Feniletanoidni glikozidi Cistanche Tubulosa indukuju apoptozu u Eca-109 ćelijama putem puta koji zavisi od mitohondrija
Mar 06, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
CHANGSHUANG FU, JINYU LI, ADILA AIPIRE, LIJIE XIA, YI YANG, QIUYAN CHEN, JIE LV, XINHUI WANG i JINYAO LI
Abstract
Cistanche tubulosaima različite biološke funkcije. U ovoj studiji istražen je antitumorski učinak feniletanoidnih glikozida C. tubulosa (CTPG-W) rastvorljivih u vodi na rak jednjaka. Eca-109 ćelije su tretirane CTPG-W, a vitalnost ćelija je mjerena MTT testom. Apoptoza, ćelijski ciklus, potencijal mitohondrijske membrane (Δψm) i reaktivne vrste kiseonika analizirani su protočnom citometrijom. Nivoi proteina u apoptotičkim putevima otkriveni su Western blot analizom. Utvrđeno je da CTPG‑W značajno smanjuje vitalnost Eca-109 ćelija kroz indukciju apoptoze i zaustavljanje ćelijskog ciklusa. Nakon tretmana CTPG-W, Δψm Eca-109 je značajno smanjen, što je povezano sa povišenim nivoima B-ćelijskog limfoma-2 (Bcl-2)-povezanog X i smanjenim nivoima od Bcl-2. Posljedično, nivoi citokroma c i c-Jun NH2-terminalne kinaze su povećani, što je povećalo nivoe cijepane-poli (ADP-riboze) polimeraze i cijepane-kapaze-3, {{18} } i -9, ali ne kaspaza-8. Shodno tome, nivoi reaktivnih vrsta kiseonika u ćelijama Eca{21}} pokazali su značajne promjene. Ovi rezultati su pokazali da je CTPG-W inducirao apoptozu Eca-109 ćelija putem mitohondrijalno zavisnog puta.
Uvod
Rak jednjaka je jedan od najčešćih tipova karcinoma sa 11. najvišom stopom morbiditeta i 6. najvećom stopom mortaliteta u svijetu i uzrokovao je smrtnost od ~439,000 u 2015. (1). Incidencija karcinoma jednjaka značajno varira među različitim regionima, pri čemu su istočna Azija i istočna i južna Afrika ispoljile najviše stope incidencije, a zapadna Afrika je imala najniže stope u 2012. (1,2). U Kini, procijenjeni slučajevi raka jednjaka i smrtnost bili su 477,000 odnosno 375000, u 2015. godini (3). Iako se stopa morbiditeta od karcinoma jednjaka smanjila u zemljama srednjeg i visokog srednjeg sociodemografskog indeksa između 2005. i 2015. godine, stopa mortaliteta ostaje visoka zbog loše prognoze (1,4). Kombinacija kirurške resekcije s kemoterapijom ili radioterapijom korištena je za liječenje raka jednjaka, međutim, zabilježeno je da je između 2003. i 2014. godine 5-godišnja stopa preživljavanja ostala<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">
Tradicionalna kineska biljna medicina (CHM) koristi se za liječenje različitih tipova karcinoma, uključujući karcinom pluća ne-malih stanica (6), kolorektalni karcinom (7), hepatocelularni karcinom (8). Nedavno su klinička ispitivanja objavila da kombinacija CHM s kemoterapijom ili radioterapijom ne samo da je pokazala brojne prednosti na kvalitetu života i ublažavanje nuspojava izazvanih kemoterapijom ili radioterapijom (9,10), već je i poboljšala stopu preživljavanja pacijenata. s karcinomom pluća, jetre, želuca, debelog crijeva, nazofarinksa ili grlića materice (9). Međutim, postoje oprečni dokazi o efikasnosti CHM tretmana na rak jednjaka (10,11). Brojne studije su utvrdile da brojni biljni lijekovi ili komponente mogu inhibirati rast ćelija raka jednjaka in vitro i in vivo, uključujući Andrographis paniculata (12,13), Daikenchuto (14), icariin (15), Rosa Roxburghii Tratt i Fagopyrum Cymosum (16), Jaridonin (17), Marsdenia tenacissima (18), OP16 (novi ent-kaurene diterpenoid) (19), Qigesan (20) i Tonglian decoction (21). Cistanche je vrsta CHM i ima različite biološke funkcije, uključujući antioksidaciju, anti-inflamaciju i neuroprotekciju (22,23). Naša prethodna studija je to pokazalaCistanche tubulosa feniletanoidni glikozidi(CTPG) može suzbiti rast ćelija melanoma B16-F10 in vitro i in vivo (24). Međutim, loša rastvorljivost CTPG-a u vodi koji je prethodno korišten ograničava razvoj lijeka (24). Zbog toga je korišćen CTPG rastvorljiv u vodi (CTPG-W) i istražen je antitumorski efekat na ćelije raka jednjaka (Eca-109). Utvrđeno je da CTPG-W može dozno-zavisno inhibirati vitalnost Eca-109 ćelija kroz indukciju apoptoze putem mitohondrijalnog puta.
