Dio 1: Oligosaharid ljudskog mlijeka 2/-Fukozilaktoza inducira neuroprotekciju od moždanog udara intracerebralnog krvarenja

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Tsai-Wei Hung 1, Kuo-Jen Wu 1, Yu-Syuan Wang 1, Eun-Kyung Bae 1, YoungHa Song 2, JongWon Yoon 2 i Seong-Jin Yu1,*

1Centar za neuropsihijatrijska istraživanja, Nacionalni zdravstveni istraživački instituti, Zhunan 35053, Tajvan;

pilypily@nhri.edu.tw (T.-WH); kjwu@nhri.edu.tw (K.-JW); yswang@nhri.edu.tw (Y.-SW);

baee@nhri.edu.tw (E.-KB)

2Advanced Protein Technologies Corporation, Suwon-si 16229, Koreja; yhsong@aptech.biz (YS);

jongwon.yoon91@gmail.com (JY)

Dopisivanje: b7508@nhri.edu.tw; Tel.: plus 886-37206166 (lok. 36710)

sažetak:

Intracerebralno krvarenje (ICH) nastaje kada moždane krvne žile puknu, uzrokujući upalu i smrt stanica. 2-Fukozilaktoza (2FL), oligosaharid u ljudskom mlijeku, ima snažno antiapoptotičko i protuupalno djelovanje. Svrha ove studije bila je ispitati zaštitni učinak 2FL u ćelijskim i glodarskim modelima ICH. Hemin je dodan primarnom kortikalu štakoraneuronskii kokultura mikroglije BV2 za simulaciju ICH in vitro. Imunoreaktivnost IBA1 i MAP2 korištena je za određivanje upale ineuronskipreživljavanje. Hemin je značajno povećao IBA1, dok je smanjio imunoreaktivnost MAP2. 2FL je značajno antagonizirao oba odgovora. Zaštitni efekat 2FL je zatim ispitan na ICH modelu pacova. Intracerebralna primjena kolagenaze tipa VII smanjila je lokomotornu aktivnost na otvorenom. Rani post-tretman sa 2FL značajno je poboljšao lokomotornu aktivnost. Tkiva mozga su sakupljena za imunohistohemiju i qRT-PCR analizu. 2FL je smanjio imunoreaktivnost IBA1 i CD4 u oštećenom strijatumu. 2FL je smanjio ekspresiju markera ER stresa (PERK i CHOP), dok je pojačao regulaciju markera M2 makrofaga (CD206 i TGF) u oštećenom mozgu. Uzeti zajedno, naši podaci potvrđuju da 2FL ima aneuroprotektivniefekat protiv ICH kroz inhibicijuneuroinflamacijei ER stres. 2FL može imati kliničke implikacije za liječenje ICH.

Ključne riječi: 2-fukozilaktoza; moždani udar intracerebralnog krvarenja; upala; endoplazmatski retikulum

efekti ekstrakta cistanche: liječenje neuro-bolesti

Molimo kliknite ovdje do 2. dijela

1. Uvod

Intracerebralno krvarenje (ICH) je glavnoneurološkiporemećaj povezan s visokim rizikom od smrti kod odraslih [1,2]. ICH čini 10-15 posto svih slučajeva akutnog moždanog udara [3]. Nekoliko epidemioloških studija je podržalo rodne disparitete kod pacijenata sa ICH [4] ili cerebrovaskularnim bolestima [5]. Mali dio pacijenata sa ICH razvije hemoragični lakunarni sindrom [6]. Trenutni tretman za ICH fokusira se na kontrolu krvarenja, uklanjanje krvnog ugruška i smanjenje intrakranijalnog pritiska uzrokovanog krvarenjem. Ne postoji efikasna farmakološka terapija za ICH.

Upala igra ključnu ulogu u ICH izazvanojneurodegeneracija. Nakon pojave ICH, krvne stanice ulaze u moždani parenhim, aktiviraju mikrogliju i iniciraju proizvodnju proupalnih citokina [7,8]. Hemin, nusprodukt hemoglobina, uzrokujeneuronskismrt i izaziva apoptozu i upalu [9,10]. Nekoliko studija je podržalo efikasnost antiinflamatornog tretmana na životinjskim modelima ICH [11,12]. Nedavno smo pokazali da je rana post-tretman antagonistom CXCR4 CX807 inhibirala upalu i poboljšala funkciju ponašanja kod eksperimentalnih ICH štakora [13]. Ovi podaci sugeriraju da protuupalna terapija može smanjiti oštećenje mozga

nakon ICH.

