indices="" of="" the="" positive="" drug="" bjrg="" and="" cphgs="" at="" different="" dose="" groups="" were="" significantly="" reduced="" compared="" with="" the="" model="" group="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0.004," pliver="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070," respectively].="" the="" liver="" and="" spleen="" indices="" were="" lower="" than="" those="" of="" the="" model="">

Efekti CPhG-ova na ALT, AST aktivnosti, i markere fibroze jetre

U sadašnjoj studiji, nivoi seruma jetrenih enzima AST i ALT su značajno povećani u grupi modela, što je odraz hepatocellularnog oštećenja kod BSAinduciranih štakora fibroze jetre. Međutim, eksperimenti.

pokazalo je da je liječenje BJRG-om (600 mg/kg) i CPhG-om (125, 250 i 500 mg/kg) značajno smanjilo AST [PAST< 0.001,="" past="">< 0.001,="" past="">< 0.001,="" past="">< 0.001,="" respectively]="" and="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189," palt="0.255," respectively]="" levels="" in="" hepatic="" fibrosis="" rats.="" (table="" 2).="" the="" levels="" of="" ha,="" ln,="" pc="" and="" iv-c="" in="" model="" rats="" were="" significantly="" increased="" [pha="">< 0.001,="" pln="">< 0.001,="" ppciii="0.002," piv-c="">< 0.001,="" respectively].="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" levels="" of="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023," respectively],="" ln="" [pln="0.011," p="" ln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069," respectively],="" pc="" iii="" [p="" pciii="0.006," p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," respectively],="" and="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" respectively]="" in="" rats="" were="" markedly="" decreased="" by="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" and="" cphgs="" at="" different="" dose="" groups="" (125,="" 250,="" and="" 500="" mg/kg)="" (table="" 3).hyp="" content="" and="" tgf-β1="" collagen="" content="" was="" also="" detected="" by="" measuring="" hyp="" levels="" in="" liver="" tissue.="" as="" shown="" in="" table="" 4,="" the="" mean="" hyp="">nivo u grupi modela je bio znatno veći od normalne grupe, ali je bio znatno umanjen u BJRG grupi i različitim CPhGs grupama doza. Jetra koncentracije TGF-β1 grupe modela u štakora je značajno povećana [P< 0.001].="" compared="" with="" the="" model="" group,="" tgf-β1="" levels="" of="" the="" positive="" drug="" and="" the="" different="" cphgs="" dose="" groups="" were="" markedly="" decreased="" [p="" tgf-β1="">< 0.001,="" p="" tgf-β1="">< 0.001,="" p="" tgf-β1="">< 0.001,="" ptgf-β1="">< 0.001,="" respectively].="" the="" results="" are="" summarized="" in="" table="">

Histopatološki pregled

Opažanja normalnih jetrenih tkivnih sekcija umrljanih sa H&E i Massonov trihrom pokazuje različite jetrene lobule i jetrene sinusoide. Struktura jetrenog tkiva u modelu štakora je bila poremeæena, a jetreno tkivo i jetreni sinusoidi su zamijenjeni velikom kolièinom vezivnog tkiva. Međutim, normalnija cistoarchitektura i manje vezivno tkivo otkriveni su u terapijsku grupu od onih iz grupe modela.

H&E mrlja

U normalnoj grupi uočeni su strukturni integritet jetrinog lobula bez abnormalnih portalnih područja i sinusoidi jetri. Jetne vrpce su bile poredane na uredan način, sa jezgrom okrugle i čiste. Jedro se nalazi u centru ćelije, sa obilnom cistoplazmom. Samo portalno područje ima malu količinu vlaknanog tkivo (sliv 2a). U grupi modela, lobularna struktura je teško oštećena. Ćelije jetre su pokazale blagu vodenu degeneraciju, uglavnom degeneraciju balona i/ili masnu degeneraciju. Primjećivana je i formiranje upalne ćelijske infiltracije, obimne hiperplazija vlaknastog tkiva, formiranje velikog broja vlaknastog septuma, podijeljenih lobula i značajnog proliferacije jetrenih ćelija. Ova zapažanja potvrdila su uspjeh uspostave životinjskog modela pacovske imunoloske ozljede životinjskog modela fibroze jetre (sliv. 2b). U odnosu na grupu modela, bilo je smanjenje infiltracije upalnih ćelija u različitim CPhG-om. Također su uočeni manje nekroze i masne degeneracije jetrenih ćelija kao i ublažavanje fibroze. CPhGs je značajno ublažio patologiju fibroze jetre izazvane BSA kod štakora, ublažio oticanje jetrenih ćelija, i učinkovito spriječio nekrozu hepatocita i infiltraciju upalnih ćelija, što ukazuje da CPhG-i izražuju zaštitni učinak na BSA-induciranu pacovsku fibrozu jetre. (Fig. 2c–f). Massonova trihromna mrlja U normalnoj grupi, tkivo jetre je bilo normalno. Područje jetrenog portala pokazalo je mali broj vlakana plavog kolagena, a tkivo jetre je normalno strukturirano (fig. 3a). U poređenju sa jetrenim tkivom normalne grupe, vlaknasto tkivo proliferirano centralnim uletom i prošireno u parenhim jetre. Kolagenska vlakna proširena i povezana i

omotao cijeli lobule i okružio centralnu žilu. Ovi efekti, zajedno sa fibrozom hepatocita, lobularnim strukturnim oštećenjem, fibrozom periportala, i formiranjem pseudolobula (fig. 3b) pružili su dokaze da je model utvrđen. U odnosu na grupu modela, kolagenska vlakna u pozitivnoj skupini za kontrolu lijekova blago su proširena prema van od područja perifernog portala (fig. 3c). U odnosu na grupu modela, kolagena vlakna u različitim CPhGs grupama doza su značajno smanjena, proliferacija vlakana je inhibirana, a proliferacija vlaknastog tkivo unutar jetrenog parenhima značajno smanjena. Ovi rezultati su sugerirali da su CPhG-ovi štitili štakore od jetrene fibroze izazvane BSA (smokva.3d–f).