Materijali i metode Životinje.
Ženke C57BL/6 miševa (6-8 sedmica, ~25 g) kupljene su od Pekinškog laboratorijskog istraživačkog centra za životinje (Peking, Kina) i smještene u kontroliranu temperaturu (25˚C), lagani ciklus (12/ 12) Ustanova za životinje Univerziteta Xinjiang (Urumqi, Kina). Sve životinje su dobile vodu i hranu bez patogena.
Ćelijska linija i kultura. Ćelijska linija humanog karcinoma jednjaka (Eca-109) sačuvana je u Ključnoj laboratoriji za biološke resurse i genetski inženjering Xinjiang (Koledž prirodnih nauka i tehnologije, Univerzitet Xinjiang, Urumqi, Kina) i kultivirana u RPMI{{1} } medij (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, SAD) sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma inaktiviranog toplinom (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Kina), 1 posto L -glutamin (100 mM), 100 U/ml penicilina i 100 µg/ml streptomicina na 37˚C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5 posto CO2.
Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC). CTPG-W (kat. br. SGJG20170410) je kupljen od Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Šangaj, Kina). Glavna jedinjenja CTPG-a su kvalifikovana i kvantifikovana pomoću HPLC prema našoj prethodnoj studiji (24). Ukratko, HPLC je sprovedena na ZORBAX SB-C18 koloni (250x4,6 mm; 5 µm) na 30°C i eluirana sa 0,2% rastvorom mravlje kiseline i gradijentom metanola počevši od 23% pošto je dodavan 1 ml svake minute. 45 minuta dok ne dostigne 31 posto. Ukupno 10 µl uzorka je ubrizgano i detektovano na 330 nm. Standard ehinakozida je kupljen od Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Šangaj, Kina), a standard akteozida je kupljen od Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka). Standardi su korišteni za analizu komponenti CTPG-W.
MTT test. Proliferacija ćelija je merena MTT testom. Eca{{0}} ćelije su inokulirane u 96-jažice u gustini 5x103 ćelije u 100 µl RPMI{{5 }} podloga/bunarić i kultivisan na 37˚C 24 h, zatim tretiran različitim koncentracijama (0, 200, 400, 600 i 800 µg/ml) CTPG-W ili 0,4 posto dimetil sulfoksida (DMSO) 24, 48 i 72 h. DMSO je korišten kao kontrola rastvarača (800 µg/ml CTPG-W koji sadrži 0,4 posto DMSO). Kao pozitivna kontrola korišten je cisplatin (20 µg/ml). Nakon toga, supernatant je odbačen nakon centrifugiranja na 225 xg tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi, a 100 µl MTT rastvora (0,5 mg/ml u RPMI-1640 mediju bez FBS) je dodato u svaku jažicu i inkubirano na 37˚C za 3 h. Formirani kristali formazana su otopljeni u 200 µl DMSO. Vrijednosti optičke gustine (OD) mjerene su na talasnoj dužini od 490 nm pomoću 96-čitača mikroploča (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, Kalifornija, SAD). Relativna vitalnost ćelija izračunata je prema formuli: Vijabilnost ćelije ( procenat )=(ODtretirano/ODnetretirano)x100 procenata. Morfologija Eca‑109 ćelija je posmatrana invertovanim fluorescentnim mikroskopom (uvećanje, x200) (Nikon Eclipse Ti‑E; Nikon Corporation, Tokio, Japan).