Ljudsko majčino mlijeko sadrži hranjive tvari i nekoliko kritičnih bioaktivnih sastojaka [14], na primjer, oligosaharide ljudskog mlijeka (HMO) [15]. 2′-Fukozilaktoza (2FL) je glavni oligosaharid u ljudskom mlijeku. Oralna isporuka 2FL je poboljšanamemorijai učenje kod pacova [16,17]. Osim toga, 2FL je potisnuo ekspresiju CD14 izazvanu lipopolisaharidom i upalu u ljudskim enterocitima [18]. Nedavno smo izvijestili da je 2FL ublažioneuroinflamacijeu mozgu sa ishemijskim moždanim udarom [19]. Ovi podaci sugeriraju da je 2FL snažno protuupalno sredstvo i stoga može biti koristan za liječenje ICH.

Svrha ove studije bila je ispitati neuralno zaštitno djelovanje 2FL u ćelijskim i životinjskim modelima ICH. Hemin je korišten za simulaciju ICH u ćelijskoj kulturi [20]. Pokazali smo da 2FL antagonizira hemin posredovanu aktivaciju mikroglije. Kolagenaza tipa VII je korištena za stvaranje fokalne ICH kod odraslih pacova [13]. Otkrili smo da je 2FL značajno ublažio ICH-induciranu aktivaciju mikroglije, infiltraciju CD4 plus limfocita i ER stres u oštećenom mozgu i poboljšao funkciju ponašanja. Naši podaci potvrđuju da 2FL ima aneuroprotektivniefekat protiv ICH.

efekti ekstrakta cistanche

2. Rezultati

2.1. 2FL smanjena neurodegeneracija posredovana heminom u primarnim kortikalnim neuronima i kokultura mikroglije BV2

Zaštitni efekat 2FL je prvo ispitan na ćelijskom modelu cerebralnog krvarenja. Primarni kortikalnineuronskii kokulture mikroglije BV2 tretirane su heminom (10 uM) tokom 48 h (vidi vremensku liniju na slici 1E). Hemin oslabljenneuronskimarker MAP2 (Slika 1A), dok je povećao mikroglija marker IBA1 (Slika 1B). Ovi odgovori su bili antagonizovani sa 2FL (1 uM, slika 1A,B). Imunoreaktivnost MAP2 i IBA1 dalje je analizirana mjerenjem gustine piksela specifičnih markera. Kao što se vidi na slici 1C,D, hemin je značajno smanjio MAP2 imunoreaktivnost (Map2-ir) i povećao IBA1-ir (p < 0.00="" 1,="" jednosmjerna="" anova,="" n="6" u="" svakoj="" grupi).="" ove="" odgovore="" je="" značajno="" antagonizirao="" 2fl="" (map2:="" p="">< 0,001,="" f2,="" 14="115.863;" iba1:="" p="">< 0,001,="" f2,="" 15="134.644," jednosmjerna="">

F

Slika 1. Theneuroprotektivniefekat 2FL u primarnom kortikaluneuroni kokultura mikroglije BV2. (A) Reprezentativne fotomikrografije pokazuju da hemin smanjuje imunoreaktivnost MAP2 (-ir). Istodobna primjena sa 2FL je antagonizirala gubitak MAP-ir posredovan heminom. (B) Hemin je povećao IBA1-ir. Zajednička primjena sa 2FL smanjuje IBA1-ir. (C,D) Gustina piksela MAP2-ir ili IBA{10}}ir je analizirana pomoću NIS Elements AR 5.11 softvera. (C) 2FL je značajno antagonizirao gubitak MAP2-ir izazvan heminom. (D) 2FL je značajno oslabio hemin-indukovanu IBA1 aktivnost. (E) Vremenski okvir eksperimenta. * p < 0,05.="" traka="" razmjera="100">