Imunohistokemijska mrlja

Važno je da izraz kolagena tipa I i kolagena tipa III igraju bitne uloge u razvoju jetrene fibroze, a njihova generacija i taložnost u jetrenom tkivu mogli bi poslužiti kao važna odrednica antihepatičke fibroze. Rezultati su sažimani u tabeli 5

Kolagen tipa I

Normalna grupa je izrazila kolagen tip I uglavnom u krvnim sudovima i području portala. Grupa modela visoko izražena kolagenska fibroza tipa I u portalnim područjima. U prostoru Dissea, flekanje kolagena tipa I je primjećivano nizovima ili kao zakrpa raspodjela. Kolagen je omotao vlaknastu septu da formira pseudolobul. U tim eksperimentima, Manje vlaknasta septa formirano je za BJRJ (600 mg/kg) i različite grupe doza CPhG-ova (125, 250 i 500 mg/kg) [PCol I = 0,002, PCol I = 0,001, PCol I = 0,023, odnosno P Col I = 0,044]. Polukvantitativni rezultati su otkrili da je izraz njihovog kolagena tipa I bio znatno niži u odnosu na grupu modela (fig. 4).

Kolagen tipa III

Kolagen tipa III je slabo izražen u normalnoj grupi, a periferna područja koja okružuju portal i jeterne vene su pokazivala malu količinu fine žute umjesto kontinuiranih vlakana (fig. 5a). U grupi modela kolagena vlakna su pokazivala široke i debele vrpce, što ukazuje na jaku ekspresiju, uglavnom smještenu u portalnim i vlaknastim tkivnim područjima (sliv. 5b). Kolagena vlakna BJRJ (600 mg/kg) i različite grupe doza CPhG (125, 250, i 500 mg/kg) bila su filamentna i raspoređena oko centralne zine i portalnih područja. U odnosu na grupu modela, kolagenska vlakna su značajno smanjena, mrlja je bila blijeda i tanka, a imunohistokemijska mrlja je bila slabo pozitivna (fig. 5c–f ). Ovi polukvantitativni rezultati pokazuju da su pozitivno izražene ćelije u pozitivnim i različitim grupama doza [PCol III = 0,015, PCol III = 0,001, PCol III = 0,010, a P Col III = 0,037, odnosno] bile različite od onih iz grupe modela.

TGF-β1

Bilo je malo izraza TGIF-β1 u normalnim ćelijama štakorske jetre. Izraz je bio ograničen na mali broj intersticijskih ćelija (fig. 6a). U grupi modela, TGF-β1 izraz je bio široko raspoređen u području portala, vlaknasti prostori, ćelije jeterne stelate, upalne ćelije, sinusoidni zid i cistoplazma. Određena oblast portala je izlagala snažno pozitivan izraz sa braonkasto-žutim bojenjem (fig. 6b). U području portala je bila mala količina izraza i vlaknasta septa BJRJ (600 mg/kg) i različite dozne grupe CPhGs (125, 250, i 500 mg/kg). Obim pozitivnog mrljanja u tim grupama je značajno smanjen u odnosu na onu iz grupe modela. Stajning u intersticijskim ćelijama u vlaknastoj septi i citoplazmi upalnih ćelija je bio umanjena (fig. 6c–f ). Polukvantitativni rezultati su otkrili da su BJRJ i različite grupe doza CPhGs [P TGF-β1 = 0,001, P TGF-β1< 0.001,="" p="" tgf-β1="0.009," ptgf-β1="0.004," respectively]="" were="" significant="" compared="" with="" the="" model="" group.="" as="" mentioned="" earlier="" in="" the="" article,="" tgf-β1="" is="" an="" important="" cytokine="" in="" the="" pathophysiology="" of="">

fibroza, stimulirajući proizvodnju vanćelijske matrice [19]. Pokazali smo da se nivo TGF-β1 povećao u model grupi na način koji odgovara ozbiljnosti fibroze jetre. Nivoi ekspresije TGF-β1 u jetre su bili u skladu sa nivoima TGF-β1 seruma. To ukazuje da CPhG-i mogu značajno smanjiti fibrozu jetre zbog izraza TGF-β1 sudjelovanjem u sintezi i degradaciji ECM-a. Izraz kolagena tipa I, kolagena tipa III, i TGF-β1 može otkriti patološki proces fibroze jetre. Njihov nivo izražavanja u grupama za liječenje je značajno opao i ilustriran je da CPhG-i mogu poboljšati aktivnost kolagenaze, održavajući dinamičku ravnotežu sinteze i degradacije jetrenog ECM-a, te tako odgoditi i spriječiti formiranje fibroze jetre.