Za proliferaciju splenocita, C57BL/6 miševi su eutanazirani dislokacijom grlića materice, a slezine su izolirane. Napravljena je jednoćelijska suspenzija i splenociti su zasijani u 96-ploče sa jažicom u gustini od 1x105 ćelija/jažici u 100 µl RPMI-1640 medijuma, a zatim tretirani različitim koncentracijama (0, 200, 400, 600 i 800 µg/ml) CTPG-W tokom 24, 48 i 72 h na 37˚C sa 5% CO2. Proliferacija splenocita je mjerena MTT testom, prema gore navedenom protokolu. Stimulatorni indeks=ODtreated/ODuntreated.
Mjerenje apoptoze i ćelijskog ciklusa. Eca{{0}} ćelije su kultivisane u posudama od 60 mm pri gustini 2,5x105 ćelija po posudi tokom 24 h i tretirane različitim koncentracijama ({{31} }, 200, 400, 600 i 800 µg/ml) CTPG-W ili 0,4 procenta DMSO tokom 24 h na 37˚C sa 5 procenata CO2. Ćelije su sakupljene i obojene kompletom za detekciju apoptoze Annexin V-fluorescein izotiocijanat (FITC)/Propidium jodid (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Šangaj, Kina), prema protokolima proizvođača. Uzorci su prikupljeni protočnom citometrijom (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, SAD) i analizirani pomoću FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, SAD). Da bi se analizirao efekat CTPG-W na ćelijski ciklus, 2,5x105 Eca-109 ćelija je zasejano u posude za kulturu od 60 mm i tretirano sa CTPG-W (0, 100, 200 i 400 µg/ml) ili 0,4 procenat DMSO tokom 24 h na 37˚C sa 5 procenata CO2. Sve ćelije su sakupljene i isprane dva puta ledeno hladnim PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), zatim fiksirane u 70 posto ledeno hladnom etanolu na 4˚C tokom 30 minuta. Nakon dva puta ispiranja ledeno hladnim PBS-om, ćelije su resuspendirane u 300 µl PI/RNase pufera za bojenje (BD Biosciences, San Jose, CA, SAD) 10 minuta na sobnoj temperaturi. Distribucija ćelijskog ciklusa je analizirana pomoću softvera ModFit LT 3.0 protočnom citometrijom (BD FACSCalibur).
Analiza potencijala mitohondrijske membrane (Δψm) i reaktivnih vrsta kiseonika (ROS). Za analizu Δψm, Eca{{0}} ćelije su tretirane CTPG-W (0, 400, 600 i 800 µg/ml) ili 0,4 posto DMSO za 24 h na 37˚C sa 5 posto CO2, i obojen kompletom za analizu potencijala mitohondrijske membrane sa JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Šangaj, Kina), prema protokolu proizvođača, 20 minuta na 37˚C . Nakon dva puta ispiranja sa JC-1 puferom za ispiranje (Beyotime Institute of Biotechnology), uzorci su resuspendirani sa 300 µl JC‑1 pufera za ispiranje i analizirani protočnom citometrijom (BD FACSCalibur). Fluorescencija boje JC‑1 u ćelijama Eca‑109 takođe je primećena pomoću invertovanog fluorescentnog mikroskopa (uvećanje, x200; Nikon Eclipse Ti‑E). Za analizu ROS, Eca{21}} ćelije su tretirane CTPG-W (0, 400, 600 i 800 µg/ml) tokom 2, 4, 6, 12 i 24 h i obojene reaktivnim vrstama kiseonika Komplet za analizu (Beyotime Institute of Biotechnology), prema protokolu proizvođača, 20 min na 37˚C. Nakon tri puta ispiranja ledeno hladnim PBS-om, uzorci su sakupljeni protočnom citometrijom (BD FACSCalibur) i analizirani softverom FlowJo 7.6.