korist ekstrakta cistanche

2.2. Post-tretman sa 2FL poboljšanom lokomotornom aktivnošću kod ICH pacova

Zaštitni efekat 2FL je zatim ispitan na životinjskom modelu ICH. Ukupno 14 odraslih mužjaka pacova stereotaktički je primijenjeno niskom dozom (0.5 jedinica/uL × 1 uL) kolagenaze tipa VII da bi se izazvalo cerebralno krvarenje u desnom strijatumu. 2FL (400 mg/kg/d, ip, n=7) ili vehikulum (fiziološki rastvor, ip, n=7) ​​davan je dnevno tokom 5 dana, počevši od 1 dana nakon moždanog udara (pogledajte vremensku liniju u Slika 2G). Zatim, 2 h nakon posljednje injekcije 2FL ili nosača 5. dana, životinje su pojedinačno stavljene u infracrvene komore za aktivnosti na 30 minuta. Ispitivano je lokomotorno ponašanje na otvorenom 30 min. Otkrili smo da je 2FL značajno povećao vertikalnu aktivnost (VACTV, slika 2A), ukupnu pređenu udaljenost (TOTDIST, slika 2B), vertikalno vrijeme (VTIME, slika 2C), horizontalnu aktivnost (HACTV, slika 2D), vrijeme kretanja (MOVTME, slika 2E ), i broj pokreta (MOVNO, slika 2F). Detaljna statistika (dvosmjerna ANOVA plus post hoc Newman-Keuls (NK) testovi) navedena je u Tabeli 1.

Slika 2. Naknadni tretman sa 2FL poboljšava neuralne funkcije kod ICH štakora. Odrasli pacovi su tretirani kolagenazom tipa VII na D0 (G, vremenska linija). 2FL ili vozilo je davan sistemski dnevno tokom 5 dana. Lokomotorno ponašanje ispitano je na D5. 2FL značajno poboljšana (A) vertikalna aktivnost, (B) ukupna pređena udaljenost, (C) vertikalno vrijeme, (D) horizontalna aktivnost, (E) vrijeme kretanja i (F) kretanje

broj. n {{0}} u svakoj grupi. * p < 0.05,="" dvosmjerna="" anova;="" #="" p="">< 0,05,="" post="" hoc="" nk="">

Tabela 1. Značajne razlike u lokomotornom ponašanju između ICH plus veh i ICH plus 2FL.

2.3. Rani post-tretman sa 2FL smanjenom mikroglijalnom aktivacijom u peri-lezijskoj regiji

Osam ICH štakora (2FL, n=4; Veh, n=4) je eutanazirano i perfuzirano za IBA1 imunohistokemiju nakon testa ponašanja 5. dana. Tipični IBA1-ir je prikazan na slici 3. IBA1-ir je pojačan u peri-lezijskom području u strijatumu (Slika 3B), u poređenju sa odgovarajućim mjestima u kontralateralnom ne-leziranom striatumu (Slika 3A) kod pacova moždanog udara koji su primali veh. Pri velikom povećanju, de-ramificirane ili ameboidne mikroglijalne ćelije pronađene su u području lezije (Slika 3B, umetak), dok su mikroglije u mirovanju koje pokazuju razgranatu morfologiju pronađene u neoštećenom strijatumu (Slika 3A, umetak). Tretman 2FL smanjio je IBA1-ir i djelimično obnovio morfološko grananje mikroglije (slika 3C, umetak). IBA{19}}ir je kvantificiran i prosječen za tri uzastopna dijela mozga sa vizualiziranom prednjom komisurom kod svih životinja. 2FL značajno reducira IBA1-ili u ICH mozgu (slika 3D, p < 0.001,="" f2,12="50.357," jednosmjerna="">

Slika 3. Rani post-tretman 2FL je smanjio mikroglijalnu aktivaciju u leziranom strijatumu. Životinje su primile vehikulum ili 2FL nakon injekcije kolagenaze od 1. do 5. dana. Životinje su žrtvovane 5. dana. Povećana imunoreaktivnost IBA1 sa deramifikovanom morfologijom pronađena je u leziranom strijatumu (B vs. A). Tretman sa 2FL smanjuje imunoreaktivnost IBA (C vs. B). (D) 2FL je značajno smanjio imunoreaktivnost IBA1 u oštećenom mozgu. * p < 0.05,="" jednosmjerni="" anova="" plus="" nk="">