2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) aktivnost uklanjanja radikala. Aktivnost uklanjanja slobodnih radikala CTPG-W određena je DPPH testom slobodnih radikala prema objavljenom protokolu uz manju modifikaciju, jer je metanol zamijenjen etanolom kako bi se rastvorio DPPH (25,26). Za mjerenja u stabilnom stanju, 150 µl DPPH (100 mmol/l) u etanolu pomiješano je sa različitim koncentracijama CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 i 600 µg/ml) u 50 µl PBS, i inkubirano u mraku 30 minuta na sobnoj temperaturi. Apsorbancija na 517 nm je detektirana u prisustvu i odsustvu CTPG-W. Kao pozitivna kontrola korišteno je ukupno 50 µl vitamina C. Aktivnost uklanjanja radikala DPPH izračunata je korištenjem formule: Čišćenje (% )=[1-(Uzorak-Ablank)/A0] x100, gdje je Ablank apsorbanca kontrole (bez DPPH), Uzorak je apsorpcija uzorka, a A0 je apsorpcija PBS-a sa DPPH.
Western blot analiza. Eca{{0}} ćelije su tretirane sa CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) ili 0,4 procenta DMSO tokom 24 h na 37˚C sa 5 procenata CO2. Nakon dva puta ispiranja sa PBS, ćelije su lizirane u puferu za lizu radioimunoprecipitacije (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Peking, Kina) 20 minuta na ledu. Nakon centrifugiranja na 10,000 xg u trajanju od 10 minuta na 4˚C, supernatanti su sakupljeni, a koncentracije proteina su detektovane kompletom bicinhoninske kiseline (Thermo Fisher Scientific, Inc.) prema protokolima proizvođača. Western blot analiza je provedena prema našem prethodnom opisu (24). Antitijela protiv kaspaze-7 (kat. br. D120077), kaspaze{19}} (kat. br. D155240), kaspaze-9 (kat. br. D220078), B-ćelijskog limfoma{ {24}} (Bcl-2)-povezani X (Bax) (kat. br. D220073) i Bcl-2 (kat. br. D260117), i anti-mišji IgG-peroksidaza hrena (HRP) ) (kat. br. D111050) i anti-zečji IgG-HRP (kat. br. D110058) kupljeni su od BBI Life Sciences (Šangaj, Kina). Antitijela protiv kaspaze-3 (kat. br. E-AB-10050) i aktivne kaspaze-3 (kat. br. E-AB-22115) kupljena su od Elabscience ( Wuhan, Kina). Ostala antitela protiv kaspaze-7 (kat. br. 9492), poli (ADP-riboza) polimeraze (PARP) (kat. br. 9542), citokroma c (kat. br. AC909), c-Jun NH{ {48}}terminalna kinaza (JNK) (kat. br. 9252S) i -aktin (kat. br. 58169) dobijeni su od Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, SAD). Sva primarna i sekundarna antitijela su razrijeđena u omjeru 1:1,000. Primarna antitijela su inkubirana na 4˚C preko noći, a sekundarna antitijela su inkubirana na 37˚C 1 h.
Ciljni proteini su detektovani korišćenjem kompleta za ispitivanje poboljšane hemiluminiscencije (Beyotime Institute of Biotechnology), prema protokolu proizvođača.
Statistička analiza. Statistička značajnost je izračunata jednosmjernom analizom varijanse sa Tukeyjevim post hoc testom, a rezultati su analizirani korištenjem softvera GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornija, SAD) između tretirane i kontrolne grupe. Svi podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche tubulosa feniletanoidni glikozidi(CTPG)
Rezultati
CTPG-W potiskuje rast Eca-109 ćelija. Komponente CTPG-W su kvalifikovane i kvantifikovane pomoću HPLC (slika 1), koje su upoređene sa standardima ehinakozida i akteozida. Prema vršnim vremenima zadržavanja i površinama pikova, CTPG-W je sadržavao 39,16 posto ehinakozida i 2,44 posto akteozida. Prvo, uticaj CTPG-W na vitalnost Eca-109 ćelija je određen MTT testom. CTPG-W je otopljen u DMSO na 200 mg/ml i razrijeđen sa RPMI-1640 medijumom koji je sadržavao 10 posto toplinom inaktiviranog FBS-a do naznačenih koncentracija. Eca{15}} ćelije su tretirane CTPG-W, a vitalnost ćelija je analizirana MTT testom u naznačenim vremenskim tačkama. Tretman CTPG-W značajno je smanjio vitalnost Eca{17}} ćelija na način ovisan o dozi i vremenu (P<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">
CTPG-W inducira apoptozu u Eca-109 ćelijama. Da bi se istražilo da li je CTPG-W potisnuo rast Eca-109 ćelija putem indukcije apoptoze ili nekroze, ćelije su tretirane različitim koncentracijama CTPG-W. Nakon 24 h, apoptoza i nekroza Eca-109 ćelija su detektovane bojenjem Aneksinom V/PI. Kao što je prikazano na slici 3A, ćelije Aneksina V-/PI plus su zatvorene kao nekrotične ćelije, a Aneksin V plus /PI plus i Aneksin V plus /PI- ćelije su zatvorene kao apoptotičke ćelije. CTPG-W primarno je inducirao apoptozu Eca-109 ćelija na način ovisan o dozi, iako su se nekrotične Eca{12}} ćelije također značajno povećale pod tretmanom 600 i 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">
CTPG-W izaziva zaustavljanje ćelijskog ciklusa u S fazi u Eca-109 ćelijama. Poremećaj ćelijskog ciklusa raka će potisnuti rast ćelija i promovisati apoptozu (27). Distribucija ćelijskog ciklusa u Eca-109 ćelijama je otkrivena PI bojenjem nakon tretmana CTPG-W tokom 24 h. Uočeno je da su se ćelije u S fazi povećale, a da su ćelije u G0/G1 fazama pokazale ukupno značajno smanjenje nakon tretmana CTPG-W (P<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">
CTPG‑W smanjuje Δψm i inducira oslobađanje citokroma c. Apoptoza se može inducirati mitohondrijalno zavisnim putem (28,29). Pro- i anti-apoptotički članovi porodice BCL-2 proteina imaju važnu ulogu u regulaciji integriteta mitohondrijalne membrane (30,31). Nakon tretmana CTPG-W tokom 24 h, Δψm je procijenjen korištenjem bojenja JC-1. JC‑1 agregat (crvena fluorescencija detektirana u FL‑2) će se raspasti u monomer (zelena fluorescencija otkrivena u FL-1) kada se Δψm smanjuje (32). Kao što je prikazano na slici 5A, frekvencije FL-1 plus FL-2-/ plus ćelija su se značajno povećale na način ovisan o dozi, što ukazuje da se Δψm Eca-109 ćelija smanjio. Promjene fluorescencije u Eca-109 ćelijama također su uočene pomoću invertovanog fluorescentnog mikroskopa (slika 5B). Sa povećanjem koncentracija CTPG-W, crvena fluorescencija se smanjila, a zelena povećala, što je u skladu s podacima iz protočne citometrije. Takođe je uočeno da je nivo citokroma c u citosolu značajno povećan (slika 5C), što je rezultat smanjenja Δψm. Ovo potvrđuje zaključak izvučen iz povećanog broja FL-1 plus FL-2-/ plus ćelija da je Δψm smanjen kao rezultat CTPG-W tretmana. Prijavljeno je da JNK može regulisati aktivaciju porodice proteina BCL-2 izazivajući oslobađanje citokroma c (33-35). Takođe je utvrđeno da je nivo JNK značajno povećan nakon tretmana CTPG-W (slika 5C). Rezultati su pokazali da CTPG-W može inducirati apoptozu Eca-109 ćelija putem mitohondrijalnog puta.
Učinak CTPG-W na intracelularno stvaranje ROS. ROS bi mogao smanjiti Δψm kako bi inducirao apoptozu (36). Da bi se istražilo može li CTPG-W povećati proizvodnju ROS, Eca-109 ćelije su tretirane različitim koncentracijama CTPG-W. Ćelije su sakupljene u naznačenim vremenskim tačkama i obojene sa DCFH-DA. Proizvodnja intracelularnih ROS u Eca-109 ćelijama određena je protočnom citometrijom. Kao što je prikazano na slici 6A, 800 µg/ml CTPG-W značajno je povećalo proizvodnju ROS-a od 2-6h i smanjilo sa 12-24 h. Osim toga, 400 µg/ml CTPG-W značajno je povećao proizvodnju ROS-a od 12-24 h. Nadalje, 200 µg/ml CTPG-W nije značajno promijenio proizvodnju ROS. Dinamičke promjene proizvodnje ROS-a mogu biti povezane sa apoptozom Eca{15}} ćelija. Također je utvrđeno da CTPG-W ima aktivnost uklanjanja slobodnih radikala (slika 6B), što može biti povezano sa smanjenom proizvodnjom ROS u Eca-109 ćelijama tretiranim sa 800 µg/ml CTPG-W nakon 12 h.