2.4. 2FL ublažava infiltraciju CD4 plus limfocita u oštećene mozgove

Primjena kolagenaze pojačala je infiltraciju CD4 plus limfocita u oštećeni strijatum (slika 4B). Gotovo nikakve CD4 ćelije nisu pronađene u neoštećenom striatumu (slika 4A). Infiltracija CD4 ćelija u oštećeni strijatum je ublažena 2FL tretmanom (slika 4C naspram slike 4B; p < 0.001,="" f2,6="173.485," jednosmjerna="" anova,="" slika="">

Slika 4. Nakon tretmana sa 2FL smanjena je infiltracija CD4 plus limfocita u oštećeni mozak. Reprezentativne fotomikrografije demonstriraju imunoreaktivnost CD4 u (A) neoštećenom striatumu i (B) oštećenom strijatumu od pacova koji prima nosač pri malom (kalibracija=50 um) i velikom uvećanju (umetanje, kalibracija=10 um), kao i (C) oštećeni strijatum od štakora koji je primao 2FL. (D) 2FL značajno smanjen CD{{10}}ir u oštećenom mozgu (* p < 0,001,="">

način ANOVA).

2.5. 2FL je diferencijalno promijenio ekspresiju M1 i M2 inflamatornih markera u ICH mozgu

Strijalna tkiva su sakupljena od osam pacova (veh, n {{0}}; 2FL, n=4) 5. dana. Ekspresija M1/M2 inflamatornih markera je ispitana qRT-PCR. ICH je značajno povećao ekspresiju M1 markera CD86 (Slika 5A, p=0.005) i M2 markera CD206 i TGF (Slika 5B, C, p=0.005). 2FL nije promijenio ekspresiju CD86 (slika 5A, p=0.356, dvosmjerna ANOVA). Međutim, značajno je povećao ekspresiju CD206 (Slika 5B) i TGF na strani lezije (p < 0,05,="" nk="">

korist ekstrakta cistanche

2.6. 2FL je promijenio ekspresiju ER stresa i apoptotičkih markera u ICH mozgu

Ekspresija ER stresa i apoptotičkih markera ispitana je kod osam pacova (veh, n=4; 2FL, n=4). 2FL je značajno smanjio ekspresiju PERK (slika 6A, p=0.016), IRE1 (slika 6B, p=0.018), CHOP (slika 6C, p=0.032) i SigmaR1 (Slika 6D, p=0.017) u oštećenom strijatumu. 2FL nije promijenio ekspresiju BIP (slika 6E, p=0.841) i ATF6 (slika 6F, p=0.403). Pored toga, ekspresija kaspaze3 je značajno smanjena za 2FL (slika 6G, p=0.029, t-test).

Slika 5. 2FL je povećao ekspresiju M2 markera u ICH mozgu. ICH je značajno povećao ekspresiju (A) M1 markera CD86, i M2 markera (B) CD206 i (C) TGF (# p=0.005, dvosmjerno ANOVA). (A) 2FL je značajno povećao ekspresiju (B) CD206 i (C) TGF, ali ne i (A) CD86, u leziranom strijatumu (* p < 0,05,="" nk="">

Slika 6. 2FL je potisnuo ekspresiju ER stresa i apoptotičkih markera. Ekspresiju (A) PERK, (B) IRE1, (C) CHOP, (D) SigmaR1 i (G) kaspaze3 značajno je inhibirao 2FL u hemoragičnim mozgovima. 2FL nije promijenio ekspresiju (E) BIP i (F) ATF6. * p < 0.05.="" er,="" endoplazmatski="" retikulum;="" perk,="" protein="" kinaza="" r-slična="" er="" kinaza;="" ire1,="" enzim="" 1="" koji="" zahtijeva="" inozitol;="" chop,="" homologni="" protein="" za="" protein="" koji="" se="" vezuje="" za="" pojačivač="" ccaat;="" sigmar1,="" sigma="" 1="" receptor;="" atf6,="" aktivirajući="" faktor="" transkripcije="">

cistanche dodatak