CTPG-W pojačava aktivnost kaspaze-3, kaspaze-7, kaspaze-9 i PARP. Oslobađanje citokroma c zbog redukcije Δψm moglo bi aktivirati proteaze kaspaze da induciraju apoptozu (29,30,37). Nakon tretmana CTPG-W tokom 24 h, aktivacija kaspaze-3, 7, 8, 9 i PARP otkrivena je Western blot analizom. U poređenju sa kontrolom, nivoi cijepane kaspaze-9, cijepane kaspaze-7, cijepane kaspaze-3 i cijepane-PARP, ali ne i nivoa cijepane kaspaze{{ 20}}, regulisali su CTPG tretman na način koji zavisi od doze (slika 7). Ovi rezultati su pokazali da CTPG-W smanjuje Δψm i potiče oslobađanje citokroma c da aktivira kaspaze koje indukuju apoptozu Eca-109 ćelija.
Ekstrakt Cistanche tubulosa
Diskusija
Tradicionalni CHM može inducirati apoptozu ćelija raka jednjaka kroz različite puteve, uključujući receptore ekstrinzične smrti, intrinzične puteve stresa mitohondrija i endoplazmatskog retikuluma (29). Naša prethodna studija je pokazala da CTPG, kao glavna komponenta C. tubulosa, inhibira rast ćelija melanoma B16-F10 kroz indukciju apoptoze putem mitohondrijalnog puta (24). U ovoj studiji istražen je antitumorski efekat CTPG-W na Eca-109 ćelije i utvrđeno je da CTPG-W potiskuje rast Eca{8}} ćelija, izaziva apoptozu i zaustavljanje ćelijskog ciklusa, smanjen Δψm, povećano oslobađanje citokroma c i aktivirane kaspaze. CTPG i CTPG-W mogu izazvati apoptozu i zaustavljanje ćelijskog ciklusa u ćelijama raka. Međutim, tačni mehanizmi su različiti zbog različitih komponenti CTPG-a (26,64 posto ehinakozida, 10,19 posto akteozida i 1,71 posto izoakteozida) i CTPG-W (39,16 posto ehinakozida i 2,44 posto akteozida). CTPG je zaustavio B16-F10 ćelije u G0/G1 fazama, ali CTPG-W je zaustavio Eca{26}} ćelije u S fazi (24). Proizvodnja ROS-a je dozno-zavisno povećana CTPG-om, ali je ukazivala na promjenu na način ovisan o vremenu visokom dozom CTPG-W, koja se značajno povećala na početku liječenja CTPG-W (2-6 h) i značajno se smanjio nakon 12 h u poređenju sa kontrolom. Mogući razlog je taj što je glavna komponenta CTPG-W ehinakozid. Brojne studije su objavile da ehinakozid može inhibirati proizvodnju ROS-a i apoptozu izazvanu ROS-om kako bi pokazao svoje neuroprotektivne efekte i efekte protiv starenja (38-40). Slično, aktivnost uklanjanja slobodnih radikala je uočena u ovoj studiji. Stoga se spekuliralo da neke komponente, uključujući verbaskozid, izo-verbaskozid i salidrozid u visokoj dozi CTPG-W mogu odmah izazvati stvaranje ROS-a da izazove apoptozu Eca-109 ćelija (41,42), a zatim ROS je uklonjen ehinakozidom. Drugi mogući razlog za razlike u proizvodnji ROS-a od strane CTPG-a i CTPG-W je taj što su u ovoj i prethodnoj studiji korištene različite ćelijske linije (24). Dong i saradnici (43) su izvijestili da ehinakozid može inducirati apoptozu ljudskih ćelija raka debelog crijeva SW480 kroz stvaranje oksidativnih oštećenja DNK bez povećanja nivoa ROS.
Tretman CTPG-W smanjio je Δψm i izazvao oslobađanje citokroma c, koji promoviše cijepanje kaspaze-9 (28). Konzistentno, nivoi cijepane kaspaze-9 su regulirani CTPG-W tretmanom. Nakon toga, aktivna kaspaza-9 može aktivirati kaspazu-3 da izazove apoptozu (44). Nivoi cijepane kaspaze-3 su također regulirani CTPG-W tretmanom. Međutim, kaspaza-8 nije aktivirana od strane CTPG-W, što ukazuje da put ekstrinzičnog receptora smrti nije bio uključen u apoptozu izazvanu CTPG-W. Ova zapažanja ukazuju da CTPG-W inducira apoptozu Eca-109 ćelija kroz aktivaciju mitohondrijalnog puta.
PARP ima važnu ulogu u genomskoj stabilnosti i može se cijepati aktivnim kaspazama, posebno kaspazom-3 i -7 (45). Utvrđeno je da je tretman CTPG-W aktivirao kaspazu-3 i -7, koji mogu cijepati PARP da inhibiraju popravku DNK i uzrokuju apoptozu.
CTPG-W takođe, zavisno od doze i vremena, potiskuje rast ćelija humanog hepatocelularnog karcinoma BEL-7404 (neobjavljeni podaci). Iako CTPG-W inhibira rast Eca-109 i BEL-7404 ćelija, potiče proliferaciju splenocita, što može biti zbog sadržaja polisaharida (~50 posto) u CTPG-W (46 ). Slično tome, brojne studije su izvijestile da polisaharidi mogu promovirati proliferaciju splenocita (46-49). U modelu miša utvrđeno je da CTPG-W značajno povećava indeks slezene, u poređenju s kontrolnom grupom, ali nije utjecao na tjelesnu težinu i indekse ostalih organa uključujući srce, jetru, bubrege i pluća (neobjavljeni podaci), što ukazuje da CTPG-W nema citotoksični efekat na normalne ćelije.
Zbirno, podaci su pokazali da CTPG-W inhibira rast Eca-109 ćelija indukcijom apoptoze putem mitohondrijalno zavisnog puta.
cistanche prednosti: anti-apoptoza
Priznanja
Autori se žele zahvaliti dr. Jianhua Yang (Baylor College of Medicine) za poliranje rukopisa.
Finansiranje
Ova studija je podržana od strane 13. Petogodišnjeg plana za podnošenje ponuda za ključne discipline u oblasti biologije (grant br. 17SDKD0202), Xinjiang Normal University i Ključne laboratorije za primjenu i regulaciju biodiverziteta posebne životne sredine u Xinjiangu (grant br. XJTSWZ-2017-04) JL i Grant Kineske nacionalne fondacije za prirodne nauke (grant br. 31760260) za XW.
Dostupnost podataka i materijala
Podaci i materijali korišteni i analizirani tokom ove studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.
Doprinosi autora
CF, AA, YY i QC su izveli eksperimente. LX, JLv i XW analizirali su podatke i pripremljene brojke. JinyuL i JinyaoL su dizajnirali projekat i napisali rukopis.
Etičko odobrenje i saglasnost za učešće
Sve eksperimente na životinjama odobrio je Komitet za etiku eksperimenata na životinjama Ključne laboratorije za biološke resurse i genetski inženjering u Xinjiangu (odobrenje, br. BRGE-AE001; Univerzitet Xinjiang).
Pristanak pacijenata za objavljivanje
Nije primjenjivo.
Konkurentni interesi
Autori izjavljuju da nemaju suprotstavljene interese.
Reference
Wu CR, Lin HC i Su MH: Preokret vodenimekstrakti Cistanche tubulosaod deficita u ponašanju u modelu štakora nalik Alchajmerovoj bolesti: Relevantnost za taloženje amiloida i funkciju centralnog neurotransmitera. BMC Complement Altern Med 14: 202, 2014.
Li J, Aspire A, Gao L, Huo S, Luo J i Zhang F:Feniletanoidni glikozidi iz Cistanche tubulosainhibira rast B16-F10 ćelija i in vitro i in vivo indukcijom apoptoze putem mitohondrijski zavisnog puta. J Rak 7: 1877-1887, 2016.
Brand-Williams W, Culver ME i Berset C: Upotreba metode slobodnih radikala za procjenu antioksidativne aktivnosti. LWT-Food Sci Technol 28: 25-30, 1995.
